Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

저자는 세인트 주입;에 대 한 상담에 감사 Tongalp Tezel, 메릴랜드, 테레사 Swayne, 박사, SHG 현미경;에 관한 상담 그리고 디자인 및 생물 통계학 리소스 및 컬럼비아 대학 의료 센터에서 어 빙 연구소의 Biostatistical 핵심 시설에서 지미 둥.
실명 방지 연구에 의해 및 국가 연구소의 건강 보조금 NCRR UL1RR024156, 네이 P30 EY019007, NCI P30 CA013696, 그리고 네이 R01EY020495 (DCP)에 의해 부분에서 지원. 관련된 지적 재산권을 소유 하는 컬럼비아 대학: 발행 하는 미국 특허 아니오: 8,466,203,: 9,125,856. 국제 특허 출원: PCT/US2015/020276.
이미지는 Confocal에 수집 및 전문 현미경 공유 리소스 컬럼비아 대학, NIH에서 지원에서 허버트 어 빙 종합 암 센터의 #P30 CA013696를 부여 (국립 암 연구소). Confocal 현미경 NIH 함께 구매 #S10 RR025686를 부여.

모든 절차는 그대로 outbred 토끼 머리에서 싱가포르로 토끼 눈을 사용 하 여 수행 되었다. 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 모든 기관 및 국가 지침 따라 했다.
1입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>서울시 의회에 대 한 준비:<ol>
<li>나트륨 중 탄산염 솔루션 (NaHCO3) 솔루션 NaHCO3 파우더는 증류수의 1 mL에 용 해의 0.0165 g를 사용 하 여 0.2 M 농도의 1 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>800 mM SMG의 최종 농도를 증류수의 1 mL에 가루 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시)의 0.1016 mg을 디졸브. 나트륨 중 탄산염 해결책 0.1 M NaHCO3 및 400 mM SMG의 최종 농도를 조정 합니다. 원하는 상호 효과 따라 서울시의 농도. 여기에 설명 된 프로토콜에서 우리 사용 40, 100, 400 mM 서울시.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. subTenon의 주입 SMG를 사용 하 여 의회에 대 한
<ol><li>400 µ L 제어와 SMG 솔루션 두 1 mL 인슐린 주사기 (바늘 25 G)를 각각 작성.</li>
	<li>쿠션의 도움으로 프로 파일 평면에서 토끼의 머리를 배치. 스티로폼 또는 종이 스택 최적의 위치에 머리를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>소아 안과 검 경으로 눈 꺼 풀을 철회.</li>
	<li>초기 안구 내부 압력 (IOP) applanation tonometry 장치를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>조직 표시와 함께 limbus의 상단 중간 부분에 의도 된 주사의 사이트를 표시 합니다.</li>
	<li>철회 conjunctival 집게 (또는 톱니 모양의 라운드 팁으로 어떤 겸)과 주사의 사이트를 둘러싼 결 막 및 결 막, 입력 표시 limbal 사이트 (즉, 2-3 단지 약간 넘어 장부의 캡슐을 통해 바늘을 삽입 m m는 limbus에서)입니다. 결 막에 작은 절 개를 통해 장부의 캡슐 바늘의 통과 촉진 하기 위해 아이리스가 위로 만들 수 있습니다.</li>
	<li>한 번 장부의 캡슐 내에서 바늘은 그것에 게 사이드-투-사이드를 이동 하 여 자유롭게 모바일 있는지 확인 합니다. 이 기간 동안, 전 세계 이동 하지 한다. 하위-장부의 (sT)에서 sclera 위에 바늘의 적절 한 배치를 확인 하는이 공간.</li>
	<li>주사기에서 솔루션을 삽입 하 고 바늘을 삭제. 즉시 다음 주입, 액체 결 (즉, chemosis)을 통해 본 앞쪽 볼록한 만드는 sT 공간에 축적 됩니다.</li>
	<li>그것은 세계의 실수로 구멍 뚫 기 때문에 변경 되지 않았다 확인 IOP 측정을 반복 합니다.</li>
	<li>뚜껑 금속을 제거 하 고 약 2-3 분 동안 닫힌된 눈 꺼 풀을 통해 디지털 마사지를 수행 합니다.</li>
	<li>3.5 h의 잠복기에 대 한 머리를 두고 (실내 온도 18 ° C =), 다음 단계로 이동 하기 전에.</li>
</ol>3. 조직 준비
<ol><li>세계에 대 한 액세스를 최적화 하기 위해 눈 꺼 풀 검 경을 사용 하 여 눈 꺼 풀을 철회. 눈의 크기에 따라 최적으로 크기의 금속을 선택 합니다.</li>
	<li>분리는 limbus를 둘러싼 결. 이미 사출 사이트 근처 베인 되었습니다, 원주 확장 테두리 약 1 x 1 cm의 inoculum 크기를 포함 하는 것 그래서.</li>
	<li>Scleral 삽입의 자신의 사이트에 여분의 눈 근육을 잘라.</li>
	<li>안구 후부 측면에서 추진 하는 집게와 함께 상승 합니다. 이 사후 세계에 대 한 액세스를 제공 하 고 안과 동맥 및 정 맥 부근 세계의 후부 극 시 신경의 절단을 촉진 한다.</li>
	<li>잘라는 corneoscleral 복잡 한, 표시 된 주사 사이트를 포함 하 여 외부 테두리와 함께. 얼룩은 여전히는 공 막의 나머지 부분에 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>코 퍼스 vitreus 및 조직 집게와 견인을 적용 하 여는 공 막의 안쪽에 연결 된 모든 레이어를 제거 합니다. 참고: 추가 단계는 수행 중인 다음 절차에 따라 달라 집니다.: 4.-DSC 분석, 5.-SHG 현미경 검사 법.</li>
</ol>4. 지역 DSC 분석을 위해
<ol><li>
치료 눈: 4 scleral 분야에서에서 잘라 나머지 scleral 컵은가 위 주사의 사이트 상단 부문에 있으며 중앙 정렬 있도록. 잘라 모두 측면 (즉, 비 강 및 임시), 측면과 하단에서 남은 3 분야. 참고: 그림 1A에 시연은 (1-4) 사각형 (1-16)으로 더 분할 되는 섹터의 번호 매기기.</li>
	<li>약 4 x 4 mm 각의 작은 사각형 (1-16)에 scleral 분야 (1-4) 잘라. 섹터 1 9 사각형 (개별 사각 [스퀘어 2] 주입의 정확한 사이트 확인)으로 나눌 수 합니다. 2 및 3 2 사각형으로 (정사각형 10-11, 12-13) 분야 및 부문 4 3 사각형 (사각형 14-16)으로 나눕니다.</li>
	<li>주입 영역의 위치에서 분석 된 조직의 거리를 지역화 하려면 그림 1A와 같이 각 사각형에 숫자를 할당 합니다.</li>
	<li>
제어 눈: 후 다음 위치에서 조직의 사각형 조각을 잘라 4 scleral 섹터 (치료 조직에 유사한)에 나누어 조직: 3 사각형 상위 섹터 (섹터 1)에서 각 측 (분야 2, 3), 그리고 1에서 1는 하단 부문 (부문 4)입니다.</li>
	<li>나머지 망막과 안 층 떨어져 긁 고 씻어 두 번 신선한 PBS 각 시간 약 10 솔루션에 잠긴 조각을 떠나 한 번에 s.</li>
</ol>5. 대 한 SHG 이미징
<ol><li>가 위를 사용 하 여 중앙 정렬 하는 주입의 사이트는 1 x 1 cm 영역을 만들려면 sclera의 상단 부분을 잘라.</li>
	<li>나머지 망막 및 맥락 막 층 떨어져 긁 고 씻어 두 번 신선한 PBS 약 10 솔루션에서 조각을 떠날 때마다 s.</li>
	<li>장소 1 mL 튜브에 조직 이미징 시설에 수송을 위한 PBS 솔루션으로 가득합니다. 모든 절차, 보육 시간에 따라 안구의 해 부 시작 1 시간 내에서 수행 되어야 합니다.</li>
</ol>6. 현미경 검사 법 프로토콜
참고: 이미지 다시 흩어져 SHG 신호 sclera 조직의 콜라겐에서이 프로토콜은 레이저 현미경 검사에 대 한 지어진 다.
<ol><li>
현미경 검사 법 설정
	<ol>
<li>최대화 하기 위해 신호 및 해상도 렌즈를 사용 하 여 수행 SHG 현미경 빛과 높은 수 가늠 구멍 (NA)와 적외선 전송 최적화. 우리의 목표는 니콘 Apo LWD 25 x / NA1.1 물 침수.</li>
		<li>Coverslip 0.17 밀리미터의 두께이 경우에 샘플의 깊이 맞게 렌즈의 교정 칼라를 조정 합니다.</li>
		<li>25 x 객관적 렌즈를 탑재 하 고 윤 활 샘플을 탑재 하기 전에 이미지 표면 커버를 수성 젤의 관대 한 금액을 추가 합니다. 물 기반 젤 실험 기간 동안 증발 하지 것입니다 하 고 따라서 이미지 품질을 유지 합니다.</li>
		<li>episclera와 coverslip 표면 사이 두 개의 25 m m 라운드 coverslips (episcleral 면이 아래로) 제공 최대한 접촉 사이 건조 하지 않고 PBS 1 mL 튜브에서 scleral 조직을 놓습니다. 참고: 조직의 수 또한 발견에 놓일는 coverslip. PBS의 좋은 금액 이미징 동안 수 화 된 조직을 유지 한다. 이 경우에 cellchamber를 조립 후 조직 조각과 PBS 추가 합니다.</li>
