Name: ultrathin porated elastic hydrogels as a biomimetic basement membrane for dual cell culture
Uploaded: 2017-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
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저자는 그들의 사려깊은 대화 및 재료 과학 전문 교수 폴 반 술과 교수 Chinedum Osuji 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에 대 한 자금 Dubinsky 새로운 이니셔티브 상 EB16629-01A1 건강 NIBIB BRPR01의 국가 학회에 의해 제공 했다.

재료 안전 데이터 시트 (MSDS)는 이전 하는 모든 자료의 읽어 보시기 바랍니다 사용 하 고 모든 안전 예방 조치를 사용 하 여 시간.
1입니다. 산화 아연 바늘의 합성
<ol>
	<li>0.04 M Zn (3)2의 250 mL 준비 * 물 250 mL에 아연 질 산의 2.9749 g을 추가 하 여 6 H2O 솔루션.</li>
	<li>150ml의 물에 NaOH의 6 g을 추가 하 여 1 M NaOH의 150 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>핫 플레이트 활동가와 미네랄 오일 목욕을 설정 하 고 실 온에서 기름 목욕에 500 mL 둥근 바닥 플라스 크를 잠수함.</li>
	<li>Zn (3)2의 250 mL를 추가 * 6 H2O를 플라스 크 반응 교 반 시작.</li>
	<li>150 mL (흰색 침전 짧게 형성 되며 다음 두 가지 솔루션을 혼합 계속 사라집니다) NaOH 솔루션을 추가 합니다. 2 h 발견에 대 한 저 어입니다.</li>
	<li>55-60 ° C에 플라스 크를 열 고 24 h에 대 한 교 반 계속 합니다.</li>
	<li>끄고 열을 교 반 하면서 실내 온도에 냉각 솔루션을 허용.</li>
	<li>11 µ m 기 공 크기와 Büchner 퍼 널에 솔루션을 필터링 하 고 하룻밤, 발견 건조를 허용 합니다. 필터 종이 더 이상 부 솔루션에서 젖은 백색 분말 깔때기 구멍을 통해 형성 하는 때 입자 완전히 건조 됩니다.</li>
	<li>ZnO 바늘을 수집 하 고 바늘 같은 형태를 확인 하기 위해 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 준비. 간단히, 핀 스텁에 탄소 테이프를 탑재 하 고 금속 주걱을 사용 하 여 탄소 테이프에 ZnO 바늘을 얼룩. 8mm 이리듐 22.4 g/c m3 의 밀도 코트 스퍼터 및 10에서 이미지를 수집 kV.</li>
</ol>
2. HCl에 대 한 현미경 슬라이드에 희생 아연 층의 추가 유도 못의 출시
<ol>
	<li>메탄올의 200 mL에 아연 아세테이트의 1.756 g을 용 해 하 여 아연 아세테이트 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>70% 에탄올과 일회용 지우기 3 "x 1" 일반 현미경 슬라이드를 청소 합니다. 10 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.</li>
	<li>150 m m 유리 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓고 150-160 ° c 예 열</li>
	<li>아연 아세테이트, 슬라이드에 분산 된 박막 형성의 5 방울을 적용 하 여 족집게와 코트 슬라이드 유리 슬라이드를 잡고 유리 피펫으로 피펫으로 전구를 사용 하. 초과 솔루션 다시 재고 솔루션에 물방울을 허용 합니다.</li>
	<li>아연 아세테이트 코팅 면이 미리가 열된 페 트리 접시 (150-160 ° C)에 슬라이드를 놓습니다. 15 분 열판에 남겨 주세요.</li>
	<li>핀셋으로 슬라이드를 제거 하 고 실내 온도에 냉각 수 있습니다. 슬라이드 흰색 줄무늬와 코팅 표시 됩니다.</li>
	<li>저명한 백색 줄무늬를 제거 하는 일회용 지우기를 사용 하 여 슬라이드에 남아 있는 과잉 아연을 제거 합니다. 표면 균일 해야 합니다.</li>
	<li>노출에 UV 준비 슬라이드 무 균을 보장 하기 위해 적어도 1 시간을 위한 biosafety 두건에서 빛. 주의: 자외선 눈에 해 롭 다 고 피부를 노출. 눈 이나 피부에 직접 노출 하지 않도록 하 고 사용 하지 않을 때 전기 공급을 끄십시오.</li>
