저자는 데이터의 그녀의 통계 분석에 대 한 수, 박사, 인정 하 고 싶습니다. 저자는 또한에 대 한 그녀의 조언을 마 취 박사 McClure, DVM, 박사 DACLAM, 감사 하 고 통증 관리 프로토콜 연구에 사용. 이 프로젝트는 연구 (12678v)와 USDA 섹션 1433 자금 (2090) 부사장의 웨스턴 대학 보건 과학 사무실에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨스턴 대학 보건 과학에 의해 승인 되었습니다.
1. 격리와 말 탯 매트릭스에서 MSCs의 확장
<ol><li>태 반 (임신) 성인 마 레에서 foaling 관찰 후을 aseptically 탯 태에서 분리 합니다. 탯에에서 계속 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1% 페니실린-스 (P/S)와 4 ° C에서 전송 하는 동안 처리까지.</li>
	<li>실내 온도 PBS 1%로 두 번 탯 워시 50ml 튜브에 P/S. 150 m m와 1 %P / S 50 mL 튜브 2 또는 세 번까지 혈액의 대부분은 밖으로 씻어 서 실내 온도 PBS에 세척에 2 인치 길이의 조각으로 탯 섹션.</li>
	<li>잘라 배를 경도 탯. 2 동맥, 정 맥, 그리고 집게와가 위를 사용 하 여 코드에서 allantoic 줄기를 포함 하 여, 혈관을 제거. 메스로 근 근 의해 150 mm 접시에 젤리 같은 매트릭스 주변 혈관은 탯 매트릭스 (왓슨의 젤리)를 수집 하 고 정밀한 조각으로 젤리를 말하다.</li>
	<li>PBS에서 0.1% (w/v) 콜라 유형 IA 솔루션의 15 mL 50 mL 튜브에 2-3 탯 조각 (약 12-15 g)에서 장소와 튼 젤리 해산 때까지 3-4 h 동안 부드러운 흔들어 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>15 분 동안 300 x g에서 소화 조직 원심 하 고 상쾌한 발음. 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 소화 조직 resuspend P/S, pipetting으로 혼합, 5 분 동안 150 x g에서 원심 및 상쾌한 (세척)을 발음. 세척 두 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>Resuspend 셀 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 세차 P/S, pipetting으로 혼합, 100 µ m 셀 스 트레이너, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기와에 의해 변형 및 상쾌한 발음.</li>
	<li>낮은 포도 당 Dulbecco의 혼합 하 여 배양 (CM) 준비 소 태아 혈 청 (FBS)와 1 %P 수정이 글의 중간 (LG-DMEM) / 미 여과 의해 매체를 소독.</li>
	<li>37 ° C에 미리 데워 CM의 10 mL에 긴장된 셀 resuspend, pipetting으로 혼합, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 전송 및 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 변경 c M 매 3 일 마다 문화 문화 passaged 것 이다 때 70-80%의 합류를 도달할 때까지.</li>
	<li>문화 통로를 플라스 크에서 CM을 발음 하 고 두 번, 실내 온도 PBS의 5 mL로 세척 하 고 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 5 분 동안 37 ° C에서의 3 mL와 분리.</li>
	<li>트립 신/EDTA 37.0 ° C에 미리 데워 CM의 6 mL로 중화 하 고, pipetting으로 혼합 하 고 15 mL 튜브, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 한 상쾌한 발음. Resuspend CM의 1 mL에 분리 된 셀, pipetting으로. Trypan 블루과 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 5, 000 셀/cm2, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 다시 시드해야 하 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어</li>
</ol>2. 키토 산 영화에 교양 UCM MSCs와 Spheroids의 준비
<ol><li>1% (w/v) 키토 산 용액 100 mL를 준비 하려면 99 ml의 증류수 (dH2O), 키토 산의 1 g을 추가 하 고는 자력으로 잘 혼합 합니다.</li>
	<li>빙 초 산의 670 µ L을 추가 하 고 혼합 키토 산 녹이 고 점성 된다 때까지 계속. 이 일반적으로 3-4 시간 걸립니다.</li>
	<li>12 음 조직 배양 플레이트의 각 음에 키토 산 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 접시 키토 산 솔루션을 균등 하 게 배포 하 고 모든 바닥 표면에 소용돌이.</li>
	<li>층 류 24 h에 대 한 하룻밤 커버 없이 캐비닛에서 키토 산 코팅 솔루션 접시 건조. 건조 되 면, 박막 형성 하 격판덮개를 준수 합니다.</li>
	<li>각 우물에 0.5 N 수산화 나트륨 (NaOH) 용액 1 mL를 추가 하 여 키토 산 영화를 중화 하 고 실 온에서 2 h에 품 어. 각 우물에서 NaOH를 발음 하 고 각각을 씻어 세 번 dH2O의 1 mL와 함께 잘. 각 세척 한 번 70% 에탄올 (EtOH)의 1 mL와 함께 잘.</li>
	<li>키토 산 영화를 소독, 층 류 캐비닛에 70 %EtOH 각 잘하고 품 어의 1 mL을 하룻밤 추가 합니다. 다음 날에 각 우물에서 나머지 EtOH를 발음. 각 세척 살 균 PBS의 1 mL 세 번 잘. 키토 산 필름 층 류 커버 없이 하룻밤 캐비닛 아래 자외선으로 소독.</li>
	<li>UCM MSCs의 양식 spheroids, 씨앗 확장 5000 셀/cm2, 각 잘으로 셀 passaged 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 참고: 셀 수 있는 알을 품을 산소 또는 normoxia, 탐정의 관심에 따라.</li>
</ol>3. 표면 마커 Cytometry 통해 분석의 표현
<ol><li>
단일 세포 현 탁 액의 준비
	<ol>
<li>표준 플레이트<ol>
<li>각 우물에서 매체를 제거 하 고 실내 온도 PBS로 두번 세척.</li>
			<li>실 온에서 5-10 분에 대 한 12-잘 접시의 각 음에 셀 분리 시 약의 500 µ L로 세포를 분리 합니다.</li>
			<li>부 화, 후 각 우물에 버퍼 (PBS 0.5 %BSA 포함) 얼룩의 1 ml을 추가 하 고 셀을 분리를 pipetting으로 혼합.</li>
			<li>세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>키토 산 판<ol>
<li>모든 spheroids는 피 펫을 사용 하 여 1000 µ L 팁 발음 매체에 의해 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 수집 된 매체를 전송. 매체를 수집, 후 1 mL PBS의 추가 의해 잘 세척 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 씻어 PBS를 전송 합니다.</li>
			<li>5 분 동안 150 x g에서 spheroids 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
			<li>셀 분리 시 약 (예, accutase)의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 5-10 분 동안 품 어. Pipetting을 사용 하 여 1 mL 팁 spheroids 해리는 더 이상 표시 될 때까지 혼합.</li>
			<li>단일 셀 펜션과 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 얼룩 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀을 세척
	<ol>
<li>상쾌한 원뿔 튜브에서 제거 하 고 다시 감기 버퍼 얼룩의 3 mL에 셀을 일시 중단. 이 단계에서 실험을 통해 아이스 셀을 계속.</li>
		<li>5 분 (세척)에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
		<li>두 번 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포를 얼룩이 지기
	<ol>
<li>5 분 x 300g에 centrifuge 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 다시 일시 중단 1 x 106 셀 50 µ L 차단 (PBS 포함 10% 말 혈 청)를 버퍼링 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>얼음에 1 시간에 대 한 빛에서 보호 품 어 다음 10 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 된 항 체 (CD44, CD90, CD105, CD34, 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 II, 또는 각 항 체 isotype 제어) 및 버퍼, 얼룩의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>감기 버퍼 얼룩의 3 개 mL를 추가 하 고 혼합, 5 분, 300 x g에서 원심 상쾌한 (세척)을 발음.</li>