		<li>25 m m 라운드 coverslip, 단일 배치 또는 챔버의 하단 부분에는 샌드위치 기법에 셀 챔버를 조립 하 고 챔버 라운드는 봉인 만들려면 아래로 상단 부분을 나사. 밀접 하 게 사용 될 때 최고 coverslip, 인위적으로 병합을 방지 하 고 조직을 손상 아래로 나사 하지 않습니다.</li>
		<li>현미경 단계에서 조직 샘플 셀 챔버를 탑재.</li>
		<li>에 전송 빛 눈 보기에 대 한 현미경을 설정 합니다.</li>
		<li>무대를 놓고는 샘플의 낮은 표면에 초점, 눈 조각을 통해 밝은 분야 검사에 의해 결정 되는 목표의 높이 조정 합니다.</li>
		<li>컴퓨터 모니터를 제외 하 고 모든 조명을 끄고 알루미늄 호 일 시트 현미경 스테이지에 draped 가능한 모니터에서 많은 빛을 차단. 길 잃은 빛 감지기에 도달 최소화 GaAsP NDD 검출기는 높은 감도 저 잡음 수집, 지킬 것 이다.</li>
		<li>소프트웨어의 Ti 패드 패널에서 렌즈 정의가 올바른지 확인 하십시오.</li>
		<li>A1 소형 GUI 패널 이미징에 대 한 IR 레이저를 선택 하 고 NDD 검출기 선택 DAPI 채널 400-450 nm 대역 통과 필터를 장착을 선택 합니다.</li>
		<li>A 1 MP GUI 패널에서 설정 적외선 레이저의 파장 860 및 오픈 셔터.</li>
		<li>레이저 스캐닝 A1 소형 GUI 패널에서 다음과 같이 설정 합니다. 선택: (a) Galvano 스캐너, (b) 단방향 검색, (c) 픽셀 망설임 시간 6.2 µs, (d) 프레임 크기 1024 x 1024 픽셀, (e) 선 평균 2 배 참고: Galvano 스캐너 및 단방향 검색 하면 정확한 포인트에 의해 정렬. 보기의 전체 필드에 대 한 1024 x 1024의 크기는 0.5 μ m /pixel의 픽셀 크기를 변환합니다. 선 평균 이미지에서 총된 소음을 줄일 것 이다.</li>
		<li>레이저 파워 및 검출기 이득을 조정 하 여 A1 소형 GUI 패널에서 이미지를 설정 합니다. 현재 이미지에서 픽셀 휘도 값의 막대 그래프를 표시 하는 테이블을 보고 패널 (Lut)을 엽니다. "찾기" 모드로 라이브 이미징 켜고 레이저 파워 및 검출기 이득을 조정 하 여 픽셀 값의 감지 범위를 극대화. 채도를 하지 마십시오. 일반적인 값은 2.5% 레이저 전원, 2.35 W 860에서의 총에서 및 100 HV (검출기 이득).</li>
		<li>참고:이 설정에 대 한 내부 전원 측정기로 측정 레이저 파워는 5.2 mW. 실험 수행 때마다 다시 조정 레이저 비율 같은 내부 전력 측정은 5.2에서 일정 이미징 세션 간에 mW. 레이저 파워를 설정할 때 주의 해야 합니다. 카멜레온 II 레이저는 3 W 레이저 800 nm와 10% 또는 더 높은 전원 잠재적으로 조직의 손상을 유발 수.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 수집
	<ol>
<li>미리 보기 모드에서 XYZ 개요 도구를 사용 하 여 조직 영역을 스캔 합니다.</li>
		<li>이 모드에서 이미지의 인수를 속도를 더 낮은 해상도 (256 x 256 픽셀 및 아무 선 평균)는 이미지를 설정 합니다.</li>
		<li>5 x 5, 3 x 3, 또는 직물의 전체 표면을 커버 하는 보기의 단일 필드를 캡처하십시오. 개요 캡처 전에 각 위치에서 라이브 "스캔" 모드를 설정 하 고 조직 초점을가지고. 참고 조직의 다른 지구 축 방향으로 약간 다른 위치에 있을 것 이다.</li>
		<li>콜라겐 섬유 보기의 전체 필드에서 특정 위치에 단계를 이동 하려면 개요 도구에서 해당 위치를 두 번 클릭 플랫 영역을 찾아.</li>
		<li>라이브 "스캔" 모드, 플레인 초점에는 목표의 Z 위치를 조정 켜고, Ti 패드를 사용 하 여 Z 드라이브 광학 비행기 10-15 μ m이 하단 레이어 위에 이동.</li>
		<li>1024 x 1024 픽셀, 2 x 선 평균, "캡처" 버튼을 사용 하 여 높은 해상도에서 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>"+" 버튼을 사용 하 여 XYZ 개요에 위치를 저장 합니다. 이렇게 하면 조직의 같은 지역 탈환 하지.</li>
		<li>직물의 각 조각을 위해 겹치지 시야의 10 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. DSC 프로토콜
참고: 조직 준비 지역 DSC 분석을 위해 또는 조직 이미징 SHGM 수행 후에, 완료 되 자 마자이 단계를 진행 합니다.
<ol><li>DSC 팬, 무게와 표시를 준비 합니다. 참고:이 단계 이루어져야 조직 해 부 하기 전에 조직의 건조를 최소화 합니다.</li>
	<li>흡수 성 조직으로 각 scleral 광장을 건조 하 고 이빨된 집게를 사용 하 여 DSC 팬의 바닥에 평평 하다.</li>
	<li>조직 내부와 곱슬 머리 뚜껑 팬 무게 고 무게 젖은 조직을 적용 (샘플의 질량 5 ~ 11 밀리 그램의 범위에 있어야 합니다). 참고: 각 인감 다음 조직 샘플을 진행 하기 전에 뇌관 집게를 사용 하 여 이동 합니다. 팬, 열 분석 이전 물 손실 방지 밀봉 밀폐 된다.</li>
	<li>일단 샘플 구겨지지 DSC 트레이에 지정 된 위치에 놓습니다. 컨트롤에 대 한 6 샘플 및 치료 눈에 대 한 16 이어야 한다.</li>
	<li>소프트웨어 관리, 조직의 무게를 지정 하는 악기를 사용 하 여 메서드를 만들고 실행 하는 다음 매개 변수를 사용 하 여 열 분석: 난방 속도 40 ~ 80 ° C의 온도 범위: 1 ° C/min, 열 흐름: 17.37 mW, 가스 (N2) 흐름: 19.8 mL/min, 가스 압력: 2.2 바.</li>
	<li>완료 되 면, 어떤 열 변성에 전환 온도 피크 발생 관리 소프트웨어 악기를 사용 하 여 추출 하 여 각 샘플에 대 한 데이터를 분석 합니다.</li>
</ol>8. 이미지 분석
<ol><li>
SHG 신호
	<ol>
<li>선택 적어도 5-10의 각 치료 및 그것의 통제에서 가장 대표적인 이미지 같은 이미지의 영역 대부분 콜라겐 섬유에 의해 점유 된다.</li>
		<li>ImageJ 소프트웨어에서 각 이미지를 업로드 하 고 선택 하 여 평균 픽셀 강도 측정 분석 > 측정 활성 이미지에 대 한.</li>
		<li>추출 값 평균 픽셀 강도로 보고 하 고 메뉴에서 선택 하 여 농도의 히스토그램을 그려서 표시 또한 수 있습니다 분석 > 히스토그램.</li>
		<li>따라 모든 측정된 데이터를 문서에 테이블을 만들고 Excel 시트를 사용 하 여 샘플 id입니다.</li>
		<li>평균 및 각 치료 및 제어 조건에 대 한 픽셀 강도의 표준 편차를 계산 합니다.</li>
		<li>학생의를 사용 하 여 t-검정, 농도 (즉, 0과 0 대 400 mM 서울시 대 40 m m SMG)의 모든 인덱스도 비교에 대 한 차이 비교 합니다. [P≤0.05]입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
파형
	<ol>
<li>콜라겐 섬유를 표시 하는 이미지를 선택 합니다. 샘플 당 적어도 10 이미지 (를 포함 하 여 각 농도-총에서 40 이상에 대 한 컨트롤 샘플) 분석 되어야 합니다.</li>
		<li>오픈 ImageJ > 플러그인 > NeuronJ. NeuronJ 사전 설치를 해야합니다.</li>
		<li>모든 imagesby는 열린된 NeuronJ 창에 드래그를 업로드 합니다.</li>
		<li>마우스로 fibril의 윤곽에 따라 섬유를 따라 추적 선 만들기 (그리기 태블릿 펜 사용 될 수), 총 섬유 길이의 거리를 측정 하는 M을 클릭 합니다.</li>
		<li>접선 직선을 그릴 시작과 이전 그려진된 섬유 윤곽선의 끝 연결을 "옵션"을 선택 합니다. 엔드-투-엔드 길이 측정 하는 M을 클릭 하세요.</li>
		<li>이미지 당 적어도 10 소에 동일한 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>10 소의 각각에서 그 두 측정을 수집 하 고 각각 길이 [곡선] 및 [선형], 길이 총 섬유 길이 (윤곽선) 및 엔드-투-엔드 길이 (바로 연결 라인)을 표현 하는 excel 스프레드시트에 데이터를 입력 합니다.</li>
		<li>계산 하는 수식을 사용 하 여 파형 인덱스 (W): W = 길이 [곡선] / [선형] 길이.</li>
		<li>수식을 사용 하 여 컨트롤 샘플에서 이미지와 함께 대우 samples(SMG)의 이미지에서 데이터를 비교 하는 파형의 %를 계산: (W [서울시]-1) / (W [제어]-1)</li>
		<li>통계의 차이점 (p-값) 콜라겐 섬유 형태학의 다른 처리 조건 및 제어를 결정 하기 위하여 파형 인덱스 (W)에 대 한 인덱스도 t-테스트를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