</ol>
3입니다. 실리콘 절연체의 준비
<ol>
	<li>사각형 보다 작은 1 "x 1" 으로 컷된 실리콘 시트 (절연체 6-잘 접시에 맞게 수 있어야 함).</li>
	<li>생 검 펀치와 함께 사각의 센터에 8-12 m m 구멍을 펀치.</li>
	<li>20 분 동안 고압 실리콘 절연체 121.0 ° C와 1.12 kg/cm.</li>
</ol>
4. 말뚝 솔루션 및 젤 합성 말뚝의 준비
참고: 기능화 및 말뚝의 중 합 되어 광범위 하 게 탐구과 우리의 실험실과 다른 사람에 의해 이전 상세한. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
<ol>
	<li>보 건국 acryloyl-말뚝-50 m m 탄산 (pH 8.5) 아크릴 moiety, 이전 된 생 화 확 적인 반응으로 펩 티 드의 아민 말단의 기능화 수 있도록 1:1 어 금 니 비율에 RGD 셀 접착제 펩 티 드 결합 85% 이상의 효율을 얻을 수이 특징. 17</li>
	<li>2, 2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone 1-비닐-2-pyrrolidone 300 mg/mL의 농도에서 혼합 하 여 사진 시작자를 준비 합니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브를 별도에서 다음 밖으로 무게: ZnO 바늘의 20 mg, 못 다의 12.5 mg 및 말뚝 RGD의 2.5 mg.</li>
	<li>10 %FBS / PBS 솔루션;의 270 µ L에서 ZnO 바늘의 20 mg을 일시 중단 혼합 하는 소용돌이 (약 15 s).</li>
	<li>간단히 (&#60; 1 s) 튜브 베이스에 어떤 ZnO 집계를가지고 벤치탑 미니 원심 분리기에서 솔루션을 회전.</li>
	<li>집계는 튜브의 아래쪽에 유지 되도록 ZnO 솔루션의 상단에서 250 µ L를 수집 합니다. 와 못 다 못 RGD 솔루션을 만드는 못 약 2.5 m m RGD와 결합. 혼합 하는 소용돌이 (약 15 s).</li>
	<li>Acetophenone/n-비닐 pyrrolidone 사진-초기자와 혼합을 짧게 소용돌이의 2 µ L 추가 (약 5 s).</li>
	<li>ZnO 코팅 슬라이드의 중앙에 따라 폴리머 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>ZnO 코팅 얼굴 위에 두 번째 슬라이드를 천천히 낮은 다운 (페그 솔루션 두 ZnO 코팅 층 사이 있어야 함). 어떤 기포의 형성을 방지 하려고 합니다. 어떤 거품 탈출 하 고 얇은 층을 솔루션을 확산 수 있도록 주요 축을 따라 옆으로 슬라이드를 이동 합니다. 폴리머 솔루션 슬라이드의 대부분을 커버. 슬라이드 떨어져 나중 단계에서 끌어올 수 있도록 상단 슬라이드와 약간의 돌출을 만듭니다.</li>
	<li>Crosslink 365 nm UV 램프 (약 10 mW/cm2) 15 분 동안 아래 슬라이드.</li>
</ol>
5. 말뚝의 릴리스 유리 슬라이드에서 젤
<ol>
	<li>돌출 된 슬라이드 및 수동으로 순서에 느린 속도로 떨어져 두 개의 슬라이드 슬라이드를 크래킹 방지 풀에 압력을 적용 됩니다. 적어도 5 분, 건조 또는 하룻밤 젤을 허용 합니다.</li>
	<li>살 균 25 m m 유리 페 트리 접시에에서 슬라이드를 배치 하 고 부드럽게만 충분히 커버 슬라이드 (약 10-20 mL)을 사용 하 여 슬라이드에 1 M HCl 솔루션을 붓는 다. 부드럽게 바위 페 트리 접시; 젤은 HCl에 녹이 고 희생 적인 아연 코팅 및 바늘으로는 슬라이드 해제를 시작 한다. 일단 젤은 슬라이드에서 재고 솔루션으로 다시 HCl를 붓는 다.</li>
	<li>슬라이드와 젤 빠져들 때까지 부드럽게 페 트리 접시에 1 x PBS의 약 25 mL를 붓는 의해 젤 린스.</li></ol>신중 하 게 PBS에서 폐기물 용기에 붓는 다.
	<li>부드럽게 붓고 약 25 mL 1 x PBS의 페 트리 접시까지 젤 솔루션에 떠.</li>
	<li>젤 아래 실리콘 아이 솔 레이 터를 밀어 신중 하 게 핀셋을 사용 하 고 그것에 젤을 들어.</li>
	<li>6-잘 접시 가득 살 균 1 x PBS에는 아이 솔 레이 터와 젤을 전송.</li>
	<li>젤의 모든 슬라이드에서 제거 하 고 PBS에 몸을 담글 때까지이 과정을 반복 합니다. 무 균을 보장 하기 위해 적어도 1 시간을 위한 biosafety 두건에서 자외선에 준비 된 젤을 노출 합니다.</li>