		<li>두 번 세척을 반복 합니다.</li>
		<li>다시 버퍼를 얼룩이 지기의 0.5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단</li>
		<li>7-AAD (생존 염료)의 5 µ L을 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어</li>
		<li>교류 cytometer에 의해 스테인드 세포 샘플을 분석 합니다. 그들의 작은 SSC와 FSC, 파편을 제외 하 고 7-AAD의 낮은 통풍 관으로 가능한 셀을 식별 합니다. 플롯 FL1 및 FL2에는 y와 x-축, 각각. Isotype 제어를 사용 하 여 대각선 위에 게이트를 만들. 지역에 있는 긍정적으로 얼룩진된 세포의 백분율을 측정 합니다. 적어도 20000 이벤트/샘플 (보충 그림 1)을 계산 합니다.</li>
		<li>실행 가능한 셀 및 자동-형광, 게이팅 하 여 항 체로 얼룩진 셀의 비율 측정 하 고 세포 isotype 제어와 스테인드의 백분율을 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 쥐에서
<ol><li>Sprague Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)을 선택 합니다. 이 모델에 사용 하는 쥐의 비교적 큰 크기 note</li>
	<li>Anesthetize 고 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 쥐 핀치 발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 인공 눈 윤활제를 적용 합니다.</li>
	<li>선제 무 통으로 Meloxicam (1 mg/kg)의 근육 주사를 관리 합니다.</li>
	<li>따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 두 0.5 L 물 병 사이 쥐를 놓습니다. 테이블에 각 말단을 테이프. 저체온증의 위험을 줄이기 위해 버블 랩 (그림 1)와 함께 시체를 커버.</li>
	<li>마 취 5 %sevoflurane 원뿔, 물 난방 패드에 지 recumbency에 동물을 통해 1 L 100% 산소 혼합물에의 지속적인 흐름을 유지 합니다.</li>
	<li>피부 외상을 방지 하려면 수술 사이트를 클립 하지 않습니다. 대신, 두 stifles 이상 머리 제거 크림을 적용 합니다. 혀 억압 물을 사용 하 여 크림 및 머리 제거.</li>
	<li>수술 부위의 액체 digluconate 스크럽, 스크럽 하 고 3 번 70% 에탄올으로 씻어.</li>
	<li>피부는 억압의 craniomedial 측면에 인접 하 원심 방향에서 살 균 #15 메스 블레이드와 incise. 약 1 cm 수준, 슬 개 골의 근 위 절 개를 시작 하 고 약 5 mm tibial 결 절에 원심 확장.</li>
	<li>#15 메스 블레이드와 기본 피하 조직을 확보 하 여 슬 개 골 힘 줄 노출에 피부를 반영 합니다.</li>
	<li>
#15 메스 블레이드를 사용 하 여 소비 세 각 슬 개 골 힘 줄 (1 m m)의 중앙 세 번째 슬 개 골의 원심 부분에서 tibial tuberosity에.
	<ol>
<li>각 사지 (그림 2)에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대해 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어를 맞춥니다.</li>
		<li>힘 줄 (그림 3)의 중앙 부분을 #15 메스 블레이드와 Kirschner 와이어의 각 측에 2 전체 두께 절 개를 확인 합니다. 정밀한 아이리스가 위 (그림 4)와 함께 중앙 섹션 proximally 고 distally resect.</li>
		<li>억압의 근 막을 닫기 전에 5.5에 설명 된 대로 적절 한 치료 그룹에 대 한 응고 (혼합된 셀 펜션과 ACP)를 삽입 합니다. 십자 패턴으로 근 막과 피부 패턴 5-0 polyglactin 910 봉합 (그림 5)를 사용 하 여 피부를 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contralateral 억압에서 절차를 반복 합니다. 참고: 하나의 결함 치료 (줄기 세포 chitosan에 조건 또는 표준 접시에 배양) 무작위로 할당 됩니다. Contralateral 결함은 내부 통제 역할을 빈 남아 있습니다.</li>
	<li>수술 후 관리 enrofloxacin의 4 정제 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) meloxicam의 태블릿 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) 7 일 동안. 이 복용량 실험 동물 수 의사에 의해 권장 되었고 IACUC 프로토콜에 승인.</li>
</ol>5. 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 MSCs의 배달
<ol><li>핀치-발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 슬 개 골 힘 줄 결함 생성에 사용 되지 않는 건강 한 쥐 anesthetize</li>
	<li>수집 5 mL 혈액 심장 펑크에 의해 마 취 Sprague-Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)에서 5 mL 주사기에 산 시트르산 포도 당 (5:1 v/v)의 1 mL를 포함 하는 20 G 바늘.</li>
	<li>Pentobarbital (100 mg/kg), 같은 마 취에서의 intracardial 주입 하 여 심장 펑크와 혈액 수집 후 쥐를 안락사.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 350 x g에서 샘플 원심 상쾌한 전송 및 사용까지 aliquots (120 µ L 각)-20 ° C에서 저장.</li>
	<li>생체 내에 이식 직전 위의 약 수를 녹여 섞어 0.5 x 10와 20 µ L 트립 신/EDTA를 사용 하 여 표준 격판덮개에서 분리 (1.9 또는 3.1.2.1)에서6 MSCs 또는 (PBS/매체)와 홍 조에 의해 키토 산 판에서 수집.</li>
	<li>해 동된 플라즈마는 플라즈마를 활성화 하 고 혈전의 형성을 유발 하 96 잘 접시의 우물에서의 나머지 100 µ L를 6 µ L 10% 칼슘 염화 물 (CaCl2)의 추가 (바른된 플라즈마 활성화: ACP).</li>
	<li>세포 현 탁 액 (20 µ L) 혼합 및 ACP (100 µ L) 형태로 응고 (그림 6). 장소는 억압의 근 막 닫기 전에 만든 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 응고 (단계 4.10.3 참조).</li>
</ol>6. 기능적 결과
<ol><li>통증, 쥐 얼굴을 찡 그리기 규모 (RGS)37,38 에 기반 하 고 이식 사이트 위에 붓기의 표시를 위해 하루에 두 번 쥐를 모니터링 합니다. 참고: 채 점 시스템 (0-6) 보 행 기능 지원 앞 발 타임된 뒷 다리 서 포함 하 여 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) (등반 능력을 초과 표 1)입니다.</li>
	<li>아침에 각 시간 점의 평균 점수를 계산 하기 위해 저녁에 2 개의 뒷 다리 서 활동에 대 한 쥐를 평가.</li>
	<li>성공적으로 도달 상단 두 뒷 다리 사지와 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능에 대 한 쥐를 평가 합니다.</li>
</ol>7. 총 모양 및 슬 개 골 힘 줄의 Histopathology
<ol><li>7 일 (염증 평가)에 쥐를 안락사 또는 (평가 조직 치유)을 28 일 pentobarbital 8 %sevoflurane 2 L 100% 산소 마스크를 통해 전달 마 취 (100 mg/kg)의 intracardial 주입 하 여 치료를 게시.</li>
	<li>안락사 후 슬 개 골-힘 줄-경골 tuberosity 단위 메스와가 위를 걷. 부드러운 조직 및 슬 개 골 힘 줄 제외한 억압, 주위 인 대를 제거 합니다.</li>
	<li>총 모양 및 힘 줄 (그림 7)의 농축에 대 한 각 견본을 검사 합니다.</li>
	<li>힘 줄의 인접 하 고 측면 측면에 5.0 Polydioxanone의 외과 의사 매듭을 배치 하 여 표본 동양. 각 표본 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 용액에 고정 하 고 각 힘 줄의 중간 부분에서 가로 섹션 (5 µ m).</li>
	<li>되며 고 오신, Masson의 Trichrome 표준 프로토콜에 따라 얼룩을 사용 하 여 섹션을 얼룩.</li>
	<li>염증 등 병 적인 변화 뿐 아니라 결함, 내 혈의 존재를 감지 하는 섹션을 검사 합니다.</li>
	<li>콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (표 2)39의 정도에 따라 이전 게시 된 채 점 시스템을 사용 하 여 섹션의 조직학 점수를 평가 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