실시 실험 콜라겐 cross-linking sclera, cross-linking 치료에 대 한 모니터링 도구로이 기법을 사용 하 여 미래의 가능성 제기에 효과의 평가 위한 방법으로 SHG 신호 현미경의 사용을 지 원하는 증거를 나타났습니다. 그는 콜라겐 단백질을 대상. 메모의 악기는 이미 잠재적으로이 SHG 신호를 캡처할 수 있는 임상 사용 중에서입니다. 이 악기는 주로 이미징 피부 인간의 피에 대 한 설계, 이미지 각 막과 공 막23성공적으로 사용 되어 있다.
동일한 검색 및 제어를 비교할 때 조건 이미지를 유지 하기 위해 필요한 샘플을 처리 하 고. 2 고조파 세대 sclera 조직에 콜라겐의 현미경 필요 호환 다 광자 영상, 형광 현미경 펄스 적외선 레이저는 GaAsP 등 매우 민감한 검출기에 800-900 nm 파장 범위 조정 비 descanned (NDD) 감지기입니다. 이 원고에 설명 된 지침에는 시작 지점입니다. 조건 또는 다른 시스템에 대 한 새로운 실험에 대 한 구체적으로 결정 되어야 합니다.
각 막과 공 막 또한 있다 평가 동시에이 기술을24,25,,2627을 사용 하 여 연구에. 그것의 기본 상태28,,2930,31에 독립적으로 각 막 조직 검사 여러 연구 SHG 신호 모두 앞뒤로 방향에서 전파를 알면, 32,,3334 및 keratoconus35,36 뿐만 아니라 (아래에 설명)으로 CXL 다음. 이러한 연구의 결과 각 막 신호는 각 막의 투명도 빛 앞으로 분산된 시스템에서 모니터를 조직을 통해 전달 사실 의미가 앞으로 흩어져 방향에 최적화 되어 나타냅니다. 일반적으로 SHG 신호에 파란색 표시 범위 이며 눈 sclera 같은 높은 산란 조직을 통해 전달할 때 크게 감소 될 것 이다. 결과적으로, 앞으로 흩어져 SHG의 조직의 특별 한 광학 설정 뿐만 아니라 50 μ m 또는 더 적은 두께의 얇은 단면도 요구할 것입니다. 대조적으로, 조직 단면 없이 형광 현미경의 일반 빛 경로 통해 다시 흩어져 신호를 캡처할 수 있다 하 고 따라서이 모드는 기본 30-40 μ m의 깊이를 그대로 sclera 조직에 콜라겐을 이미징 하는 경우. 이 연구에서 우리는 신호 밀도 농도 의존 증가 지적 했다. 그러나 그것은 확실히 가능 하다,,는 광장의 sclera, 더 깊은 층에 추가 하 고 비슷한 효과 있 었 하 고 발음 하 고 특히 높은 농도 가진 더 깊은 층을 확장 효과가 더 있을 수 있습니다. 그러나, 제한 SHG 신호 침투는 sclera에이 초기 연구의 목적을 위해, 때문에 우리 가장 피상적 sclera (15 µ m 깊이)에서 가져온 최고의 품질 이미지와 함께 작동 하도록 선택 했습니다. 미래에 연구, 우리 의회 방법이 아니었다 왜 큰 차이도로 추가로 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다 다음 종속 효과 40과 400 mM 처리 샘플 사이 관찰 하는 깊이 고려할 것입니다.
또한, 리 보 플 라빈 CXL 유도 조직 cross-linking 평가 대 한 SHG에의 사용, SHG 현미경 이미징 다음 리 보 플 라빈은 각 막의 CXL 보고 되었습니다 여러 그룹37,,3839 여 , 40 , 41. 스티븐 외에 의해 연구에서 37, CXL 기술을 사용 하 여 각 막 안정화는 '균질' 신호 및 손실의 조직 '주름' 또는 '파동'의 교차 연결 된 샘플에서 본 결과. 그러나 이러한 유형의 변경,, 또한 했다 주의의 기술적인 가능성을 제기 하는 각 막 SHG 신호, IOP에 변화의 효과 평가 연구. 조직에서 더 높은 순서 섬유 번들/플레이트 조직 관점 뿐 아니라에서 fibril sclera 그리고 각 막 다르다 이며 많은 전자 현미경 연구에서 이러한 차이점에 대해 알고 있다. 두 조직 다 fibril 직경 분포 (공 막 엔에 대 한 변수 및 각 막 직경 소에 대 한 작은 균일 한 소) 및 간격 (각 막과 공 막에 대 한 변수 유니폼) 간 fibril fibril 포장에 관해서는. 뿐만 아니라, 더 높은 순서 조직 섬유 번들 (sclera) 대 플레이트 시트 (각 막)으로 매우 다르다. 이러한 구조적 차이이 두 조직에 의해 생성 하는 SHG 신호에 반영 됩니다. 따라서, cross-linking에 의해 유도 된 변화는 다르지만 병렬 방식에서 SHG 신호를 변경할 수 있습니다. 다른 말로 '스트레이트'는 공 막에 섬유의이 연구에는 문학에서 보고 된 각 막에는 신호 '균질 ' 관찰 했다 수정 cross-linking 콜라겐의 두 결과. 따라서, 각 막에 '균질 ' 효과 어떤 식으로든에서 수 여기 보고 되었습니다 sclera의 '스트레이트' 효과에 유사한.
의회에 의해 제작이 스트레이트 효과 발생 메커니즘은 현재 연구에 따라 분명. 한 가능성 수는 조직 어떻게든 '고정 ' 기계적으로 '' 로드 된 위치에 있습니다. 이 유도 하는 관념을 지 원하는 것이 'fibril 및 섬유 안정화' 발생 했다. 안구 내부 압력 가능성이 변화 IOP 이전 및 세인트 주입에 따라 모니터링 안정 유지 이후이 효과에 공헌 하지 않았다. 전반적으로,이 관측의 중요성은 명확 하지 않다 고 추가 연구가 필요할 것 이다. 메모의 이미징 기법 브 릴 루 앵 현미경42, 등 별도는 보였다 양적 측정을 제공 하기 위해 (전단 탄성 계수에 의해 결정)으로 cross-linking의 CXL 광화학 다음에 유용할 수 있습니다 SHG와 결과 확인 이 연구에서 이미지입니다. 그러나, sclera43등 높은 분산 조직 사용 기술 수정 요구 복사해올된 scleral 조직으로 검증 되지 않은 주목 되어야 한다.
분극 레이저 SHG 현미경 검사 법은 중요 한 문제. 레이저 빛은 선형 편광 고 각 콜라겐 섬유에 xy-평면에서 어떤 각도로 SHG 신호 전파의 방향에 수직을 지향. 따라서, xy-평면에 섬유를 잘 정렬 하 고 정확 하 게 수직으로 편광 된 레이저 광을 생산할 예정 이다 (즉, z-비행기), 입사광에 평행 하 게 그를 포함 하 여 다른 각도에서 그 보다 더 높은 SHG 신호를 생산할 예정 이다는 (때문에 파괴적인 방해) 최저 SHG 신호. Sclera 조직에 관하여 콜라겐 비록 기본 해부학 섬유 방향 존재 하는 미세한 수준에서 다양 한 각도에서 섬유는 지향 세계 위치 기반으로 합니다. 따라서, 생산 SHG 신호는 각 섬유의 xy 평면에 각도 따라 달라 집니다, 이후 전체 신호 보다 적게 될 모든 콜라겐 섬유 (한 힘 줄 같은 조직에서에서 동일한 각도로 정확 하 게 정렬 했다 경우 생성 되는 예를 들면). 따라서,이 연구 되 고 몇 군데 샘플의 특성상 분극의 방향으로 의도적으로 결정 하지는 하지만 연구에 걸쳐 일관성을 유지 했다. 또한, 우리 조직을 처리 했다에서 취급 하 고 섬유 방향 샘플 간의 차이 최소화 동일한 scleral 지역에서 글로브를 제어. 마지막으로, 우리는 강도 값을 얻기 위해 샘플 당 100 개 이상의 이미지를 분석. 이 광범위 한 평가 등록 되었습니다 어떤 탈 SHG 신호를 정규화 해야 합니다. 그 말했다 하 고, 그것이 가능한 결과로 "섬유 스트레이트" 우리 "에 초점 비행기의" 섬유는 SHG의 증가에 기여 할 수 있는 더 큰 비율 (위에서 설명한) 복사해올된 샘플에서 관찰 증가 뿐만 아니라 신호 SHG 신호 큰 xy-평면 정렬에서. 이러한 가능성의 둘 다 유도 가교 효과의 발현 될 것 이다.
서울시의 성 주사에 의해 유도 된 변화 (Tm)에 의해 cross-linking의 지역 분석 수행 되었다. 예상 했던 대로, cross-linking 효과의 수준은 주입의 지역에 집중 되었다. 거의 비슷하게 상호 효과 주입, 알려 지는 무슨이 초음파 지역화44, 에 의해와 같이 세인트 주입에 따라 효과의 지역화에 대 한 일치에서 맞은편 (더 멀리) 지역에서 주의 되었다 45 tomography46계산.
마지막으로, 가교 치료 및 근 시, 각 막의 cross-linking 교원 질 찾는 광범위 한 사용 그리고 keratoconus, 포스트 LASIK keratectasias 용 한계 변성 (PMD)를 포함 하 여 각 막 불안의 치료에는 굴절 수술 절차47겸임입니다. Cross-linking로 막 질병 치료의 성공 그리고, 특히, 높은 근 시2, 다시가 개념에서에서 축 신장 제한 sclera 눈의 뒤에이 치료 방법을 적용 하는 탐험에 주도하는 치료 상호 개념48,49의 아주 초기 단계.