6. 시드 셀 Bilayers
<ol>
	<li>시드의 A549 세포를 준비 합니다. 간단히, 1 x PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크를 씻어, 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 2-3 분 동안 앉아 보자<ol>
		<li>기계적으로 플라스 크를 선동, 끄다 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스와 3 mL Dulbecco의 수정이 글 매체 반응 고 15 mL 원뿔 플라스 크에 수집 합니다. 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 미디어의 추가 4 mL와 린스와 동일한 원추형으로 수집. 475 x g 6 분에 세포를 스핀.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>셀 아래로 회전 하는 동안 6 잘 플레이트의 각 음에 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간의 작은 방울을 추가 합니다. 새로운 6 잘 플레이트에는 젤과 실리콘 절연체를 전송 족집게를 사용 하 여 젤 미디어 방울에 휴식 하는. 이제는 젤 얇은 층으로 확산은, 눈에 보이는 큰 구멍을 확인 합니다. 이 셀 건조와 젤의 크래킹을 피하기 위해 시드 전에 즉시 행해져야 한다.</li>
	<li>10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 6 x 105 셀/mL의 농도에서 Dulbecco의 수정이 글 중간에 셀 resuspend 추가 셀 서 스 펜 션 드롭 젤, 실리콘 막의 밖으로 구멍을 뚫은 영역에서 초승달 모양 유지 하의 중심에는 것이 현명 합니다. 4 h에 대 한 준수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>4 h 후 잘 Dulbecco의 수정이 글 완전 한 매체의 0.5 mL을 추가 하 고 완전 한 접착을 위해 수 있도록 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>다음 날, 셀 시드를 위한 HUVECs를 준비 합니다.<ol>
		<li>1 X PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크를 씻어, 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 2-3 분 동안 앉아 보자</li>
		<li>기계적으로 플라스 크를 선동, 담금질 3 mL 20% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스와 1% 성장 보충 M199 미디어와 함께 반응 고 15 mL 원뿔로 수집 합니다.</li>
		<li>M199 완전 한 미디어의 4 mL와 린스와 동일한 원추형으로 수집. 475 x g 6 분에 세포를 스핀.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>셀 아래로 회전 하는 동안 각 잘 새 6 잘 플레이트에에 완전 한 매체 199의 작은 방울을 추가 합니다. 실리콘의 센터에 있는 미디어의 드롭 잘에서 새로운 실리콘 아이 솔 레이 터를 놓습니다.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 신중 하 게 새로운 6 잘 플레이트에 못 젤은 아이 솔 레이 터에 A549 세포를 지 원하는 실리콘 아이 솔 레이 터를 플립.</li>
	<li>6 x 105 셀/mL의 농도에서 HUVECs를 resuspend 하 고 현명 하 고, 실리콘 막의 밖으로 구멍을 뚫은 영역 내에서 젤에 초승달 모양 유지 하려고 뒤집힌된 젤 드롭의 중심에 세포 현 탁 액을 추가 합니다. 2 시간에 대 한 준수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>2 시간 후 부드럽게 각 우물에 M199 완전 한 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>
7입니다. 면역 형광 검사
<ol>
	<li>조심 스럽게 수동 피 펫과 젤에서 미디어를 제거 하 고 셀 시드는 젤의 센터에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 약 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자. 주의: PFA는 독성 화학; 보호를 착용 하 고 처리는 생물 안전 캐비닛에서 수행 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 제거는 PFA 고 각 젤을 PBS에 2 %BSA 대략 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 1 h 동안 앉아 보자.</li>
	<li>BSA는 조심 스럽게 제거 합니다. PBS에 2 %BSA 1: 100 희석에서 1 차 항 체를 준비 하 고 각 젤을 500 µ L를 추가. 실 온에서 1 h 동안 앉아 보자. 1 x PBS의 500 µ L 부드럽게 린스 합니다.<ol>
		<li>2 차 항 체와 동일한 프로세스를 반복 합니다. 항 체에 따라 사용: 1) 반대로 인간 CD144 (VE-Cadherin) 클론 16B1; 2) 안티 인간 CD324 (E-Cadherin) 클론 6714; 3) 안티 인간 CD31 (PECAM-1) 복제 C-20; 4) 안티-A549; 5) 반대로 마우스 FITC; 6) 알 렉 사 Fluor 647 항 염소입니다. F-말라를 시각화 하려면 500 µ L Phalloidin의 추가 (PBS에 10 µ g/mL) 20 분.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>조심 스럽게 2 차 항 체 또는 phalloidin를 제거 하 고 500 µ L DAPI의 추가 (0.1 µ g/mL) 20 분에 대 한 신중 하 게 DAPI 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 1 x PBS의 1.5 mL를 추가 각 잘 젤에에서는.<ol>
		<li>족집게와 실리콘 절연체를 사용 하 여, 유리 슬라이드에 한 젤을 전송 합니다. 이미징, 직전 각 젤에 대 한이 작업을 수행 하 고 영상 후 PBS 솔루션으로 젤을 바꿉니다.</li>
		<li>또는 젤 DAPI 설치 매체를 사용 하 여 탑재 합니다. 잘 매니큐어와 샘플 인감, 건조 하 고 젤의 균열을 방지 하기 위해 2 일 이내에 이미지를 수집. 문제 해결 표 1을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

