저자는 절개와 문화를 DRG 그들의 전문 지식을 공유하기위한 교수 앤서니 Windebank의 실험실 감사의 마음을뿐만 아니라, DMD 설치에 관한 도움이 토론에 대한 교수 Shaochen 첸 것입니다. 이 연구는 리젠트의 ​​루이지애나위원회 툴란 대학 및 보조금에 의해 일부 자금했다 (LEQSF [2009-10] - RD - A - 18)와 NIH (NS065374).

1. DMD 설정 <ol><li> DMD 보드, UV 라이트 가이드 (콜리 메 이터) 및 4X 객관적인 렌즈는 모두 진동 절연 테이블에 수직으로 장착하고 있습니다. </li><li> 자외선 가이드는 빛을 45 ° 거울, 그리고 24 ° 거울의 비행기 아래 (그림 1)의 비행기에 상대의 각도로 거울 배열에 도달할 수 있도록 조정해야합니다. </li><li> 목적 렌즈는 객관적인 렌즈로 치과에서 거리는 렌즈와 관련된 초점 거리에 해당 있도록 탑재합니다. </li><li> 거꾸로 현미경은 DMD에서 반사되는 빛을 초점 현미경을 통해 시각 수 등 객관적인 렌즈, 아래 배치됩니다. 중합 표면에 목적 렌즈의 거리는 약 렌즈의 작동 거리에 해당한다. 현미경의 단계는 다음 가늘게 이미지에 초점이 거리를 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 거리는 선택된 표면 중합에 따라 달라질 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 Explant 문화를위한 듀얼 히드로겔 구성 A. DRG의 explant 부착 <ol><li> 코팅 멤브레인 자체를 피하기 위해 돌보는 비 - X 6 개 - 잘 콜라겐 코팅 세포 배양 삽입 (코닝)의 벽. (또는 소수성 장벽 펜을 사용할 수 있습니다.) </li><li> 37 ° C와 5% CO 2 배양기에서 접착 매체의 1.5 ML과 하루 수화물 삽입합니다. 접착 매체 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.5mM L - 글루타민, 20 μg / ML의 NGF와 neurobasal 매체입니다. </li><li> E - 15 쥐 새끼에서 수확 배아 등의 루트 신경 (DRG). DRG는 많은 사와 같은 삽입 당, 콜라겐 코팅 6 잘 삽입에 도금해야합니다. </li><li> 멤브레인 준수를 DRG 수 있도록 2 시간 삽입을 품어. </li></ol> B. 동적 마스크 photopolymerization 디지털 micromirror 장치 (DMD)는 선택 거울 위치에 따라 조명을 반영 프로젝션 텔레비전에서와 유사한 개별 거울,의 1024 X 768 배열입니다. 우리의 목적을 위해, DMD는 간단하고 신속한 방법으로 specifiable 히드로겔 형상을 만들고, photocrosslinkable hydrogels에 패턴 자외선 (UV) 조명하는 데 사용됩니다. 그림 1은 DMD와 자외선 경로의 설정을 묘사. 저희 DMD는 독립 실행형 장치 임에도 불구하고, 장치는 또한 여러 기존의 현미경과 함께 사용하기 위해 통합될 수 있습니다. <ol><li> 삽입의 모든 여분 액체를 제거하고 삽입 내부 중합 매체 500 μL를 추가합니다. 중합 매체는 10 % PEG (MW 1000) 및 20 μg / ML NGF와 1 %의 펜 / Strep와 보충 neurobasal 중간에 녹아있는 0.5 % Irgacure 2959이 포함되어 있습니다. </li><li> 비 - X 취급 유리 슬라이드에있는 치과 기기 아래에 삽입을 놓으십시오. </li><li> 포함된 알프 - 3 기본적인 GUI 프로그램의 사용을 통해, DMD에 &quot;photomask&quot;로 사용할 수있는 적절한 흑백 이미지를로드합니다. 우리 목적을 위해서도 bifurcating 형상 neurite지도 시스템의 구현에 대한 수 있도록 선정되었습니다. </li><li> 시각화를위한 거꾸로 현미경을 사용하여 DMD를 반영 가시 광원을 사용하여 photomask에 적절한 위치와 조직 explants을 맞춥니다. </li><li> UV 광원에 대​​한 가시 광원을 전환하고 crosslinking 충분한 때까지 PEG 솔루션을 조명. 