으로 콜라겐 효소 cross-linking 차단 실험 양식 부족 (FD)을 증가 시킬 수 있습니다 (광화학 또는 화학), 비 효소 scleral cross-linking를 통해 치료할 수에 진보적인 근 시 가정은-유도 근1. Elsheikh 및 필립스2 최근 타당성과 표준 A 자외선 방사선 (UVA)를 사용 하 여의 가능성 논의-리 보 플 라빈 광화학 cross-linking (드레스덴 프로토콜 라고도 함), 약식 중재 (리 보 플 라빈 CXL) 여기 근 시 축 신장 중단 후부 scleral 안정화. 이 광화학 방법 keratoconus와 포스트 LASIK keratectasia에서 본 앞쪽 글로브 표면 (즉, 불 룩 한 각 막)의 불안을 치료에 성공적으로 사용 되었습니다. 그러나,의 공 막이 CXL 프로토콜 응용 프로그램 액세스는 자외선 (UV) 광원, 뿐만 아니라 훨씬 더 조직 표면 영역을 수정 하려면 필요 후부 sclera에 어려움에 관련 된 문제에 의해 방해 된다. 비록 후부 sclera의 여러 지역 여러 별도 방사선 조사 영역 그 연구3에 필요한 토끼 (tarsorrhaphy)에 의해 박탈 그 말했다 되는, CXL 접근 사용 되었습니다 시각적 형태로 축 신장 중단 하. 대조적으로, 화학 안정화 에이전트의 (즉, cross-linking 대리인) 세인트 공간을 통해 주입 UV 광원 도입에 대 한 필요성을 피하고 후부 sclera를 수정 하는 간단한 방법을 대표할 수 있었다. 이 주입 기술은 백 내장 수술4,,56등 안과 절차 동안 안구 마 취를 유도 하는 유용한 방법으로 유명 하다. Wollensak7 glyceraldehyde (화학 가교 에이전트 에이전트 (FARs)이이 연구에서 설명 공개 포름알데히드 비슷한 개념)를 사용 하 여 성 주사를 사용 하 여 위에서 설명한는 토끼 sclera 및 genipin 완고 하는 FD 기니 피그8,9축 길이 제한 하는 것을 보였다. 이 광화학 CXL 기술을 통해 수용 성 화학 약품을 사용 하 여의 명확한 이점을 설명 했다. 따라서, scleral cross-linking FARs (즉, 광장)를 포함 하 여 어떤 종류의 주 사용 화학 약품을 사용 하 여10, scleral 신장에서 근 시의 진행을 중단 하는 가능한 치료 방법을 제공할 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜, 싱가포르로 토끼 눈의 공 막 엔 세인트 주입을 통해 전달의 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 화학 가교 솔루션 사용 하 여. 우리는 각 막에 국 소 화학 cross-linking 이전 유사한 프로토콜을 실행 했다. 그 이전에 보고 된 연구에 특히 집중 효과 cross-linking 종속 얻어질 수 효과 범위를 넘어서는 열 변성 분석11 정한 광화학 CXL와 달성 스패닝 SMG를 사용 하 여 .
여기는 성 주사 scleral 조직, 차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 그리고 두 번째 고조파 세대 현미경 검사 법 (SHGM)를 사용 하 여 열 변성을 통해 전달 하는 SMG의 가교 효과 평가 하기 위해 프로토콜에 설명 합니다.
차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC), 라고도 열 분석를 사용 하 여 열 변성 변화 측정, scleral 조직에는 주로 그들은 대량 대다수 구성 이후 원 collagens의 속성에 의해 유도 단백질. 이 메서드는 콜라겐 분자 구조의 안정성과 교원 질 소 주 3 차 단백질 구조 안정화 복사해올된 채권 평가 합니다. DSC에 난방, 동안 중요 한 전환 온도 트리플 헬릭스, 젤라틴으로 알려져 일반적으로 형성 하는 과정의 풀기 결과 콜라겐 분자의 변성 결과 얻을 수 있다. 이 열 변성 콜라겐 분자를 따라 수소 결합을 방해 하 고 유도 가교 방법12,13더 높은 온도에 이동 될 수 있다. 이 방법은 특히 바이오 산업에에서 많은 십 년간 동안 그리고 가죽 만들기를 포함 하는 프로세스에 대 한 사용 되었습니다. 그러나,이 메서드 sclera 조직 추출 필요 하며 따라서만 수 비보 전 기법으로.
2 차 고조파 생성 현미경 (SHGM) 비 centrosymmetric 분자 환경 특정 재료의 비선형 광학 특성을 기반으로 합니다. 같은 자료, 강렬한 빛에에서 예 빛 레이저에 의해 생성 하, SHG 신호, 사건 빛 주파수에서 두 배가 됩니다 생성 합니다. SHG 신호를 만드는 것으로 알려진 생물학 물자는 콜라겐, microtubules, 및 근육 myosin. 예를 들어 콜라겐 860 nm 파장의 적외선으로 흥분된 430 nm 파장을 가진 보이는 범위에서 SHG 신호를 방출 합니다. 둘째로 고조파 생성 (SHG) 신호 영상 치료 콜라겐 cross-linking 평가 하는 유망한 방법 이다. 그것은 30 년 이상에 대 한 조직에 콜라겐 소 SHG 신호14방출 알려져 있다. 그러나, 최근에 수 고해상도 이미지 얻을 수15 콜라겐 젤19와 조직, 힘 줄16, 피부, 연골17,18, 혈관 등의 다양 한에서.
이 지식을 바탕으로,이 연구 서울시 화학적으로 유도 된 콜라겐의 cross-linking 통해 sclera에 유도 SHG 신호 변화를 평가 합니다. 결과 표시는 공 막의 SMG 수정 SHG 신호 조직 콜라겐 섬유 번들 (높은 순서 제 사기 구조 교원 질 소의 구성)에서 생산을 증가 하 고 또한 콜라겐에 구조적인 형태 론 적 변화를 생산 하 고 섬유 네트워크, 섬유 번들 "교정."에 반영