우리 결국 말에 자연 tendinopathies의 관리에서 후보 접근을 테스트 하는 것 때문에 말 셀이이 프로젝트에 대 한 선정 됐다. 실제로, 말에 힘 줄 부상 있습니다 말 표면 디지털 flexor 및 인간41킬 사이 생물 학적 유사성 때문에 자연 모델 남자에서 tendinopathy의 매력. 세포 표면 마커 CD44, CD90, CD105, CD34와 MHC II immunophenotyping 세포 치료42에 대 한 국제 학회에서 권장 하는 기준에 따라 셀의 선택 했다. 최근 연구에서 eqUCM-MSCs CD44에 대 한 긍정적이 고 부정적인 CD34와 MHC II, 문화 조건에 있었다. 표준 조건 하에서 경작 하는 세포 또한 CD90, CD105, 그로 인하여 표면 마커 표현의 측면에서 MSCs에 대 한 기준을 충족에 대 한 긍정적인 했다. 또한,이 연구 eqUCM-MSCs 키토 산 영화, 인간의 MSCs19,20이전 보고서 확인에 교양 때 spheroids의 형성에 첫 번째 보고서입니다. 3D 세포 배양 기술 있다 생리 적 틈새를 닮은 환경을 만드는 것을 목표로 하는 수십 년 동안 광범위 하 게 탐험 되었습니다. 실제로,이 학문은 보여주었다 Oct4, Sox2및 Nanog, 및 향상 된 차별화의 향상 된 stemness 유전자 식 수준 잠재적인, 어떤 다른 보고서19,20와 일치 하는. 다른 향상 된 immunomodulatory 속성43 및 유리 모양의 연골 재생44 MSCs spheroids를 사용 하 여 보고. 기법으로 다양 한 3D 문화 스피너 플라스 크, 회전 셀 bioreactors, 비 부착 판, 천연 및 합성 행렬, 키토 산 영화 여러 가지 이유로 매력적 보인다. 이 방법은 고가의 장비를 필요로 하지 않습니다 하 고는 비용에 비해 비 부착 판 합성 매트릭스, 키토 산 이기 때문에 해산물 업계의 부산물. 키토 산 영화에 세포를 배양 하는 것은 기술적으로 쉽다입니다. 결합, 이러한 장점을 대규모45에 임상 응용 프로그램을 허용할 것입니다.
양측 슬 개 골 힘 줄 모델 제안 여기 병 적 측면에서 허용 나타납니다. 아니 합병증 연구의 최근 연구에서 관찰 되었다. 우리는 결함 감지 biomechanical 및 조직학 변화 허용 하도록 충분히 큰에 의해 유도 된 스트레스 효과의 위험에 특히 염려 했다. 이러한 우려는 크기와 힘 줄의 전 임상 부상 모델에 대 한 성숙에 관련 된 연구에 따라이 연구에 대 한 쥐에 쥐의 선택 메시지가 나타납니다. '창 결함' 또는 중앙 3 슬 개 골 힘 줄 결함 힘 줄 치유와 확대를 공부 토끼46 와 쥐30,31 에서 설명 하고있다. 슬 개 골 힘 줄 '창 결함' 모델 조직학31,39, biomechanical30,31, ex vivo 형광 테스트와 쥐에 있는 힘 줄 수리 공부에 대 한 재현 발견 되었습니다. 31을이미지입니다. 이 연구에서 결함의 크기, 슬 개 골 힘 줄의 중앙 세 번째에 해당 되었고 템플릿으로 0.99 m m 직경 Kirschner 철사로 표준화 되었다. 이러한 차원 힘 줄 수술 파열을 유발 하지 않고 치유 공부에 적절 한 했다. 크기 때문에 그들의 더 큰 해부학 마우스 대, 쥐 큰 결함, 상해, 치료 납품, 및 측정 결과의 재현성 향상을 수용할 수 있습니다.
이 연구에서는 쥐에 게 투여 하는 진통 프로토콜 RGS37,38와 평가, 수술 후 통증 조절에 효과적 이었습니다. 그것은 이전 유효성 검사를 반영 하는 쥐37,38에 통증 수술 행동 변화를 감지 하기 때문에이 점수 시스템 여기 선정 되었다. RGS 궤도 강화, 코/뺨 병합, 귀/수염 변경 등 식별 하기 위해 비교적 간단한 표시를 기반으로 합니다. 쥐도 더 지원이 진통의 효능이이 연구를 통해 정상적인 음식 섭취 량을 유지. 실제로, 이전 보고서 쥐 meloxicam47같은 비 스테로이드 소염제로 치료에 수술 후 통증과 몸 무게 변화 사이의 상관 관계를 발견 했다. 이 에이전트는이 연구에서 선정 되었다과 선제 관리 쥐37,48 와 개49, 수술 직전 항 염증 성 에이전트의 관리를 발견 되었습니다 연구에서 파생 된 약하게 수술 통증 유발. 함수는 두 골반 사지의 사용을 평가 하도록 설계 채 점 시스템을 사용 하 여 수술 후 통증의 추가 지표로 서 평가 했다. 여기에서 선택 하는 세 가지 활동의 움직임과 골반 팔 다리에 체중을의 지의 범위는 일반적인 평가 제공 합니다. 이 채 점 시스템 쥐50,51 에서 모두 정적 및 동적 기능 복구 연구에서 파생 되었다 하 고 관찰 하는 기능 결과의 시간 과정을 비교 하도록 설계 되었습니다. 점수 표시 양자 힘 줄 결함 7 일, 28 일 이내 정상으로 복귀와 함께 함수에 임시 감소 유도. 기능 점수 통증 보다는 RGS 정형 조건에 보조 탐지에 더 민감한 나타납니다. 비슷한 기능 테스트 평가 하 아 킬 레 스 기능 인덱스28같은 힘 줄 치유, 발 고 보 폭 측정51또는 다른 거시적인 득점 시스템52사용 되었습니다.
이 모델은 연구 결과 치료 힘 줄과 두 줄기 세포 기반 치료 사이 분화 하는 동안에 동물의 수를 줄이기 위해 설계 되었습니다. 이 연구에서 테스트 하는 치료의 효과 다른 게시36에 설명 되어 있습니다. 여기에 사용 되는 모델 biomechanical 비파괴 힘 줄의 28 일 (하지 여기에 제시 된 데이터)와 함께 각 쥐에는 내부 컨트롤의 사용을 통해 치료 차이의 탐지를 허용.
활성화 된 조절된 플라즈마 줄기 세포, 생체 적합성, 접근성, 그리고 tendinopathies,5354의 관리에 현재 임상 응용 프로그램에 대 한 캐리어로 일반적인 사용 때문에 선정 되었다. 그것은 치료 힘 줄의 치유에 기여 하지만, 줄기 세포의 지역 보존을 허용 수 있습니다 그리고 그것은 방해 하지 않는 치료 그룹의 비교 때문에 둘 다 활성화 조건된 플라즈마의 동일한 금액을 포함. 치료 힘 줄의 조직학 특징 어디 괴 사 성 조직 및 방해 콜라겐 번들 제거 됩니다 먹어서 용균성 효소에 의해 세포에 의해 염증 단계, 힘 줄 치유의 이전 묘사와 일치 하는 최대 지속 10 일 부상54,,5556게시물. 증식 단계 세포 확산 및 복구 사이트의 vascularity 가장입니다 28 일 후에 힘 복구57,58에서. 우리는 힘 줄, 횡단면 지역 및 표본의 낮은 탄성 계수의 명백한 두껍게 사이의 상관 관계를 발견. 이러한 결과 바탕으로, 조직학 점수 바람직하지 않을 수 있습니다 biomechanical 강도, 콜라겐 섬유, 신생, 및 chondrogenesis의 해체 등으로 이어질 하지 않습니다 조직 변경 반영 하는 것으로 보인다. 조직학 특징에 따라 치료 차별이 모델 수 tenocytes, 세포 외 매트릭스 조직, proteoglycan 내용의 존재 같은 추가 기준을 통합 하 여 개선 하는 수 있습니다 미래에, 그리고 엘라 스 틴 섬유52,59의 분포.