여기서 설명 하는 프로토콜을 가변 PEG 하이드로 겔 biomimetic BM 비 계 역할을 만들 수 있다. 특히, 다양 한 PEG 분자 무게 펩 티 드 활용 전략, 그리고 산화 아연 미정 질 구조 또는 농도, 탄성 계수, 생 화 확 적인 속성과 hydrogels의 다공성 구조 수정할 수 있습니다, 각각. Ultrathin 못 비 계는 높은 기 공 밀도 더 많은 기능을 vivo에서 지 세포 막 투과성 지원 모델 (표 2)에 비해 발견의 모방은 작은 기 공 직경을 갖추고 있습니다. 또한,이 방법을 통해 우리 20 µ m의 평균 두께 ultrathin 구조를 달성 했다. 폴 리 카보 네이트 침투성 지원 모델 이미 우리의 지식, 10 µ m의 ultrathin 레이어를 달성 하는 동안 이것은이 두께 달성 하기 위해 첫 번째 부동성 및 가변 하이드로 겔 시스템. 마지막으로, 페그 hydrogels 이다 크기 순서 보다 적게 전통적인 침투성 지원, 조직 문화, 플라스틱과 유리, 모든 평점 범위에서에서 탄성 계수는 그리고 그러므로 더 보다 뻣 뻣 한 대략 100 kPa의 탄성 계수는 낮은 비교 (&#60; 10 kPa) vivo에서 세포 외 매트릭스 (표 2)의 탄성 계수.
낮은 탄성 계수를 달성 여기, 작품의 주요 목표 중 하나 이며 전통적인 폴 리 카보 네이트의 사용에 한계가 침투성 지원 모델. 그것은 잘 알려진 기판 강성 셀 동작을 지시할 수 및 작업 기판 강성 분화 세포의 세포 운명 가이드 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 12 뻣 뻣 한 기판은 또한 일반적으로 질병 상태, 거리 조직이 나 암 종양을 포함 하 여 모방 하는 데 사용 됩니다 및 따라서 없습니다 정확 하 게 건강 한 조직의 대표. 18 , 19 , 20 , 21 위해서는 무부하 셀룰러 고기 및 기능 연구, 그것은 관련 vivo에서탄성 계수를 모방 하는 기질을 사용 하 여 중요 한. 이 시스템의 주요 장점 중 하나는 다른 분자 무게와 말뚝을 사용 하 여 달성 될 수 있는 젤의 메커니즘을 조정 하는 기능입니다. 많은 질병은 ECM 스티프닝와 관련,이 시스템에는 세포 기능에 병 BM 대 건강의 효과 공부 biomimetic 플랫폼을 제공 합니다. 이 시스템의 추가 수정 또한 펩 티 드 조각이 세포 접착에 대 한 포함을 변경 하 여 얻을 수 있습니다. 이 연구의 목적을 위해 RGD 회사 셀 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 많은 BM 단백질 및 그것의 기능에서 그 유비 쿼터 스 식으로 사용 되었다. RGD, 뿐만 아니라 laminin 조각 또한 꼭대기 기저 셀 분극 가이드 laminin 상피 상호 작용 촉진을 통합할 수 있습니다. 1 질병에 BM 강성 변경 처럼 지하실 멤브레인의 구성은 리 모델링 병 적인 조건에서. 아민 반응 못 보 건국 전조를 사용 하 여 다양 한 펩 티 드 및 단백질 못 고분자 기지에 단백 결합 가능 하다. 11 , 14 , 15 이 integrin 참여 다른 integrin 수용 체에 대 한 효과 조사를 위해 특히 유리 하다. 예를 들어 RGD 시퀀스 fibronectin과 콜라겐에 표현 되는 여러 integrins 종사 하지만 integrin αvβ3에 대 한 높은 특이성을가지고. 신 aspartic 산 valine (LDV) 시퀀스 통합 될 수을 특별히 모방 fibronectin 풍부한 기판, 종사 하는 α4β1, 또는 collagenous 멤브레인을 모방, aspartic 산 글리신 글루타민 산-알라닌 (DGEA) integrin 교전에 추가 될 수 Α2Β1입니다. 8
상피 내 피 bilayers는 여기에 제시 하는 모델을 만들 수 있는 셀룰러 bilayer의 한 예입니다. 자연스럽 게 비보에, 얇은 BM 또는 ECM, 구분 존재 하는 다른 bilayers pericyte 내 피와 내 피 부드러운 근육 세포 bilayers 포함 됩니다. 따라서,이 방법에 대 한 응용 프로그램은 광범위 하 고 혈관 생물학 폐 의학에서 확장. 또한, 이러한 hydrogels의 독특한 다공성, 때문에 그들은 이전 히드로 모델 지원 되지 않은 기능 연구를 기능을 제공 합니다. Ultrathin 하이드로 겔 시스템에 숨 구멍을 통합 하 여 우리가 만든 침투성 지원 모델에 대 한 향상 된 생체 모방 교체는 폐에서 흔한 세균성 침투의 조사 활성화 결핵에 상피 내 피 장벽 했다입니다. 3 , 6 , 14 , 22 마찬가지로, 환생 또는 혈관 세포 배양에서 염증 세포의 chemotaxis 수 조사 이전 표시 되었습니다로 젤의 RGD 기능성된 세포 접착 표면에 셀 캡처의 속도 측정 하 여. 16 이것은 캡슐화를 통해 공동 문화 조건 달성 이전 히드로 기반 방법에 비해 뚜렷한 이점을 이다. 이러한 시스템 근접을 허용 하 고-셀 두 셀 형식 간의 연락 및 신생 vasculogenesis, 등의 기능을 측정 하는 데 성공 하지만 액세스를 많이 제공 하는 2 차원 시스템에서 제공 부족 공동 경작된 세포 장벽을 가로질러 누출, 침투, 또는 활성 마이그레이션을 측정 하기 위한 간단한 플랫폼. 17
따라서, 여기 설명 하는 방법을 여러 분야에 걸쳐 다양 한 연구에 대 한 플랫폼을 제공 하며 더욱 vivo에서 병 리를 이해 하 에 체 외 연구에서 더 많은 관련 데이터 생성으로 디딤돌 그리고 기계 장치입니다.

