오르가노이드는 기본 구조 조직뿐만 아니라 생체 내 장 상피의 많은 분자 특징을 재구성하기 때문에이 기술은 실험실에서 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구 할 수 있게합니다. 이 기술의 주요 장점은 낮은 세포 독성을 가진 매우 효율적인 트랜스듀션 접근법을 사용하여 유기체를 유전적으로 설계하여 이러한 유전자 조작 된 오르가노이드의 기능적 연구를 가능하게하는 능력입니다. 이 기술의 의미는 우리가 마약 및 그밖 에이전트 또는 내정간섭에 장 기관가노이드를 드러날 수 있기 때문에 장 질병을 위한 치료로 확장합니다.
이 방법은 유방 조직과 같은 오르가노이드 배양또는 표준 2D 조건하에서 성장하는 세포에 대한 다른 시스템에서 발달 및 병리학 적 과정을 연구하기 위해 적용 될 수있다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인은 엔지니어가 어려운 오르가노이드 또는 다른 세포에서 트랜스듀션으로 성공할 것입니다. 우리는 먼저 우리가 우리의 유기체와 줄기 세포를 변환하는 어려움을 만났을 때이 방법에 대한 아이디어를 했다.
이 방법의 시각적 데모는 극저온 절개를 위해 지하 매트릭스에 포함 공정 중에 샘플이 제대로 처리되지 않으면 오르가노이드의 구조적 손실이 발생할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 바이러스 성 트랜스듀션을 위한 오르가노이드를 성장시키기 위해, 48웰 플레이트에서 잘 당 200 마이크로리터의 트랜스듀션 배지를 가진 종자 오르가노이드 세포 배양, 표준 조직 배양 배양인에서 배양한다. 48웰 플레이트에서 각각의 우물의 전도를 위해 농축 바이러스의 약 50 마이크로리터를 허용하는 트랜스듀션을 위한 바이러스의 해동 유리병.
1.5 밀리리터 튜브에서 바이러스를 자기 나노 입자 용액의 12 마이크로 리터와 혼합하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다. 15분 후, 자기 나노입자 용액및 바이러스 혼합물을 세포에 추가하여 유도한다. 48웰 플레이트를 마그네틱 플레이트에 놓고 표준 조직 배양 배양인인 배큐베이터에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
바이러스 성 형질 전환이 완료되면 감염된 오르가노이드 세포 클러스터 및 트랜스듀션 배지를 각각 웰에서 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 5분간 500배 g의 원심분리기. 상체를 부드러운 흡입으로 버리고 얼음에 펠릿이 들어있는 튜브를 5 분 동안 식힙니다.
각 튜브에 120 마이크로리터의 지하 멤브레인 매트릭스를 추가하고 천천히 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 분리합니다. 새로운 48웰 플레이트에 매트릭스 세포 혼합물의 30 마이크로리터 방울을 종자. 매트릭스가 고화될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 5~15분간 배양합니다.
각 우물에 트랜스듀션 배지를 추가하고 표준 조직 배양 인큐베이터에서 3~4일 동안 배양합니다. 3~4일 후에는 세포 클러스터를 오르간성 구조로 조직할 수 있도록 10배 배율로 광 현미경으로 배양을 검사합니다. 유기 배양 ENR 배지의 250 마이크로 리터로 각 우물의 트랜스듀션 배지를 부드럽게 교체하십시오.
접시를 인큐베이터에 반환합니다. 부드러운 흡입에 의해 ENR 매체를 제거하고 지하 막 매트릭스를 교란하지 않도록주의함으로써이 절차를 시작합니다. PBS 500 마이크로리터로 부드럽게 씻으십시오.
잘 당 4%의 파라포름알데히드 용액의 마이크로리터 1개를 추가하여 오르가노이드를 수정하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 흡입에 의해 파라포름알데히드 용액을 제거합니다. 부드럽게 잘 당 PBS의 마이크로 리터 를 추가 한 다음 부드러운 흡입에 의해 PBS를 제거합니다.
이런 식으로 PBS로 두 번 씻으시면 됩니다. 두 번째 세척에서 PBS를 제거하고 각 샘플에 30% 자당 버퍼1개를 추가합니다. 샘플을 탈수하기 위해 섭씨 4도에서 1 시간 동안 자당에 고정 된 오르가노이드를 배양하십시오.
흡입에 의해 자당 버퍼를 제거하고 각 우물의 매트릭스 층을 덮을 만큼 충분한 포함 화합물을 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 다음으로, 샘플을 영하 80도 의 냉동고에 10분 동안 또는 포함 화합물이 고체와 흰색으로 변할 때까지 놓습니다.
가장자리를 따라 화합물의 최소 용융을 허용하기 위해 실온에 냉동 포함 화합물플레이트를 배치합니다. 메스 나 주걱을 사용하여 우물의 벽에서 블록을 분리하십시오. 용융을 방지하기 위해 신속하게 작동하여 집게를 사용하여 매트릭스 포함 화합물 블록을 제거하고 시편 블록에 배치하십시오.
내장 화합물로 금형을 완전히 채웁니다. 단면에 블록을 사용하기 전에 30 분 동안 영하 80도에서 동결하십시오. 이 프로토콜은 먼저 GFP에 연결된 렌즈바이러스 벡터로 장 오르가노이드를 유도하여 최적화되었습니다.
GFP는 오구체 발달의 각 단계에서 시각화되었으며, 토굴 세포가 낭종과 같은 구조로 구성될 때 또는 오르가노이드가 싹을 형성할 때 나중에 지점을 구성하는 경우를 포함하여 초기단계로 시각화되었습니다. 성공적으로 유도된 장 기관지들은 그 때 포르말린 고정, 저온절면, 면역형광 영상에 의해 분석되었다. 이 이미지에서 핵은 파란색으로 염색되고 녹색은 세포 경계를 구분하는 상피 세포 접착 분자를 나타냅니다.
빨간색은 창세포를 식별하기 위해 리소솜 염색을 나타냅니다. 일단 마스터되면, 트랜스듀싱 오르가노이드는 약 3시간 안에 수행될 수 있고, 오르가노이드 크라지섹션 포함은 약 2 1/2시간 안에 행해질 수 있다. 이 절차를 시도할 때는 지하 매트릭스 시약을 처리할 때 얼음 작업을 하는 것이 중요합니다.
이 절차를 완료한 후, 단백질 또는 세포기관을 검출하는 면역형광 분석 및 기타 방법을 수행하여 국소화 또는 상대적 풍부를 평가할 수 있다. 이 기술은 연구원이 생체 외에서 정상 생물학 과 질병 상태를 탐구하는 방법을 포장하고 또한 생체 내 연구 결과에 대한 트랜스 포이드 오르가노이드 또는 세포가 마우스로 이식 될 수 있는지. 이 비디오를 시청한 후에는 자기 라벨이 부착된 바이러스를 사용하여 저온 절전을 위해 유기체를 유전적으로 설계하는 방법을 잘 이해해야 합니다.
바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행할 때 적절한 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 수행해야 합니다.