힘 줄 부상 종1에 걸쳐 상당한 통증과 근육 위축 증의 가장 일반적인 원인 중 하나입니다. 수의학, 경주 말에 모든 상해의 82 %musculoskeletal 시스템을 포함 하 고 그의 46%에 영향을 미칠 힘 줄과 인 대2,3말에 특별 한 관심의 힘 줄 및 인 대 부상 있습니다. 흉터 조직 형성과 치료 힘 줄의 biomechanical 속성에 영향을 미치는 flexor의 힘 줄 부상; 후 운동 사용에 반환에 대 한 경비 예 후를 설명 한다 다시 부상 발생에 2 년 이내 최대 말의 67%4신중 하 게 취급 합니다. 재생 의학 도전 전통적인 치료 조건에 새로운 대안을 제공 합니다. 자가 줄기 세포 치료 몇 가지 고무적인 결과5,6 생산 하지만 조직 컬렉션, 지연 처리/프로그래밍으로 인해 셀, 행정과의 영향와 관련 된 병 적 상태에 의해 제한 되는 줄기의 속성 (예: 연령) 환자의 건강 상태7,8세포. 이러한 제한은 상용 해서도 수용자 줄기 세포를 조사 근거를 제공 합니다. 그들은 윤리적 문제 및 기형종의 배아 줄기 세포와 관련 된 위험을 회피 하기 때문에 태아 adnexa 파생 셀 매력적인 후보자 이다. 태아 adnexa 가운데 탯 매트릭스 (UCM)와 튼의 젤리 라는 풍부 하 고 수집 하기 쉬운입니다.
셀 소스에 stemness 강화 allogenic 재생 의학을 위한 세포 은행 확립에 필수적 이다. 기능 관점에서 stemness 자체 갱신 및 다중 계보 분화9에 대 한 가능성으로 정의할 수 있습니다. Stemness의 증거 분석, 유전자 마커 Oct4, Sox2, 및 Nanog9의 식 함께 확산 및 감 별 법에 의존합니다. 한 전략 stemness 향상을 void 필러와 강화 확산 및 UCM MSCs의 차별화로 생체 재료의 사용에 의존 합니다. 이 방법은 유도 만능 세포로 성숙 세포를 재 설 정할 transcriptional 요인의 조작에 관한 우려를 제거 합니다. 생체 줄기 세포에 대 한 잠재적인 운반대로 간주, 중 키토 산 생체 적합성과 분해성10매력적 이다. 이 자연 aminopolysaccharide 카이, 두 번째 가장 풍부한 천연 다 당 류 주로 조개10의 subproduct로 얻은 알칼리 성 deacetylation에 의해 형성 된다. 우리 이전에 MSCs 및 키토 산 건설 기계 사이의 상호 작용을 조사 하 고 spheroids11,12,13,,1415, 의 형성 관찰 16. 우리는 또한 키토 산 행렬12,13,14,15,,1617, chondrogenesis의 우수성에 보고 18. 최근에, 2 개의 독립적인 연구 지방 조직에 의해 spheroids 형성을 설명 하 고 태 반 조직 유래 키토 산 영화19,20에 경작 하는 MSCs. Spheroids의이 형성 뿐만 아니라 stemness, 강화 하지만 또한 생체 내에 이식20후 줄기 세포의 보존을 향상.
정도와 병 종에 걸쳐 tendinopathy의 tendinopathies의 병 태 생리학을 연구 하 고 줄기 세포 주사 등 새로운 치료법을 테스트 실험 모델의 개발 라는 메시지가 있다. 말, 콜라 유도 염증이 생길 수도 힘 줄 수리21에서 MSCs를 사용 하 여 효능을 입증 하는 일반적인 모델입니다. 이 접근의 관련성, 주사는 급성 염증 성 변화를 일으킬, 임상 tendinopathies 만성에서 일반적으로 발생 하는 반면 팽팽하게22,23. 또한, 힘 줄 질환의 화학 유도 치료 응답을 유도 하 고 임상의 경우22,23에 장애인된 치유 과정을 복제 하지 않습니다. 표면 디지털 flexor의 힘 줄의 세그먼트의 절단 말24에 염증이 생길 수도의 외과 모델로 설명 하고있다. 더 최근에, 최소로 침략 접근 표면 디지털 flexor의 힘 줄25의 중앙 코어를 외상 성 손상 제한 하 사용 되었다. 외과 모델 자연 힘 줄 질환으로 이어질 수 있는 손상 만든25의 범위 내에서 재현성 부족 경향이 피로 메커니즘을 시뮬레이션 하지 않습니다. 모델, 병 적 상태 및 힘 줄의 말 모델와 관련 된 비용에 질병 vivo에서 새로운 치료의 평가 대 한 첫 번째 단계로 설치류 모델에 대 한 관심을 정당화 하는 추가 제한이 있습니다.
설치류의 실험 모델의 주요 장점 중 하나 비용과 간 개별 가변성을 제어 하는 기능으로 이루어져 있다. 설치류 그들의 빠른 성장 속도로 인해 다양 한 생리 적인 요인에 관하여 표준화 수 고 상대적으로 짧은 수명을, 변이의 소스를 제한 및 그러므로 차이 감지 하는 데 필요한 동물의 수를 감소. 설치류에 힘 줄 질환을 유도 하는 전략 부분 힘 줄 결함21의 외과 생성 뿐만 아니라 화학 유도에 의존 했습니다. 외과 모델 자연 tendinopathies 화학 모델 보다 더 나은 시뮬레이션 수 있습니다 하지만 더 높은 사망률 및 손상 된 힘 줄의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다. 그 점에서 쥐 조직 치유의 평가 촉진 함으로써 더 큰 결함의 생성을 허용 하는 그들의 크기가이 모델에 대 한 마우스 보다 더 나은 후보를 보인다. 4 주요 힘 줄 그룹에서 tendinopathies의 실험 연구에서 사용 된 Sprague-Dawley 쥐: 회전자, flexor, 아 킬 레 스, 그리고 슬 개 골 심 줄26. 이 중, 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델은이 힘 줄의 더 큰 크기와27에 액세스의 용이성 때문에 특히. 슬 개 골 힘 줄 tibial tuberosity에 quadriceps 근육을 연결합니다. 이 신 근 메커니즘 내에서 슬 개 골은 sesamoid 뼈는 허벅지 근육의 동작을 지시 하 고 슬 개 골 힘 줄의 인접 정도 구분. 슬 개 골 힘 줄의 인접 하 고 말 초 범위에서 뼈 앵커의 존재 biomechanical 테스트를 지원합니다. 일반적으로 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델 contralateral 그대로 힘 줄 컨트롤28,29봉사와 일방적인 외과 결점에 의존 합니다. 가장 일반적인 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에서는 contralateral 슬 개 골 힘 줄은 그대로 동안 tibial tuberosity의 삽입에 슬 개 골의 원심 꼭대기에서 슬 개 골 힘 줄의 중앙 부분 (폭에서 1 m m)를 절 개 합니다. 측정 결과의 조직학, 비-파괴적인 biomechanical 테스트 또는 biomechanical 테스트 실패, 초음파 영상, ex vivo 형광 이미징, 총 관찰, 그리고 기능 테스트28,30 포함 ,31. 일방적인 모델 같은 동물 내에서 유사한 상해의 보수 관리와 제안 된 치료의 비교를 허용 하지 않습니다. 마찬가지로, 여러 치료 간의 비교는 별도 동물을 필요합니다. 양자 모델 간 개별 변이 제거 하 고 연구32에 필요한 동물의 수를 줄일 것 이다. 그러나, 양자 상해 사망률을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 양자 lameness 치료 평가 방해 수 있습니다. 몇 가지 연구 짧게 페리 요원 관리 보다는 오히려 치료의 효과 모델33,34의 병 적에 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 쥐 하지만 초점에의 사용을 보고합니다.
이 연구의 장기 목표는 UCM MSCs allogenic 이식에 운명의 stemness 그리고 vivo에서 생존을 개량 하는 전략을 개발 하는 것입니다. 이 목표를 달성 하기 위해 우리 최근 키토 산 영화와 인큐베이션 hypoxic 환경35아래에 spheroids의 형성에 의해 UCM MSCs의 향상 된 stemness을 보고 있다. 이러한 생체 외에서 속성은 관련 된 슬 개 골 힘 줄 결함 조건된 UCM으로 치료의 향상 된 biomechanical 속성-MSCs. 이러한 결과에 기반, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 후보 테스트에 적합 한 것 힘 줄 부상36에 대 한 치료입니다. 연구의 목적은 여기 격리 및 특성화 UCM MSCs의 줄기 세포, 창조 및 양측 슬 개 골 힘 줄 결함, 그리고 수술 후의 치료에 대 한 생물 학적 전달 시스템의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 보고 복구 및 조직 결함 내 치유의 평가 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