세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질 건설 기계 셀 첨부 파일을 지 원하는 다른 세포 유형 사이 방 벽으로 봉사 하 고 복잡 한 조직 및 장기의 필수 구성 요소를 확인 합니다. 간 질 성 결합 조직, 달리 지하실 멤브레인 (BM) 다른 조직 구획 분할 하는 장벽 역할 ECM의 특수 유형입니다. BMs 약 100 µ m 두께, 그리고 따라서 양쪽에 셀 사이의 직접 및 간접 통신에 대 한 허용. BMs의 두 가지 일반적인 예 혈관 BMs, pericytes 및 내 피 세포 사이의 microvascular 벽에서 발견 되며 내 피 및 상피 세포 사이 발견 되는 기도 BMs. BMs는 건강과 질병, 세포 극성 및 마이그레이션 등 세포 기능 조절에 중요 한 역할을 제공 합니다. 1 구성, 강성, 건축, 및 BMs의 다공성 고유한 생리 기능을 촉진 하기 위하여 기관 시스템 간에 다릅니다. 예를 들어 BM 모 셀 통신, 수용 성 분자 확산, 유지 하 고 감염 시 염증 또는 박테리아 면역 세포의 마이그레이션에 대 한 중요 하다. 항공에 모 공 0.75에서 3.86 µ m.2 까지 직경 BM의 전체 두께 걸쳐
BM의 얇은 자연 세포 유형 물리적으로 서로에서 분리 되어, 비록 세포 통신 신호 paracrine 및 연락처 중재를 통해 유지 되는 보장 합니다. 따라서, 생체 외에서, 인간 질병 연구에 연구원 문화 셀룰러 bilayers에 다공성 침투성 지원 삽입에 의존 했습니다. 3 이러한 모델 건강과 질병에 있는 역할 셀룰러 통신을 이해 하기 위한 중요 한 되었습니다. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 침투성 지원 삽입 어떻게 백혈구 신규 모집 및 세균 침투; 등의 생리 적 프로세스 조절-셀 신호를 이해 하기 위한 기본 요건을 충족 그러나, 삽입 중요 한 제한이 고 인간 BM. Permeable 지원 모방 하지 삽입 기계 및 생 화 확 적인 tunability 부족과 단순한 다공성 구조를 불규칙 한 숨 구멍을 만드는 섬유 구조를 모방 하지 않습니다 BMs의 전형. 따라서, 세포 프로세스를 영향을 미치는 기본 BM 속성을 다시 만들 수 있는 가변 시스템에 대 한 필요성이 있다.
폴리머 기반 기판 biomimetic 셀룰러 bilayers 맥락을 더 밀접 하 게 비보에 환경에서 공부 하는 BMs의 개발을 위한 이상적인 후보자 이다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 중합체는 기계적으로 가변 및 화학적 통합 biomimetic 펩 티 드 파편. 을 수정할 수 있습니다. 11 , 12 , 13 bioinert 폴리머 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) biomimetic BMs를 만드는 데 사용할 수 있습니다 및 최근 작품 자세한 기계적으로 가변 못 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 젤 세포 성장을 지 원하는 다공성 네트워크와의 합성 그리고 염증 성 세포 chemotaxis입니다. 14 못 기반 출판 침투성 지원 보다는 인간의 ECM의 보다 현실적인 모델을 제공 하는 기판, 이러한 모델의 대부분은 매우 셀 셀 bilayer 문화를 만들 수 있는 능력을 제한 하는 대략 775 µ m의 깊이와 두께 연락처입니다. 14
여기, 우리는 못 폴리머 기반 BM 모방 많은 현재 셀 bilayer 문화 기술의 한계를 극복 하는의 창조에 대 한 프로토콜을 제시. 고분자 합성 및 가교은 이후에 선택적으로에서 제거 하는 동안에 산화 아연, 미정 질 생산의 제조에 광범위 하 게 사용 된 자료를 통합 하는 템플릿 방법 개발 했습니다는 결과 대량 중합체입니다. 이 프로세스는 인간의 BMs의 꼬불꼬불한 고 상호 공 네트워크를 흉내 낸 임의의 다공성 네트워크를 생성 합니다. 또한,는 다공성 바늘 생산 동안 반응 산출할의 수정을 통해 산화 아연 microcrystals의 형태와 크기를 변경 하 여 변경할 수 있습니다. 여기에 개발 된 기술은 인간 BM.을 마지막으로, 역학, 다공성, 두께 모방한 ultrathin 히드로 만들고 이러한 BM 비슷한 구조의 생 화 확 적인 구성 쉽게 대부분은 microenvironment를 생성 하기 위해 변경 될 수 있습니다. 비슷한 그 본 vivo에서.