<table><tbody><tr><td>MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td><td>EMD Millipore, Massachusetts, USA</td><td></td><td>Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td></tr><tr><td>Sodium hydroxymethylglycinate&amp;nbsp;</td><td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td><td></td><td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td></tr><tr><td>Injection needle with luer-lock syringe</td><td>BD Eclipse, NJ, USA</td><td></td><td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td></tr><tr><td>Rabbit head</td><td>La Granja poultry</td><td>Outbred</td><td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td></tr><tr><td>Tono-pen&amp;nbsp;</td><td>Reichter Technologies Depew, NY</td><td></td><td>IOP measurements - protocol step 2.4</td></tr><tr><td>DSC 6000 Autosampler</td><td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td></tr><tr><td>Pyris software&amp;nbsp;</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td><td>Ver 11.0</td><td>&amp;nbsp;protocol step 7.5</td></tr><tr><td>CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td></tr><tr><td>GenTeal&amp;nbsp;</td><td>Alcon, Fort Worth, TX&amp;nbsp;</td><td>B000URVDQ8</td><td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II&amp;nbsp;</td><td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td><td></td><td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td></tr><tr><td>AttoFluor cell chamber</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>A7816</td><td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td></tr><tr><td>25-mm round coverslips, #1.5</td><td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td><td>GG-25-1.5</td><td>protocol step 8.1.3</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>protocol step 8.1.4.</td></tr><tr><td>Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td></tr><tr><td>A1R-MP laser scanning system</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td></td><td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td><td>Ver 4.3</td><td>refered to as &quot;software&quot; in the text - protocol step 8.1.9</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>&amp;nbsp;protocol step 9.1.2</td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td><td></td><td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel&amp;nbsp;</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td><td>Ver 14</td><td>protocol step 9.2.8</td></tr></tbody></table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