삽입의 네 가지 DRG에 대한 (주어진 및 5.0 왓츠 / DMD에 cm이 사건은, crosslinking이 같은 작은 55으로 초 완료 수있는 조건.) 반복합니다. </li><li> 무균 DPBS, 1 % 펜 - Strep 각 삽입 세 번 씻으십시오. </li><li> 세포 배양 삽입 아래 1.5mL 성장 매체를 추가하고 30 분 동안 인큐베이터에서 평형 수 있습니다. 성장 매체는 2 % B - 27, 1 %의 펜 / Strep, 0.5mM L - 글루타민은, 20 μg / ML NGF가 포함된 neurobasal 매체입니다. </li></ol> C. 보조 히드로겔 Puramatrix <ol><li> 의 연결을 응용 프로그램의 경우 1 %의 Puramatrix는 무균 H 2 O에서 0.15 %로 제조 업체의 지시에 따라 희석는 1 μg / ML 용해 laminin과 보완. </li><li> 모든 초과하는 미디어는 멸균 솜 팁 작은 주걱, Kimwipe 또는 micropipette을 사용하여 DRG explants를 포함 PEG의 공백에서 제거해야합니다. </li><li> Puramatrix가 넘쳐없이 빈 공간을 채우기 위해 micropipette와 PEG의 공백에 추가됩니다. 무효 볼륨에 따라 일반적으로 1 μL를 만들마다 사용됩니다 ~. </li><li> Puramatrix가 생리적 소금 용액과 접촉 즉시 자기 조립 과정을 시작, 부풀어 PEG 즉,하지만 성장 매체의 1.5 ML는 총 겔화을 보장하기 위해 삽입 아래에 추가 한 시간 동안 인큐베이터에 배치됩니다. </li><li> 처음 Puramatrix가 약산성이므로 산도가 평형 수 있도록 한 시간 후에 미디어를 변경합니다. </li><li> 미디어 변경은 대략 매 48시간 필요합니다. 모든 미디어는 것을주의하십시오기계 약한 Puramatrix의 무결성을 보호하기 위해, 아래에 삽입 말했다. </li></ol> 아가로 오스 <ol><li> 의 연결을 응용 프로그램에 대한, 아가로 오스는 성장 매체에 1 %의 솔루션 희석되고 아가로 오스는 완전히 (~ 1 시간)까지 녹이고 60 ° C의 물을 욕조에 배치. 솔루션은 다음 1 μg / ML 용해 laminin과 보충합니다. </li><li> 모든 초과 미디어는 PEG의 공백을 제거합니다. </li><li> 아가로 오스는 넘쳐없이 빈 공간을 채우기 위해 PEG의 공백에 추가됩니다. 무효의 볼륨에 따라 일반적으로 1 μL를 만들마다 사용됩니다 ~. </li><li> 성장 매체의 1.5 ML은 6 잘 플레이트 (8 ° C) 미리 차게하고, 아가로 오스가 들어있는 삽입을하는 아가로 오스를 허용하도록 냉각 매체로 전송하고 적어도 3 분 8 ° C에서 냉장고에 유지 젤. </li><li> 마지막으로, 삽입은 미리 예열 성장 매체의 1.5 ML (37 ° C)로 전송 37에서 인큐베이터에 유지됩니다마다 48 시간 필요한 미디어의 변화와 함께 ° C. </li></ol> 3. 듀얼 히드로겔 3D 셀 캡슐화 어떤 자기 조립 젤을 사용하면 듀얼 히드로겔 캡슐이 적합합니다. photocrosslinkable 젤이 경우 PEG에서 예를 Puramatrix 또는 아가로 오스 들어, 자기 조립 젤의 기하 프레 젠 테이션에 대해 구조적 지원 역할을합니다. 방법 중 일부, 특히 photomask의 젤과 선택의 유형은 특정 원하는 응용 프로그램에 따라 달라집니다. <ol><li> DMD에 적절한 마스크를로드합니다. 우리의 응용 프로그램, 세포 생존을 위해, 우리는 단순히 세포의 이미징에 투입 Puramatrix의 원통형 프레 젠 테이션을 선택했습니다. 세포 신호를 공부 연구자 chemotactic 분자의 확산 있도록 compartmental 기하학에 관심이 있으실 것으로 생각됩니다. 또한 동맥의 대략 근사치는 혈관 연구하는 것이 가능 응용 프로그램을 상징하는 표시했다. </li><li> 비 - X 코팅 슬라이드에 DMD 아래 폴리 에스테르 세포 배양 비 - X로 삽입하고, 장소의 벽을 취급. </li><li> 삽입 중합 매체 500 μL를 추가합니다. 