<table><tbody><tr><td>1M Hydrogel Chloride (HCl)</td><td>EMD</td><td>HX0603-75 2.5L</td><td>Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133 500 mL</td><td>None</td></tr><tr><td>Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228737-500g</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Macron Chemicals</td><td>278408-500g</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Zinc Acetate Dihydrate ((CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Zn&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;bull;2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45180010 1 kg</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Methanol (CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;OH)</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-05 4L</td><td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS&amp;nbsp;</td><td>PLD-B280B</td><td>None</td></tr><tr><td>Round bottom flask</td><td>ChemGlass</td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stir bar</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Plain precleaned microscope slides 3&quot;x1&quot;x1&quot; mm thick</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td>Spray with ethanol and let dry prior to use.</td></tr><tr><td>Glass pasteur pipets</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>1 mL rubber bulbs</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Plastic 100 mm petri dishes</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sterile forceps</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Silicone isolators</td><td></td><td></td><td>0.8 mm thick</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) punches</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Glass bottles</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>Cellstar</td><td>657 160</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Stirrer-hot plate</td><td>VWR Dya-Dual</td><td>12620-970</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;COC(OCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24650-42-8</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>1-Vinyl-2-pyrrolidone (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;NO)</td><td>Aldrich</td><td></td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;10,000&lt;/sub&gt;OH)</td><td>Fluka</td><td>81280-1kg</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>RGDS</td><td>Life Tein</td><td>180190</td><td>Use with eye protection and gloves.</td></tr><tr><td>Blak-Ray long wave UV lamp</td><td>UVP</td><td>Model B 100AP</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

ultrathin porated elastic hydrogels as a biomimetic basement membrane for dual cell culture

지하실 막 강성, 구성, 건축, 그리고 다공성과 다양 한 세포질 bilayers의 중요 한 구성 요소입니다. 상피 내 피 bilayers의 학문 생체 외에서 전통적으로 bilayer 문화를 활성화 하는 침투성 지원 모델에 의존 해야 하지만 투과 지원 인간의 지하실 막의 다양성을 복제 하는 기능에 제한 됩니다. 반면, 화학 합성을 해야 하는 하이드로 겔 모델 높은 가락 고 소재 강성 및 biomimetic 펩 티 드 또는 단백질의 결합을 통해 생 화 확 적인 구성의 수정에 대 한 허용 한다. 그러나, 그들은 모 셀 연락처 및 마이그레이션 연구 기능 생체 외에서 부족 하기 때문에 전통적인 히드로 모델 기능에 제한 됩니다. 또한, 전통적인 hydrogels 두께 때문 hydrogels의 전체 두께 걸쳐 있는 숨 구멍의 설립이 되었습니다 도전. 현재 연구 사용 하 여 poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels와 소설 아연 산화물 템플릿 메서드 biomimetic hydrogels의 이전 단점을 해결 하기 위해. 그 결과, 선물이 ultrathin, 지하실 멤브레인 같은 히드로 가변 기 공 구조, 기계적 특성, 및 생 화 확 적인 구성 사용자 정의 발판에 confluent 셀룰러 bilayers의 문화입니다.