재생 의학 조건 전통적인 치료에 도전 하는 새로운 대안을 제공 합니다. 정도와 종에 걸쳐 tendinopathy의 사망률이 조직의 한정 된 치료 속성 결합, 세포 치료에 대 한 검색 메시지가 있고 그들의 효능을 연구 실험 모델의 개발을 추진. 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSC UCM)는 매력적인 후보 때문에 풍부 하 고, 수집, 윤리적인 우려 및 기형종 형성의 위험 회피 아직 원시적인 배아 줄기 세포를 더 밀접 하 게 닮은 쉽게 보다 성인 조직 유래 MSCs 상당한 관심은 회전 타원 체 형성을 통해 MSCs의 재산을 강화 하는 전략으로 키토 산에 집중 했다. UCM-MSCs을이 종이 세부 기법 키토 산 필름 spheroids를 준비 하 고 표면 마커 식에 회전 타원 체 형성의 효과 분석. 따라서, 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델의 창조는 UCM MSC spheroids 키토 산 필름 형성의 vivo에서 이식에 대 한 설명 되어 있습니다. 아니 합병증 관찰 되었다 병 적 상태에 관하여 연구에서 스트레스 상승 효과, 또는 조직 감염. 7 일 운영된 쥐의 총 기능 점수 정상 쥐 보다 낮은 했지만 수술 후 28 일 이내 정상으로 돌아왔다. 조직 치유의 조직학 점수 7 일 평가 처리 결함에 응고 이물질 반응, 그리고 28 일에 치료 진행의 부재의 존재를 확인 했다. 이 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 각 쥐에는 내부 통제의 창조를 통해 간 개별 변형 제어, 수용 병 적 상태와 관련 된 되었고 치료 힘 줄과 치료의 차이점의 탐지를 허용.