55초에 대한 자외선에 노출에 의해 PEG의 crosslinking을 유도. </li><li> 무균 DPBS, 1 % 펜 - Strep로 세 번 씻으십시오. </li><li> PEG의 공백에서 모든 여분의 미디어를 제거합니다. </li><li> 펠렛에 원하는 농도에서 세포를 스핀 다운. 케어는 Puramatrix은 소금 용액과 접촉 즉시 자기 조립을 시작으로, 전에 혼합하기 위해 세포 펠렛에서 모든 미디어를 제거로 이동합니다. 무균 H 2 O로 희석 0.15 %의 Puramatrix 내부의 세포를 중지 10 %의 자당과 보충. </li><li> PEG의 공백 내부 Puramatrix / 셀 / 자당 혼합물을 주입. </li><li> 삽입 아래 성장 매체의 1.5 ML를 추가, 한 시간 동안 인큐베이터 안에서 젤 수 있습니다. </li><li> 일시간 후 미디어를 변경하고 이후 매 48 시간 ~. </li></ol> 4. 싱글 히드로겔 3D 셀 캡슐화 단일 히드로겔 캡슐은 세포가 photocrosslinkable 히드로겔 내부 검사 수있는 모든 상황에 맞는 것입니다. <ol><li> DMD에 적절한 마스크를로드합니다. 세포 생존 연구, 우리는 다시 실린더를 나타내는 기본적인 원형 마스크를 선택했습니다. 방법 4에 표시된 것과 유사한 마스크는 다시 해당 연구 분야에 대한 적용 수 있습니다. </li><li> 비 - X 코팅 슬라이드에 DMD 아래 폴리 에스테르 세포 배양 비 - X로 삽입하고, 장소를 취급. </li><li> 어떤 원하는 농도에서 세포는 동질적인 유통을 위해 잘 혼합, 10 % PEG 솔루션에 직접 추가할 수 있습니다. </li><li> 삽입 중합 매체 500 μL를 추가합니다. 55초에 대한 자외선에 노출에 의해 PEG의 crosslinking을 유도. </li><li> 무균 DPBS, 1 % 펜 - Strep로 세 번 씻으십시오. </li><li> 매 ~ 이일 변화, 아래와 삽입 위에 두 성장 매체로 채웁니다. </li></ol> 5. 박막 히드로겔 중합 <ol><li> DMD에 적절한 마스크를로드합니다. </li><li> 비 - X 코팅 슬라이드에 콜라겐 - 코팅 폴리 에스테르 세포 배양 비 - X로 삽입하고, 장소를 취급. </li><li> 그냥 삽입 (6 웰 플레이트에 삽입을위한 ~ 250-300 μL)의 하단을 충당하기 위해 충분한 중합 매체를 추가합니다. 미디어가 실온에서 30-45분에 대한 삽입 막에 침투 수 있습니다. </li><li> micropipette 또는 Kimwipe와 삽입의 초과 중합 매체를 제거합니다. 완전히 삽입의 바닥을 커버하기 위해 UV - 투명 오일 충분한 양의를 추가합니다. 삽입 중합 매체 포화 삽입 막 위에 서로 다른 계층을 형성하는 기름 오랫동안, 상온에서 15~30분 위해 앉아 수 있습니다. </li><li> DMD 아래 삽입하고 슬라이드를 놓습니다. 자외선에 노출에 의해 PEG의 crosslinking을 유도. 때문에 PEG 층의 두께의 crosslinking은 치과에서 5.0 왓츠 / cm 2 사건에서와 같은 작은 15 초 완성하실 수 있습니다. </li><li&gt; 무균 DPBS, 1 % 펜 - Strep로 삽입을 세 번 씻으십시오. (기름 찌꺼기의 지속성이 우려있다면, 그러한 트윈 20 (1 %)로 약한 세제는 세척 버퍼에 추가할 수 있습니다.) </li><li> 6 잘 조직 배양 플레이트에 삽입을 저장합니다. 원하는 농도에 일시 중지 세포 성장 매체를 추가하고 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 세포 배양 삽입 내부의 세포 현탁액의 충분한 볼륨을 피펫. 그런 다음, 완전히 세포 생존 (~ 1.5 ML)를 유지하기 위해 삽입 아래의 충분한 성장 매체를 추가합니다. </li><li> 48 시간 경과 후에는 모든 unadhered 세포를 이동시키다하는 살균 DPBS 1 %의 펜 - Strep로 삽입을 세 번 씻으십시오. 대략 매 48시간 한 미디어를 변경합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 듀얼 히드로겔의 예로는 DRG explants를 포함하는 것은 그림 2에 표시됩니다 구조. 