치료에 대 한 구조 단백질 (원 collagens)로 화학 채권 (비 효소 cross-linking)을 도입 하 여 조직을 강화 하는 방법 등 광화학 cross-linking 조직 cross-linking (TXL) 방법. 유도 하는 기계적 조직 속성 변경에 대 한 이러한 메서드는 고용 되 고 각 막에 원추 각 막으로 진보적인 근 시에서 sclera (기계적으로 약화) 각 막 숱이 장애에 숱이 고 뒷부분의 약화 공 막과 가능성이 축 신장에 기여 한다. 이러한 조직 강화에 대 한 기본 대상 단백질은 원 collagens 각 막과 공 막에 건조 중량 단백질의 대다수를 구성 하는. 우연히, 원 collagens 조직 세포 외 공간에서 제 2 고조파 발생 신호의 주요 원천입니다. 따라서, 콜라겐 단백질 요법, cross-linking를 통해 유도 등의 수정 수 잠재적으로 감지 되며 두 번째 고조파 세대 현미경 (SHGM) 통해 quantitated. 레이저 적외선 여기 가벼운 현미경 시스템을 스캔을 사용 하 여 신호 모니터링 SHGM 소스는 즐기고 생명 과학 분야에서 광범위 하 게 사용 하는 흥미로운 현대 이미징 방법입니다. 따라서, 현재 연구 에이전트 하위-장부의 공간 (sT), cross-linking 화학 물질의 주입에 따라 토끼 sclera, ex vivo에서 에서 가교 효과 유도 하는 측정 하는 수단으로 SHGM 현미경 검사 법의 사용을 평가 하기 위하여 착수 했다는 사출 접근 즉 안구 마 취 안과 임상 절차 동안에 원인에 대 한 표준 연습. 에이전트 cross-linking 화학 나트륨 hydroxymethylglycinate (서울시), 에이전트 (FARs)를 방출 하는 포름알데히드로 알려진 화장품 방부 제의 클래스입니다. SMG와 반응에 따라 scleral 변경 SHG 신호 증가 귀착되 고 열 변성 온도에 변화를 서로 평가 하는 표준 방법을 유도 효과 cross-linking 조직.