현재 연구에서 결과 ± SD (표준 편차)를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 셀 6 mares의 탯에서 고립 되었다 및 표준 또는 키토 산 컨디셔닝에서 각 세포 표면 마커를 표현 하는 격리 된 셀 라인의 비율 비교 했다 프리드먼 테스트와 함께 비패라메트릭 분산 분석으로 반복 측정 한다입니다. 힘 줄 결함 모델 생성 8 쥐 7 일 수술 후 평가 위해 사용 되었다 및 12 쥐 28 일 평가 위해 사용 되었다. 기능 결과의 결과 ± SEM (뜻의 표준 오류)을 의미 하는 대로 표시 됩니다 하 고 t-검정을 사용 하 여 비교. UCM은 셀룰러 소스 그것의 풍부, 수집, 및 다른 태아 adnexa 소스40기준으로 우수한 확산의 용이성으로 인해로 선정 됐다. UCM 표준 접시에 배양에서 분리 된 세포 확장에 걸쳐 구와 같은 모양을 유지. 셀 키토 산 판 (그림 8)에 경작 하는 때 spheroids를 형성 했다.
표준 조건 하에서 경작 하는 세포의 대부분 표현 CD44 (98.6 ± 1.62%), CD90 (88.7 ± 3.04%), 그리고 CD105 (77.9 ± 6.84%), 표현 CD34의 동안 (0.07 ± 0.17%)와 MHC II (1.33 ± 1.12%)은 매우 낮은. 바른된 문화, CD44 식 수준 아래 (97.0 ± 2.12%)와 CD34 (1.13 ± 1.58%) 식 수준의 CD90 동안 표준 문화에서 차이가 없 (33.3 ± 37.1%)와 CD105 (54.0 ± 19.0%) 감소와 MHC II (2.84 ± 0.98%) 증가35.
절연 및 UCM MSCs에서 생체 외에서의 특성을 다음 조건된 셀의 생물 학적 행동 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에 표준 조건 하에서 경작 하는 세포의 비교 되었다. 치료 되지 않는 결함 각 쥐에 내부 통제로 봉사 했다. 붓기는 수술 후 모든 쥐에 최소한의 고 48 시간 이내에 해결. RGS에 따르면 쥐의 통증이 나 조 난 신호를 표시 하는 같은 궤도 강화, 코/뺨 병합, 또는 귀/수염 변경. 모든 쥐에 사용 3-4 알 약의 정상적인 범위 또는 사료 연구를 통해 매일 15-20 그램. 총 기능 점수 지원 포함 하 고 남의 뒷 다리 뿐만 아니라 점수를 등반으로 서 정상적인 쥐 7 일 운영된 쥐에 비해 높았다 (n = 8, p < 0.0001, 표 3). 그러나, 총 기능 점수 수술 후 28 일 이내 정상에 반환 (n = 12, p = 0.78). 따라서, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 간 개별 변화를 제한 하 고 중요 한 병 적 상태 (비디오 1-5)을 유발 하지 않고 동물의 필요한 수를 감소에 대 한 효과적인 것으로 표시 되었습니다.
28 일 수집 된 힘 줄의 약 37% 현저 하 게 두꺼워 (그림 7) 등장. 이 두껍게 빈 및 처리 결함 사이 동등 하 게 배포 했다. 총 조직학 점수 치료 결함에 시간 증가 (n = 20, p 0.0034 =). 연골 형성, 7, 28 일 사이 증가 이루어져 있었다 때 치유 점수의 각 구성 요소는 평가 하지 독립적으로 시간 변경 하는 유일한 매개 변수 (n = 20, p < 0.0001). 신생 시간과 함께 증가 하는 경향이 (p = 0.3), 콜라겐 형성을 다 하지 않았다 (p = 0.69). 조직학 검사, 염증 치료의 존재에 수술 후 7 일에 시험 하는 힘 줄의 조직 단면도의 모든 관찰 되었다. 혈 종 모든 취급된 결함에 존재 했다입니다. 조직학 신생 점수 1, 0에서 배열 했다 (표 2, 그림 9) 적당 한 되 고 모 세관 침투, 콜라겐 등급 점수 (표 2, 그림 10) 동안 3 전체, 2에서 배열 했다 제안 제안 광범위 한 중간 콜라겐 형성입니다. 연골 형성 점수 (표 2, 그림 11) 연골 형성의 25% ~ 50% 힘 줄 섹션 영역의 중간에 전혀 연골 형성을 제안 하는 2 0에서 배열 했다. 모든 조직학 수치는 힘 줄의 중간 부분의 가로 섹션의 중간 양상으로 위쪽과 앞쪽 측면으로 왼쪽으로 향하게.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig1.jpg"> 그림 1: 쥐와 무 균 수술에 대 한 준비의 위치. 각 쥐 0.5 L 물병 두 따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 사이 배치 했다. 테이블에 각 쥐의 사지 녹화 했다 고 본문은 버블 랩으로 덮여. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig2.jpg"> 그림 2: 슬 개 골 힘 줄 (맞춤)의 외과 모델. 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어는 각 사지에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대 한 정렬 됩니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig3.jpg"> 그림 3: 슬 개 골 힘 줄의 (절 개) 수술 모델. 2 전체 두께 절 개 힘 줄의 중앙 부분을 Kirschner 와이어의 양쪽에 만들어집니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig4.jpg"> 그림 4: 슬 개 골 힘 줄의 (절제술) 수술 모델. 중앙 섹션 proximally 고 distally, Kirschner 와이어의 크기를 일치 하는 결함을 만드는 절제입니다. 절제 지역 점선 상자 안에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig5.jpg"> 그림 5: 운영된 stifles의 수술 모습. 근은 십자 패턴으로 닫히고 피부 피부 패턴으로 폐쇄 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig6.jpg"> 그림 6: UCM MSCs의 배달에 대 한 활성화 조절된 플라즈마의 준비. 줄기 세포 조절된 플라즈마 활성화 이전에 중단 되었다. 그 결과 응고 슬 개 골 힘 줄 결함에 삽입 되었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig7.jpg"> 그림 7: 총 정상 (C, D)의 모양 및 (A, B) 두꺼워 힘 줄. (A, C) 후부 보기; (B, D) 측면 보기; 블록 화살표는 경골을 식별 하 고 얇은 화살표 힘 줄을 식별 합니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig8.jpg"> 그림 8: 조직 문화에 배양 세포의 형태학 접시 19% 미만 산소 수준 (표준 그룹: A) 키토 산 영화 미만 5%와 산소 수준 (조건된 그룹: B). 스핀 들 표준 그룹 (A)에 형성 했다 세포 분리 및 형성 조건된 그룹 (B)에 spheroids. 눈금 막대 400 µ m = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig9.jpg"> 그림 9: 대표 현미경 신생 등급에 대 한 사용 빛. 치유의 7 일, 다음 치료와 힘 줄 조절된 세포 (C, F) 또는 표준 세포 (B, E) 각각 0.5와 0의 등급을 받은 반면 0 (A, D)의 급료를 받았다. 28 일, 치료 힘 줄 (G, J)와 그 조절 세포 (난,L) 또는 (H,K) 표준 셀 각각 1.0과 0.5의 점수를 받은 반면 0 등급을 받았다. 화살표는 혈관 힘 줄 샘플에 존재를 식별합니다. 100 배 확대 혈관을 가리키는 화살표가 400 배 확대에 혈관을 가리키는 같은 화살표에 해당 합니다. (M, N)에 티슈를 정상 힘 줄 Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig10.jpg"> 그림 10: 대표 콜라겐 등급에 사용 하는 현미경 빛. 치유의 7 일, 다음 치료와 힘 줄 (B, C, E, F) 치료와 함께 그 3.0의 등급을 받은 반면 2.5 (A, D)의 급료를 받았다. 28 일, 치료 힘 줄 (G, J) 반면 그 조건 (I, L) 세포 또는 1.0 및 3.0의 표준 셀 (H, K) 받은 점수 각각 3.0 등급을 받았다. 힘 줄 섬유의 해체는 400 X 인세트 (H, K)에서 감상할 수 있습니다. 정상 힘 줄 조직 (M, N) Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig11.jpg"> 그림 11: 대표 현미경 연골 등급에 대 한 사용 빛. 치유의 7 일, 다음 치료 (A, D), 그와 함께 힘 줄 조절 세포 (C, F) 또는 표준 세포 (B, E), 모든 0의 등급을 받았다. 반면 그 조건 (I, L) 세포 또는 0과 2.0의 표준 셀 (H, K) 받은 점수 각각 28 일, 치료 힘 줄 (G, J) 1.0, 등급을 받았다. 화살표는 chondrocytes 힘 줄 샘플에에 향하고 있습니다. 100 배 확대에 chondrocytes을 가리키는 화살표가 가리키는 400 배 확대에 chondrocytes 같은 화살표에 해당 합니다. 정상 힘 줄 조직 (M, N) Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