셀룰러 마이 그 레이션 및 neurite 확장이 세포 허용 듀얼 히드로겔 지역의 건설로 제한됩니다 것을 확인할 수 있습니다. 그림 3은 듀얼 히드로겔 구조 내부 마찬가지로 캡슐 dissociated 세포를 묘사. DMD의 photomask의 동적 특성으로 인해 캡슐에 사용할 수있는 도형은 광학의 크기와 해상도에 의해 제한됩니다. 셀 캡슐 하나의 photopolymerizable 히드로겔, PEG 안에 수도 있었고, 죽은 / 라이브 생존 능력 시험은 그림 4 입증 수행되었다. PEG의 캡슐화는 PEG는 신경 세포에 이상적인 환경을 대표하지 않는 등, 단 예로위한 것입니다. 따라서, 우리 PEG 구조의 실현 세포 생존은 당연하게도 낮습니다. 마지막으로, 세포 배양 삽입에서 세포 유착에 대한 패턴 제한 레이어 얇은 PEG 필름을 활용의 예는 그림 5에 표시됩니다. 또한, 가능 &quot;나쁜&quot;결과의 예는 그림 6에서 제공됩니다. 그 결과 우리가 실험실에서 개발된 방법의 가능한 사용의 작은 파편만이 나타냅니다. 그들은 쉽게, 다재 다능한 우리의 접근의 가능성을 입증하기위한 있으며, 연구자들이 자신의 가능성 adaptations을 개발하는 &quot;원칙의 증거&quot;로 취급 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 석판술에 사용되는 빛의 경로의 도식 그림. 삽입된 페이지 : 자외선은 45 °와 미러 배열의 비행기 아래에 24 °의 각도로 치과를 조명. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 이중 히드로겔 구조를 포함하는 DRG가 표시 성장 및 확산. 베타 III의 tubulin (녹색), DAPI 스테인드 세포 핵 (파란색)으로 표시 neurites과 polymerized PEG 구조 (회색)을 portraying AD) 이미지. DRG explants는 Puramatrix에 포함되어 분기점 (들)을 향해 성장 neurites과 패턴의 원형 지역에 위치하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 성장 매체 48 시간 후 calcein AM, 라이브 세포 마커와 레이블 세포를 포함하는 이중 히드로겔 구조. AD) dissociated DRG의 신경을 ​​(~ 5x10 3 셀 / ML)이있는 Puramatrix 가득한 다양한 PEG 모양. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 단일 히드로겔이 (5x10 3 셀 / ML) 성장 매체 24 시간 후에 ethidium homodimer - 1 (빨간색)으로 표시 Calcein AM (녹색)와 죽은 세포와 레이블 라이브 세포를 포함하는 개념입니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 셀 제한 PEG 선택적으로 투과 지원의 콜라겐 코팅 멤브레인에 dissociated 세포를 준수하는 &quot;테스트 패턴&quot;을 사용하여 박막으로 polymerized. 죽은 세포가 ethidium homodimer - 1 (빨간색)으로 표시하는 동안 A, B) 라이브 세포는 Calcein AM (녹색) 48 시간 후에 표시됩니다. 최소 세포 접착은 얇은 PEG 필름을 포함하는 지역에서 발생합니다. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. 바람직하지 결과의 대표 이미지를 표시합니다. A) 사용할 수 없게 PEG로 이어지는 PEG의 부분 중합은 개념입니다. 부적 절한 중합은 사전 폴리머 매체 중합 매체의 부족 금액, 부족 자외선 노출이나 광학의 부적 절한 초점에 초승달 모양의 존재로 인해 발생할 수 있습니다. B) 베타 III의 tubulin (녹색), DAPI 스테인드 세포 핵 (파란색)으로 표시 neurites과 polymerized PEG 구조 (회색)을 portraying 이미지. neurites는 패턴 PEG 채널 이외의 성장 수있었습니다. 