광장 cross-linking 효과 평가 하는 시험 방법으로 열 변성 온도 (Tm): 토끼 눈의 16 쌍의 총 의회 절차에 대 한이 실험에서 사용 되었다. 이 연구의 초기 부분으로 싱가포르로 토끼 머리에 세인트 공간 통해 SMG 상호 에이전트의 단일 주사에 의해 유도 된 가교 효과의 지역화 평가 했다. 실험의이 유형은 하나 이상의 위치에 주사 sclera의 원하는 영역을 안정화 하는 데 필요한 수 때문에 환자의 임상 치료에 관련이 있다.
것입니다 기본적인 확산 원리에 따라 예측할 수, 효과가 했다 큰 주사의 사이트에서 솔루션의 농도 따라 인접 한 지역 뿐만 아니라, 유도 하는 효과 함께. 그림 1A scleral 분야 (빨간색 빈 번호 글꼴에서 1-4) (더 사각형 (1-16 검은 얇은 숫자 글꼴)으로 분할)와 단일 성 주입 다음 별도 열 변성 분석 경험의 구조 위치를 나타냅니다. 색상 매핑 인덱스입니다. 표 1 은 해당 컨트롤에 비해 번호가 매겨진된 각 부문에 대 한 Tm 값에 변화를 보여준다. 값 40 m m와 400 m m 주사 포함 하 고 최소 3 개의 독립적인 결정의 계산 의미의 표준 오차를 포함.
그림 1B-C 서울시, 40 mM (그림 1B)와 400 mM (그림 1C)의 두 개의 다른 농도 사용 하 여 결과 나타냅니다. 그림 1B, 낮은 농도 40 m m 샘플 광장 2 (주사 사이트)에서 주의 되었다 Tm에 가벼운 변화를 보였다. 유사한 교대 인접 한 사각형 1 3 (밝은 파랑)에서 볼 수 있었다. 사각형 4-6 7-9 주입된 광장에서 통계적으로 유의 한 차이가 없이 한계 교대를 볼 수 있습니다. 아니 Tm shift 주사 사이트에서 가장 먼 분야 대표는 낮은 사각형 14 ~ 16에 보였다.
그림 1C에서 같이, 높은 농도 (400mm) 통계적으로 매우 중요 한 가교 효과 (오렌지의 음영으로 표시)을 했다. 낮은 40 mM 농도에 비해 400mm의 효과에 큰 차이 반영 관련된 작은 표준 편차와 p < 0.05 Tm에 큰 변화가 관찰 되었다. 가장 극적인 효과 부문 1 위 세계에서 지적 했다. 나머지 분야에 관해서는 덜 효과 10-14 (이 되었을 수도 있습니다 가교 유체의 일부 추적으로 인해 뒤로) 사각형에서 관찰 되었다 하 고 영향을 주지 않습니다 사각형 11, 12, 13, 15, 및 16에서에서 관찰 되었다. 전반적으로, 가교 효과 했다 2와 3 섹터 (즉, 사출 사이트에서 가장 먼 위치), 4에서에서 관찰 아무런 영향 분야에서 한계 40 m m 샘플 비슷합니다. 이러한 결과 표시 '효과의 영역'은 이러한 유형의 패턴 cross-linking 대리인의 세인트 주입에 따라 예상 될 수 있었다. 이 조직의 넓은 지역 효과 유도 하기 위하여 여러 위치에서 주입에 대 한 필요성을 나타낼 수 있습니다.
서울시의 2 개의 농도와 의회를 평가 하는 그대로 눈에서 유도 된 가교 효과의 연구도 수행 되었다. 열 변성 받았다 scleral cross-linking 같은 조직의 분석 수행 되었다. 광장 3 개의 다른 농도, 40을 사용 하 여 3.5 h 했다 시간 cross-linking (Tm = 1.2 + 1.11), 100 (Tm = 2.9 + 5.12), 400 (Tm = 1.1 + 14.34) mM 서울시. 결과는 서울시 복사해올된 조직에서 농도 의존 효과 보여주었다.
둘째로 고조파 생성 (SHG) 광장 cross-linking 효과 평가 하는 방법으로 이미징:
SHG 현미경 이미지 모두 픽셀 강도 SHG 신호 및 섬유 번들 파형의 분석. (400 m m 40)에서 농도 cross-linking의 넓은 범위는 cross-linking 효과의 넓은 범위에 걸쳐 발생할 수 있는 SHG 신호 변화를 탐구 하기 위하여 사용 되었다. 처리 프로그램20피지 이미지에 포함 된 히스토그램 분석 기능을 사용 하 여, quantitate SHG 신호 세인트 주입, 40 m m 400 m m를 사용 하 여 유도 그 효과 비교 하 여 scleral 조직에서 생산 가능 했다. 40 m m에 평균 픽셀 intesities에 평균 차이 66.3 ± 27.7 361.4 ± 28.3 400 m m 샘플, 거의 6-fold 증가에 비해 했다. Tm에 해당 증가 또한 이러한 조건 하에서 주의 되었다 이후이 조직 cross-linking의 증가와 해당 합니다. 그림 2 는 40 밀리미터 (그림 2B)와 400 mM (그림 2C) 컨트롤 (그림 2A)에서 가져온 sclera의 대표적인 SHG 이미지. 평균 밝기 (또는 픽셀 휘도)를 포함 하 여 동반 히스토그램 분석 표시 됩니다. 이미지 분석의 총 수를 했다: 40 m m 및 그 제어; 98 120 400 m m와 그것의 자신의 컨트롤에 대 한 94 121. 조직 영상의 깊이 episcleral 표면에서 10-15 µ m 이었다. 수많은 이미지 필드의 평균 참여, 히스토그램 분석의 결과 표시 cross-linking 효과 (그림 3) 의 높은 농도 더 큰 픽셀 농도 생산.
그림 4에서처럼 이미지 분석 또한 ImageJ 플러그인 '뉴런 J'21을 사용 하 여 심장 혈관 혈관 문학에서 채택 하는 방법으로 수행 되었다. 우리 예상 파형 요소 W = 길이 [곡선] / [선형] 길이 고 우리는 치료 제어 sclera 대 40 m m 및 400 m m 복사해올된 sclera 감소 파형 %로 표시 된 섬유 번들의 교정 결과 cross-linking 관찰 (W % (W [= SMG]-1)/(W[control]-1), 표 2)입니다. 40과 400 m m SMG 취급 샘플 파형에 차이 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56385/56385fig1.jpg"> 그림 1 : 세인트 주입을 사용 하 여 40과 400 mM 서울시를 통해 광장 효과의 지역화. (A) 사각형 [작은 검은 얇은 글꼴에서 숫자 1-16] (규모 하지 그려) 열 분석 경험을 나누어 sclera 4 scleral 부문 (1-4 대형 빨간색 투명 글꼴에서 숫자)의 도식 대표. 사출 사이트 부문 1에에서 위치한 광장 (광장 2)에 대응 했다. 열 변성 cross-linking 400mm SMG (1B) 40mm SMG와 의회와 (1 C) 의 효과. (D) 색상 (B) 와 (C)에 대 한 온도 눈금 전설 코딩. 이 그림은 권한을22Zyablitskaya 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56385/56385fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56385/56385fig2.jpg"> 그림 2 : 농도 의존 증가 SHG에의 대표 이미지 신호 광장 sclera의 세인트 주입을 통해 서울시를 사용 하 여 다음 생산 하는 밝기 레벨 비보 전 . SMG의 농도 (B) 40 m m와 400 m m (C) 표시 됩니다. 각 이미지는 50 µ m 눈금 (오른쪽 하단 모서리) 막대와 평균 픽셀 강도 값 (오른쪽 상단)-절대 값을 포함합니다. 이 그림은 권한을22Zyablitskaya 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56385/56385fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56385/56385fig3.jpg"> 그림 3 : Scleral 그대로 글로브 40과 400 m m SMG 솔루션 세인트 주입 (의회)를 통해 십자가에 (같은 토끼 머리에서 쌍된 컨트롤)에 비해 SHG 신호 픽셀 강도 변화 (Δ)의 막대형 차트. 뜻의 표준 오차와 평균 값: 40 m m 및 400 m m 361 ± 28.3 66 ± 27.7. 이 그림은 권한을22Zyablitskaya 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56385/56385fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56385/56385fig4.jpg"> 그림 4 : 섬유 파형 분석 (으로 선형성에 의해 표명)의 예. (오른쪽 하단 모서리) 바 50 µ m 규모와 40 mM SMG 농도 제어 샘플의 이미지. 이 그림은 Zyablitskaya 외에서 수정 되었습니다. 권한22와. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56385/56385fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56385/56385fig5.jpg"> 그림 5 : 세인트 주입의 도식 대표. 영역 1-3 번호가 그림 1A에 표시 영역에 해당 합니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56385/56385fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">±Δ Tm</td>
		</tr>
<tr>
<td>지역</td>
			<td>40 m m</td>
			<td>400 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>3.4 ±2.8</td>
			<td>20.5 0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>3.4 ±0.53</td>
			<td>19.58 ± 1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.5 ±2.47</td>
			<td>17.99 ±3.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.72 ±0.9</td>
			<td>20.36 ±0.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>0.85 ±0.55</td>
			<td>19.11 ±1.33</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>0.52 ±1.35</td>
			<td>18.66 ±4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>0.78 ±1.6</td>
			<td>18.44 ±2.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>0.56 ±0.9</td>
			<td>17.77 ±2.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>0.22 0.6</td>
			<td>18.92 ±2.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>0.46 ±0</td>
			<td>8.75 ±10.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>0.47 0.18</td>
			<td>0.63 ±1.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>0.11 ± 0.08</td>
			<td>0.66 ±1.52</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>0.08 ± 0.05</td>
			<td>0.71 ±2.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>0.22 ±0.7</td>
			<td>5.71 ±0.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>0.32 ± 0.2</td>
			<td>0.29 ±0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>0.24 ±0.73</td>
			<td>0.26 ±0.79</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: DSC는 의회 효과 연구의 지역화에 대 한 결과. 그림 1A에서 묘사 된 샘플링된 각 부문에 대 한 표준 오류로 열 용융 온도 (ΔTm)에 변경이입니다. 각 값은 대응된 컨트롤에 Tm ascompared에 차이 표현 되며 3 독립적인 결정의 최소의 평균입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>서울시, mM</td>
			<td>파형</td>
			<td>파형-%</td>
			<td>[0 m m SMG] 대 t-검정</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>1.106 ± 0.044</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>1.067 ± 0.017</td>
			<td>63</td>
			<td>p < 0.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>400</td>
			<td>1.059 ± 0.009</td>
			<td>55</td>
			<td>p < 0.003</td>
		</tr>
<tr>
<td>선형 섬유</td>
			<td>1.000</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(이론)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2. 섬유 파형 분석의 결과입니다. SHG 이미지 광장 주입의 영역에서 뉴런 J 소프트웨어를 사용 하 여 섬유 파형의 정도 대 한 분석 했다. 10 섬유 각 이미지에서 선정 되었다 고 약 100 섬유의 총 파형의 정도 대 한 분석 했다. 뜻의 표준 오차와 평균 값 포함 되어 있습니다.

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Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

이 프로토콜의 둘째로 고조파 생성 이미징 및 차동 주사를 사용 하 여 토끼 sclera cross-linking 화학 평가 기법을 설명 합니다.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

second-harmonic-generation-signals-rabbit-sclera-as-tool-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

7.7K 조회수.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. 이 프로토콜의 둘째로 고조파 생성 이미징 및 차동 주사를 사용 하 여 토끼 sclera cross-linking 화학 평가 기법을 설명 합니다.