비디오 1: 쥐에 외래 함수 계산. 남의 뒷 다리 서 타임 (1-5 s: 점수 1) post-operatively 4 h를 관찰 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_1.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 2: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 도움의 앞 발과 뒷 다리 서 시간 (0-5 s: 점수 0) 4 h operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_2.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 3: 쥐에 외래 함수 계산. 남의 뒷 다리 서 타임 (1-5 s: 1 점수), 지원의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (5-10 s: 1 점수) 14 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_3.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 4: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 지원의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (10-15 s: 2 점수), 17 cm 플라스틱 케이지 벽 등반 능력 없이 (아무 등반: 점수 0) 27 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_4.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 5: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 도움의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (5-10 s: 1 점수), 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능 (예: 1 점수) 14 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_5.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>기능 테스트</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>점수</td>
		</tr>
<tr>
<td>뒷 다리 서 보조</td>
			<td>0-5 s</td>
			<td>> 5-10 s</td>
			<td>> 10-15 s</td>
			<td>> 15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>남의 뒷 다리 스탠드</td>
			<td>0-1 s</td>
			<td>> 1-5 s</td>
			<td>> 5 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>상승 능력</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>총</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 쥐에 있는 보 행 기능을 평가 하는 시스템 점수. 채 점 시스템 (0-6) 외래 함수 초과 뒷 다리 서 앞 발 지원 등 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) 등반 능력을 초과 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="6">콜라겐 학년</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="5">일반 콜라겐 tangentially 지향</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="5">콜라겐 섬유 조직을 파괴 하는 25% 보다 적은 가벼운 변화</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="5">25%와 50% 사이 콜라겐 섬유와 온건한 변화 무질서</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="5">콜라겐 조직을 파괴 하는 50% 이상 표시 변경</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">신생의 정도</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="5">보통 침투 arterioles와 조직의</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="5">모세 혈관의 존재</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="5">아니 맥 관 구조 침투</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">연골 형성</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="5">전혀 연골 형성</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="5">절연된 유리 모양의 연골 혹</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="5">보통 연골 형성 25% ~ 50%의</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="5">광범위 한 연골 형성, 관련된 분야의 50% 이상</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 등급을 득점 하는 조직학. 섹션의 조직학 점수 콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (로젠바움 외. 에서 적응의 정도에 따라 등급이 매겨 했다 39)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>그룹</td>
			<td>± Sem의 의미</td>
		</tr>
<tr>
<td>일반 (n = 3)</td>
			<td>6.00 ± 0.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>수술 후 7 일 (n = 8)</td>
			<td>2.25 ± 0.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>수술 후 28 일 (n = 12)</td>
			<td>5.83 ± 0.24</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 정상 쥐와 치료 쥐의 기능 점수. 정상적인 쥐와 치료 쥐 7과 28 일의 기능 점수 postoperatively 등급 했다. n = 쥐의 수.
보충 그림 1: 게이팅 전략 및 표면 마커 식의 예: 파편은 작은 FSC 그리고 SSC (A)에 따라 제외 했다. 라이브 셀 7-AAD FL3에 의해 감지 된 부정적인 얼룩이 지기에 따라 선정 됐다 (B). Isotype 일치 제어 (C)는 부정적인 컨트롤로 CD44 FITC 긍정적인 세포 (D)의 게이트를 만드는 데 사용 된.