못 RGD hydrogels 사이 2 개의 희생 아연 산화물 층 사이 폴리머 솔루션 및 산화 아연 바늘 기 공 템플릿 만들기 형성 되었다. 희생 아연 산화물 구성 요소는 염 산, 지속적인 모 (그림 1)와 ultrathin 못 hydrogels 생성 다음 제거 되었습니다. 산화 아연 바늘의 형태는 전자 현미경 (SEM), 검색 하 여 확인 되었다 고 평균 길이 너비 각각 3.92 ± 0.089 µ m 및 0.43 ± 0.02 µ m, 되도록 결정 되었다 (그림 2A-2B). 산화 아연 바늘의 제거에 따라 하이드로 겔 모 공 SEM으로 시각화 했다 하 고 (그림 2C-2E) 특징. 평균 기 공 밀도 hydrogels 176,863 ± 49,532 숨 구멍 이었다. SEM은 시각화 하 고 표준 3 µ m 기 공 폴 리 카보 네이트 침투성 지원 삽입의 기 공 밀도 계산 및 기 공 밀도 평방 m (그림 2D, m 당 약 2.51 ± 0.05 모와 크게 낮은 것으로 판명 되었습니다. 표 2)입니다. 아연 산화물은 템플릿 못 히드로 0.19 ± 0.01 µ m, 고 투과성 지원 삽입 (그림 2E, 표 2)에서 관찰 3.47 0.21 ± µ m 모 공 보다 크게 작은에서 평균 기 공 직경. 광학 일관성 단층 촬영 두 2 및 3 차원 이미지와 hydrogels 1 x PBS (그림 3A-3B)에서 부동의 두께 결정 하기 위해 사용 되었다. 평균 젤 두께 18.89 ± 3.47 µ m (표 2) 이었다. 젤 역학 또한 앞에서 설명한, 탄성 계수를 측정 하 여 평가 했다 그리고 평균 탄성 계수 96.78 ± 23.92 kPa (표 2) 발견 되었다. 14
면역 형광 검사 현미경 검사 법 내 피 세포 및 상피 세포 ultrathin 못 RGD hydrogels에 경작 되 고 이후 그들의 phenotypic 정체성 유지 하는 방법을 보여 줍니다. 내 피 세포 유지 안티 A549 항 체 (그림 4A-4B)와 긍정적으로 얼룩이 진 PECAM-1, 그리고 상피 세포의 표현. 두 셀 형식 또한 꽉 접합을 형성 하는 기능을 유지. 내 피 세포-셀 접합에서 VE cadherin 표현 되 고 상피 세포 표현 E-cadherin (그림 4C-4 D). 또한 말뚝 RGD hydrogels 셀룰러 bilayers 지원과 양식 샘플 (그림 4E) 스테인드 phalloidin의 immunofluorescent 영상에 의해 검증 된 다공성 구조 내에 셀 연락처에 대 한 허용.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56384/56384fig1.jpg"> 
그림 1 . 하이드로 겔 준비 프로토콜의 개요 개요입니다. A) 합성 및 ZnO 바늘의 컬렉션. B) 유리 슬라이드;의 준비 희생 ZnO 층의 창조입니다. C) 준비 및 실리콘 절연체의 살 균. D) 말뚝 준비 솔루션 ZnO 바늘. E) ZnO 코팅 유리 슬라이드 사이 젤 말뚝의 합. 화이트 라인 희생 ZnO 바늘 및 코팅을 나타냅니다. F) 바늘의 제거 및 슬라이드에서 젤의 릴리스 HCl 린스. 어두운 줄 모를 녹은 ZnO 바늘에 의해 만들어진 나타냅니다. G) 전송을 젤 및 실리콘 절연체의 6-잘 접시 셀 시드를 위한 준비. H) 셀 시드. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56384/56384fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56384/56384fig2.jpg"> 
그림 2 . 바늘 특성화 및 히드로 다공성 아연. A) 아연 바늘 (눈금 막대 5 µ m)의 SEM 이미지. B) 의 길이 그리고 폭 아연 바늘. 점 대표 개별 바늘;에 대 한 측정 선은 평균 및 표준 오류를 나타냅니다. C) 다공성 하이드로 겔 (눈금 막대 2 미크론)의 SEM 이미지. D) 기 공 밀도 E) 폴 리 카보 네이트 침투성 지원 및 말뚝 hydrogels 평균 기 공 직경. 바 평균 및 표준 오류를 나타냅니다. p &#60; 0.0001 T-검정을 통해. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56384/56384fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56384/56384fig3.jpg"> 
그림 3 . 하이드로 겔 두께입니다. 광학 일관성의 Tomography 보여 줍니다 A) 3 차원 및 B) hydrogels PBS에 부동의 2 차원 이미지. 화살표 나타냅니다 액체 표면, 별표 나타냅니다 하이드로 겔. 눈금 막대는 100 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56384/56384fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56384/56384fig4.jpg"> 
그림 4 . Hydrogels 지원 단층 및 Bilayer 문화. 둘 다 내 피 세포 및 상피 세포 못 hydrogels에 confluent monolayers 형성 수 있다 형광 염색에 의해 증명으로 A) CD31 (CD31 빨간색, DAPI 블루)와 B) A549 (A549 레드, 블루 DAPI), 각각. 그대로 cadherin 접합부의 형성에 대 한 시연 C) 내 피 세포 (VE cadherin 녹색, 파란색 DAPI)와 D) (스케일 바 100 미크론) 상피 세포 (E cadherin 녹색, 파란색 DAPI). E) bilayers 세포의 두 가지 예 phalloidin (phalloidin 빨간색, 파란색 DAPI) 얼룩 (규모 바 10 µ m)에 의해 증명 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56384/56384fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>문제</td>
			<td>잠재적인 솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>젤 큰 구멍이 있다.</td>
			<td>아연 바늘 그들을 사용 하기 전에 충분히 세분화 되어 있는지 확인 합니다.</td></tr></tbody></table>그것은 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 그들을 헤어 도움이 될 수도. 빠른 스핀 희석 FBS에 정지 다음으로 큰 집계 제거 되었는지 확인 합니다.
		