이것은 종종 조건에서 발생되는 주입하는 동안 PEG 부분 위에 Puramatrix가 넘치 거든.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 설명되어있는 방법은 간단하고 재현성 세포 배양 시스템을 추구하는 탐정에 의해 사용될 수 있습니다. 이론적으로 가능한 photopolymerizable hydrogels의 다양한 때문에, 환경은 전체 조직 explants 포함한 모든 세포 유형과 함께 사용할 수 있도록 맞춤 수 있습니다. 또한, 듀얼 히드로겔 시스템은 자신에 비정질 형태를 형성하는 경향이 자기 ​​polymerizing hydrogels의 프레 젠 테이션에 개선 공간적 제어를위한 수 있습니다. 그 결과 &quot;2.5D&quot;micropatterned의 히드로겔 구조 편리 미세한 평가 수있는 2D 구성에서 제시 신경 성장을위한 3D 매트릭스를 제공합니다. 젤이 polymerized하고있는 기판은 또한 실험적인 디자인의 큰 제어를위한 수 있도록 다양한 수 있습니다. 우리의 방법은 우리가 유리 슬라이드 (데이터가 표시되지 않음)에서 중합에 비해 향상된 생존 능력 (그림 4)을 볼 수 있으므로, 세포 배양 투과의 지원과 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 그러나, 다른 중합 표면은 다른 응용 프로그램에 대한 자세한 적용 수 있습니다 유리 제조 예를 들어, microfluidics 실험이나 세포 집계 형성에 사용 슬라이드. 이러한 문화 시스템과 우리의 경험은 어려움의 잠재적인 영역의 식별하게되었다. 첫째,주의 방법은 구성의 불임을 유지하기 위해 필요합니다. DMD 설치의 부피가 큰 특성으로 인해, 그것은 무균 조건 하에서 중합 단계를 작동하기가 어렵습니다. 이 문제를 방지하려면 방법에서 설명한 헹굼 단계에서 도움이되며, 항생제는 모든 미디어에 사용해야합니다. 또한, polymerized 구조의 최종 두께와 모양은 사전 폴리머 혼합물의 유동적인 행동에 크게 의존하고, 초승달 모양의 존재는 (그림 6) 너무 얇은 또는 불완전 polymerized 아르 겔 구성이 발생할 수 있습니다. 두 단계는 세포 배양 삽입 내부 초승달 모양의 형성을 최소화하기 위해 취할 수 있습니다. 두꺼운 hydrogels (&gt; 200 μm의) 삽입의 내부 벽 주위에 비가 X의 단순 코팅 충분하십시오. 그러나, 같이 간단히 얇은 구조 (&lt;200 μm의)을 위해, 위에서 설명한, 기름 층이 모두 초승달 모양을 최소화하고 자유 라디칼 중합의 산소 담금질을 깨뜨릴 필요합니다. 해상도가 점점 두꺼운 젤로 실현 기능의 크기 감소와 함께, 두께에 좌우 되는것 발견되었습니다. 해상도는 또한 기능은 히드로겔에 긍정적이거나 부정적인 구제를 표현 여부에 따라 다양. 그러나, 우리는 광학을 집중로만 현미경 목표를 사용하여 ~ 100 μm의 규모에 대한 최소한의 기능 크기와 구조에 대한 충분한 해상도를 달성했습니다. 우리의 실험은 여기에서 설명한 이중 히드로겔 구조가 neurite 성장과지도의 기본에 - 체외 모델의 형성을위한 훌륭한 기초를 대표하는 것으로 나타났습니다. 고용 micropatterning 기술은 기존의 방법 18,19의 적응이지만, 우리의 세트 업 디자인을 구현하는 간단한을 강조하고 세포 배양 삽입에 듀얼 히드로겔 구성 생산에 최적화된되었다; 세포 배양 삽입뿐만 아니라 세포 생존을 향상 줬어요 이전 자기편 조직 explants 주변 crosslinking로. 표시된 결과의 범위는 우리 연구소의 이익에 의해 제한되지만, 우리는이 책자에서 설명하는 방법 3D 세포 배양의 제조에 대해 상대적으로 싸고, 빠르고 사용하기 쉬운 방법을 찾고 연구에 유용하게 될 것입니다 모델.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