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Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

evaluation-stem-cell-therapies-bilateral-patellar-tendon-injury-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K 조회수.  Western University of Health Sciences. 이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

연구

의학

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

쥐에 심각한 척수 손상의 타박상 모델

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

무선 원격 측정 시스템은 척수 절개 및 배아 신경 세포 이식 줄기와 흰쥐의 심장 혈관 기능을 모니터링 할 수

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

효능 평가<em&gt; H. 파이로리</em동소 이식 쥐 모델에서 방광암의 치료를위한 치료 도구로&gt; 단백질 HP-NAP

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers and general hand function. Injuries to the FTs are common, and satisfactory healing is often impaired due to excess scar tissue and adhesions between the tendon and surrounding tissue. However, little is known about the molecular and cellular components of FT repair. To that end, a murine model of FT repair that recapitulates many aspects of healing in humans, including impaired range of motion and decreased mechanical properties, has been developed and previously described. Here an in-depth demonstration of this surgical procedure is provided, involving transection and subsequent repair of the flexor digitorum longus (FDL) tendon in the murine hind paw.&#160;This technique can be used to conduct lineage analysis of different cell types, assess the effects of gene gain or loss-of-function, and to test the efficacy of pharmacological interventions in the healing process. However, there are two primary limitations to this model: i) the FDL tendon in the mid-portion of the murine hind paw, where the transection and repair occur, is not surrounded by a synovial sheath. Therefore this model does not account for the potential contribution of the sheath to the scar formation process. ii) To protect the integrity of the repair site, the FT is released at the myotendinous junction, decreasing the mechanical forces of the tendon, likely contributing to increased scar formation. Isolation of sufficient cells from the granulation tissue of the FT during the healing process for flow cytometric analysis has proved challenging; cytology centrifugation to concentrate these cells is an alternate method used, and allows for generation of cell preparations on which immunofluorescent labeling can be performed. With this method, quantification of cells or proteins of interest during FT healing becomes possible.

Flexor tendons in the hand are commonly injured, leading to impaired hand function. However, the scar-tissue healing response is not well characterized. A murine model of flexor tendon healing is demonstrated here. This model can enhance overall understanding of the healing process and assess therapeutic approaches to improve healing.

쥐의 굴근 힘줄 손상 및 복구 수술

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

풍선-기반 부상 마우스 복 부 대동맥에서 Myointimal 증식을 유도 하

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

쥐의 심근 허혈 재관류 후 관상 동맥 흐름 예비의 평가

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...