		<tr>
			<td>젤은 셀 시드 후 6 잘 플레이트의 하단에 갇혀 있다.</td>
			<td>시드를 위한 6 잘 플레이트에 전송 하기 전에 젤 아래 미디어의 한 방울을 추가 합니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>젤 상단 및 실리콘 아이 솔 레이 터의 하단 음 이다.</td>
			<td>더 이상 젤에 대 한 어떤 초과 젤 셀 시드할 수 센터에만 층을 실리콘 아이 솔 레이 터 주위 랩.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>셀 레이어는 젤에서 갑자기.</td>
			<td>셀-합칠 수 있습니다. 낮은 밀도에서 씨입니다. 아주 모든 린스 단계 조심. 또한 세포 접착을 향상 시키는 펩 티 드 농도 높일 수 있습니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>셀 매우 빠르게 확산 됩니다 그리고 합류에 도달 하지 것입니다.</td>
			<td>있도록 합류 근처 시드 시 높은 밀도에서 셀 씨.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>젤 강성 예상 보다 높은 수준 이다입니다.</td>
			<td>젤 HCl에 유지 되는 시간을 줄입니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>젤 두께 예상 보다 높은 수준 이다입니다.</td>
			<td>어떤 ZnO 집계는 슬라이드 부드러운 되도록 못 젤을 주조 하기 전에 유리 슬라이드에서 전 멸 다는 것을 확인 하십시오. 슬라이드를 더 못 솔루션 확산 주요 축을 따라 이동 합니다.</td>
		</tr>
	

표 1입니다. 문제 해결을 위한 솔루션을 제안 했다.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>하이드로 겔</td>
			<td>Transwell</td>
			<td>세포 외 기질</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>기 공 밀도 (모 공/m m2)</td>
			<td>105 ± 4.9 x 104 x 1.77</td>
			<td>2.51 ± 0.05</td>
			<td>8.50 x 102 7.0 x 104 2,14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>기 공 직경 (µ m)</td>
			<td>0.19 ± 0.01</td>
			<td>3.47 ± 0.21</td>
			<td>0.47 3.86 2,14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>두께 (µ m)</td>
			<td>18.89 ± 3.47</td>
			<td>10</td>
			<td>0.05 0.10 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>영의 계수 (kPa) 5</td>
			<td>96.78 ± 23.92</td>
			<td>&#62; 1000</td>
			<td>3.5 14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2입니다. 하이드로 겔 속성 표준 침투성 지원 삽입 및 기질을의 비교 (값 의미를 나타내는 ± 표준 오차)

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Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.7K 조회수.  Yale University. 현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

<meta charset="utf8"></head><body>Vessels-on-a-Plate를 사용한 신속한 혈관 네트워크 제작을 위한 3D 바이오프린팅

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in coronary arteries and impaired function of the blood-brain barrier. Existing fabrication techniques do not adequately replicate the geometrical variation in vascular networks in the human body, which substantially influences disease progression; moreover, these techniques often involve multi-step fabrication procedures that hinder the high-throughput production necessary for pharmacological testing. This paper presents a bioprinting protocol for creating multiple vascular tissues with desired patterns and sizes directly on standard six-well plates, overcoming existing resolution and productivity challenges in bioprinting technology. A simplified fabrication approach was established to construct six hollow, perfusable channels within a hydrogel, which were subsequently lined with human umbilical vein endothelial cells to form a functional and mature endothelium. The computer-controlled nature of 3D bioprinting ensures high reproducibility and requires fewer manual fabrication steps than traditional methods. This highlights VOP's potential as an efficient high-throughput platform for modeling vascular permeability and advancing drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: High-Throughput Vascular Model Fabrication을 위한 자동 바이오프린팅

We present a protocol for high-throughput production of vascular channels with flexible sizes and desired patterns on a standard six-well plate using 3D bioprinting technology, referred to as vessels-on-a-plate (VOP). This platform has the potential to advance the development of therapeutics for the disorders associated with compromised endothelium.

크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

요약

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기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

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3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법

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