비디오: Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into sound waves and is currently under intensive investigation. However, most reported work to date is focused on the imaging of the posterior segment of the eyes of small animals, such as rats and mice, which poses challenges for clinical human translation due to small eyeball sizes. This manuscript describes a novel photoacoustic microscopy (PAM) and optical coherence tomography (OCT) dual-modality system for posterior segment imaging of the eyes of larger animals, such as rabbits. The system configuration, system alignment, animal preparation, and dual-modality experimental protocols for in vivo, noninvasive, label-free chorioretinal imaging in rabbits are detailed. The effectiveness of the method is demonstrated through representative experimental results, including retinal and choroidal vasculature obtained by the PAM and OCT. This manuscript provides a practical guide to reproducing the imaging results in rabbits and advancing photoacoustic ocular imaging in larger animals.

This manuscript describes the novel setup and operating procedure of a photoacoustic microscopy and optical coherence tomography dual-modality system for noninvasive, label-free chorioretinal imaging of larger animals, such as rabbits.

살아있는 토끼 눈에 소설 Photoacoustic 현미경 및 광학 일관성 단층 촬영 듀얼 적임 Chorioretinal 이미징

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

연구

공학

Three Different Protocols of Corneal Collagen Crosslinking in Keratoconus: Conventional, Accelerated and Iontophoresis

Keratoconus is a bilateral and progressive corneal ectasia. In order to slow down its progression, corneal collagen cross-linking (CXL) has recently been introduced as an efficient treatment option. In biological and chemical sciences, crosslinking refers to new chemical bonds formed between reactive molecules. Hence, the aim of corneal collagen CXL is to synthetically increase the formation of crosslinks between collagen fibrils in the corneal stroma. Despite the fact that the efficiency of the conventional CXL (C-CXL) protocol has already been shown in several clinical studies, it might benefit from improvements in duration of the procedure and removal of corneal epithelium. Hence, in order to provide a coherent evaluation of two new and optimized CXL protocols, we studied keratoconus patients who had undergone one of the three CXL treatments: iontophoresis (I-CXL), accelerated CXL (A-CXL), and conventional CXL (C-CXL). A-CXL is a 6 time faster CXL procedure using a ten time higher UVA irradiance but still including an epithelium removal. Iontophoresis is a transepithelial non-invasive technique in which a small electric current is applied to improve riboflavin penetration throughout the cornea. Using anterior segment optical coherence tomography (AS OCT) and in vivo confocal microscopy (IVCM), we conclude that regarding the depth of treatment penetration, conventional CXL protocol remains the standard for treating progressive keratoconus. Accelerated CXL seems to be a quick, effective and safe alternative to treat thin corneas. The use of iontophoresis is still being investigated and should be considered with greater caution.

Corneal collagen cross-linking (CXL) is the only conservative treatment currently available to halt keratoconus progression by improving the biomechanical rigidity of the corneal stroma. The aim of this manuscript is to highlight the methods of three different protocols of CXL: conventional CXL (C-CXL), accelerated CXL (A-CXL), and iontophoresis CXL (I-CXL).

원추 각막의 각막 콜라겐 가교의 세 가지 서로 다른 프로토콜 : 기존의가, 가속 및 이온 토 포레 시스

Keratoconus is a bilateral and progressive corneal ectasia. In order to slow down its progression, corneal collagen cross-linking (CXL) has recently been ...

의학

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal abnormalities. In addition, pathological myopia is a common irreversible cause of visual impairment and blindness1-3. Our study demonstrates the effect of scleral crosslinking using riboflavin and ultraviolet-A radiation on the development of axial myopia in a rabbit model. The axial length of the eyeball was measured by A-scan ultrasound in New Zealand white rabbits aged 13 days (male and female). The eye then underwent 360&#176; conjunctival peritomy with scleral crosslinking, followed by tarsorrhaphy. Axial elongation was induced in 13 day-old New Zealand rabbits by suturing their right eye eyelids (tarsorrhaphy). The eyes were divided into quadrants, and every quadrant had two scleral irradiation zones, each with an area of 0.2 cm&#178; and a radius of 4 mm. Crosslinking was performed by dropping 0.1% dextran-free riboflavin-5-phosphate onto the irradiation zones 20 sec before ultraviolet-A irradiation and every 20 sec during the 200 sec irradiation time. UVA radiation (370 nm) was applied perpendicular to the sclera at 57 mW/cm&#178; (total UVA light dose, 57 J/cm&#178;). Tarsorrhaphies were removed on day 55, followed by repeated axial length measurements. This study demonstrates that scleral crosslinking with riboflavin and ultraviolet-A radiation effectively prevents occlusion-induced axial elongation in a rabbit model.

We demonstrate the effect of scleral crosslinking with riboflavin and UVA on an axial elongation rabbit eye. Axial elongation was induced in 13 day-old New Zealand rabbits (male and female) by suturing their right eye eyelids (tarsorrhaphy).

공막 래빗 모델에 축 방향 근시의 예방 리보플라빈 및 자외선-A 방사선을 사용하여 교차 결합

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable tool to evaluate and characterize changes in a variety of retinal and ocular disease and injury models. In light induced retinal degeneration models, SD-OCT can be used to track thinning of the photoreceptor layer over time. In glaucoma models, SD-OCT can be used to monitor decreased retinal nerve fiber layer and total retinal thickness and to observe optic nerve cupping after inducing ocular hypertension. In diabetic rodents, SD-OCT has helped researchers observe decreased total retinal thickness as well as decreased thickness of specific retinal layers, particularly the retinal nerve fiber layer with disease progression. In mouse models of myopia, SD-OCT can be used to evaluate axial parameters, such as axial length changes. Advantages of SD-OCT include in vivo imaging of ocular structures, the ability to quantitatively track changes in ocular dimensions over time, and its rapid scanning speed and high resolution. Here, we detail the methods of SD-OCT and show examples of its use in our laboratory in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia. Methods include anesthesia, SD-OCT imaging, and processing of the images for thickness measurements.

Here, we describe the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to visualize retinal and ocular structures in vivo in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia.

광학 간섭 단층 촬영을 사용한 설치류 모델에서 안구 질환의 생체 내 구조 평가

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...

생체공학

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

초고 해상도 마우스 광학 일관성 단층 촬영 망막 유전자 치료 연구에서 안 구내 주사를 돕기 위해

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

Suprachoroidal 세포 Autograft 건조 연령 관련 황 반 변성에 의해 재생 치료: 예비 Vivo에서 보고서

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in animals is to put clear minus lenses in front of eyes for weeks (lens-induced myopia, LIM). However, extant protocols for inducement and evaluation vary from laboratory to laboratory. Here, we described a highly practical and reproducible method to induce LIM in mice using newly designed eyeglasses. The method fixes the lens stably in front of the mouse eye while allows the lens to be taken off for cleaning or topical drug administration. The phenotype is robust and efficient, and the variance is small. The method described here can be applied to mice right after weaning which extends the possible duration for experiments. We also gave technical advises for achieving reproducible results in refraction and axial length measurements. We hope the step-by-step protocol described here and the detailed article can help researchers perform myopia experiments with myopia more smoothly and make the data comparable across laboratories.

In this protocol, we describe the full process of experimental myopia inducement in mice using newly designed eyeglasses and the technic needed for achieving stable and reproducible results in ocular parameter measurements.

유도 및 실험적인 근 Murine 모델의 평가

Murine model of myopia can be a powerful tool for myopia research because of the comparatively easy genetic manipulation. One way to induce myopia in ...

신경과학

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...