점점, 패턴의 세포 배양 환경은 세포 특성을 연구하기위한 관련 기술되고 있으며, 많은 연구자들은 더 나은 1-3 생체내 특성의 모방 체외 실험에서 나타내는 3 차원 환경을 필요로 믿습니다. 이러한 암 연구 4, 신경 공학 5, 심장 생리학 6 및 세포 - 매트릭스 7,8 상호 작용과 같은 분야의 연구는 세포의 행동은 전통적인 monolayer 문화 및 3D 구조 사이에 크게 차이가 나타났습니다. Hydrogels 때문에 그들의 다양한 다재 다능한 및 9-12 작용화 통해 맞게 분자 구성 능력의 3D 환경으로 사용됩니다. 수많은 기법 electrospinning 13 엘라스토머 우표를 포함하여 14 셀 - 지원 매트릭스로 구성 창조를 위해 존재하는, 잉크젯 인쇄 15, 첨가제 photopatterning 16, 정적 photomask 프로젝션 리소그래피 - 17과 동적 마스크 microstereolithography 18. 불행히도, 이러한 방법은 여러 생산 단계 및 / 또는 기존의 세포 및 조직 배양 방법에 쉽게 적응하지 장비를 포함하고 있습니다. 이 프로토콜에 채용된 기술은 UV 시작한 자유 라디칼 중합을 통해 유도된 crosslinking 기하학적으로 구체적인 쓰임새 (에틸렌 글리콜) (PEG) hydrogels에 대한 동적 photomasks을 생성하기 위해 디지털 micromirror 장치 (DMD)를 사용하여, 후자의 두 가지 방법을 적응. 그 결과 &quot;2.5D&quot;구조는 신경 성장을위한 제한된 3D 환경을 제공합니다. 우리는 PEG는 Puramatrix 또는 아가로 오스 중 하나에서 만들어진 달리 못생긴하지만 휴대 허용 자체 조립 젤로 휴대 제한 지역 공급 구조 역할을하는 듀얼 히드로겔 접근 방식을 사용합니다. 이 과정은 기존의 세포 배양 방법 및 기판와 함께 사용하기위한 높은 재현성 쉽게 적응하는 빠르고 간단한 한 단계의 제조이다. 이러한 배아 등의 루트 신경 (DRG)로 전체 조직 explants는, 같은 neurite 가지로 실험 assays를위한 듀얼 히드로겔 구성에 포함될 수 있습니다. 또한, dissociated 세포는 photocrosslinkable 또는 자체 polymerizing 히드로겔에 캡슐이 될 수도 있고, 선택 셀 제한 photopatterning를 사용하여 투과 지원 막을 준수. DMD를 사용하여, 우리는 히드로겔 두께 ~ 1mm까지 구성하지만, 박막은 (&lt;200 μm의) PEG 구조가 자유 라디칼 중합 반응의 산소 담금질에 의해 제한되었다 만들었습니다. 우리는 이후 얇은 PEG 구조 중합을 허용 중합 액체 위에 기름 층을 활용하는 기술을 개발했습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 microfabricated 신경 세포와 조직 문화의 생산을위한 3D 히드로겔 시스템의 급속한 생성을 설명합니다. 시연 듀얼 히드로겔 구조 언급된 세포 생존, 마이 그 레이션 및 / 또는 neurite 성장과지도를 포함한 신경 과학의 연구에 유용 될 수 있습니다 체외 모델에서 다목적 나타냅니다. 또한, 프로토콜 hydrogels 및 세포의 여러 유형에 대해 작업할 수 있듯이, 잠재적인 응용 프로그램은 다양하고 광대한 모두 있습니다.

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.6K 조회수.  Tulane University. 간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

측정을위한 소형 이중 요소 스트레인 게이지의 제조 및 주입<em&gt; 생체</em&gt; 설치류에서 위장 수축.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

유 전적으로 변형 된 세포 이식을위한 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 세포를 향해 유전자 형질

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

포토 리소그래피에 의해 고분자 미세 바늘 어레이 제작

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

미세 패턴 혈관 근육 박막의 확장 문화 미세 유체 Genipin 증착 기술

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...