이 프로토콜은 시험관 내 성인 단계에 성숙을 달성하기에 가장 적합한 마우스 태아 장 세포의 문화를 설명합니다. 이 시험관 내 접근법은 이 과정의 변조기뿐만 아니라 빨아 들이는 전환의 분자 메커니즘을 연구하고 실험 동물의 보다 효율적인 사용을 달성하는 데 사용할 수 있습니다. 배아 일 18과 20 사이 늦은 발달 단계에서 1 차적인 장 세포를 사용하는 창자 성숙의 이 체외 모형을 위해 필수적입니다.
두 개의 작은 집게로 장내를 스트레칭하십시오. 위장과 부록을 가이드로 사용하여 소장의 근위와 탈경 부위를 잘라냅니다. 부록을 가이드로 사용하여 결장간격으로 잘라냅니다.
장내를 세로로 열어 두려면 장위를 따라 면도날을 세로로 놓고 면도날을 따라 포셉을 슬라이딩하여 장을 당깁니다. 그 후, 열린 내장을 1센티미터 조각으로 자른다. 얼음 차가운 PBS 10 밀리리터와 함께 3개의 50 밀리리터 튜브를 준비합니다.
소장과 결장의 근위 및 탈경 부위를 튜브로 별도로 옮길 수 있습니다. 추가 마우스의 내장을 해부하면서 얼음에 튜브를 유지합니다. 같은 튜브에 함께 하나의 쓰레기의 모든 장 부분을 수집합니다.
얼음 차가운 PBS로 장 조각을 씻은 후 2 밀리머 EDTA로 30 분 동안 배양하십시오. 조직에서 토굴을 분리하려면 얼음 차가운 PBS와 10 % 송아지 혈청으로 조각을 부분적으로 씻고 70 미크론 세포 여과기를 통해 새로운 튜브로 필터링하십시오. 조직을 두 번 더 세척하고 여과 된 용액을 결합합니다.
4도에서 5분간 150회 G의 토굴을 포함하는 필터링된 용액을 원심분리하여 토굴을 펠릿으로 수집합니다. 15 밀리리터 튜브와 원심분리기로 토굴을 다시 옮킨다. 접시 우물에, 튜브에 필요한 세포 외 매트릭스 젤의 총 양을 추가하고 펠릿을 용해.
용존 된 토굴의 마이크로 리터 20 개를 따뜻한 48 웰 플레이트의 각 우물에 추가합니다. 첫 번째 우물을 도금 한 후, 현미경에서 잘 당 약 250 ~ 300 개의 지하실의 밀도를 확인하십시오. 세포 외 매트릭스 젤이 고화하게하기 위해 10 분 동안 37도 섭씨 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
그런 다음 ENR 매체를 준비합니다. ENR 배지 250마이크로리터를 젤에 각각 잘 넣습니다. 일주일에 세 번 배지를 변경하고 일주일에 한 번 오르가노이드를 통과합니다.
한 달 동안, 각 구절 후 3 일마다, 문화를 분석한다. 각 통과 후 3일 후, 베타 메르카토에탄올 의 2마이크로리터로 보충된 RNA 용해 완충제 200마이크로리터를 첨가하여 RNA를 1개에서 잘 분리한다. 그런 다음, 우물에서 RNA가없는 1.5 밀리리터 튜브로 샘플을 전송합니다.
시험관 내 실험에서, 우리는 생체 내에서 장 성숙을 가속화하는 것으로 알려진 외부 요인의 예로 덱사케토손을 사용했습니다. 단백질을 분리하려면 250마이크로리터의 얼음 차가운 세포 회수 용액을 5개의 유기체 우물에 잘 넣고 15밀리리터 튜브에서 모두 수집합니다. 세포외 매트릭스 젤을 용해시키기 위해 얼음에 적어도 30 분 동안 배양하십시오.
얼음 차가운 PBS로 씻고, 셀 리시스 버퍼 250 마이크로리터를 추가하고, 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 효소 활성을 분석하기 위해 먼저 0.625 의 어금니 성 수완을 pH 6 및 0.05 유당, 자당, 말토세 및 트레할라제의 어야액으로 준비하고 얼음에 보관하십시오. 5.56 개의 어금니 포도당 용액을 초순수 물로 희석하여 5 가지 농도의 솔루션을 확보하여 분석 표준을 준비하십시오.
그런 다음, 96-well 플레이트에, 원고에 따라 표준 및 제어를 포함하여 각각의 기판으로 오르간 용해의 8 개의 다른 그룹을 추가합니다. 섭씨 37도에서 60분 동안 배양하세요. 오가노이드 용액에 존재하는 효소에 의해 생성되는 포도당의 양을 결정하기 위해, 갓 준비된 PGO 색상 용액 200마이크로리터를 신속하게 추가하고 37°C에서 30분마다 450나노미터에서 분광광미터에 흡광을 측정합니다.
이 프로토콜에서 근위 및 탈장장은 E18에서 E20 마우스 태아로 격리되었다. 격리시, 상피 세포는 세포외 매트릭스 젤 돔에서 시드되었다. 약 28~30일의 배양 후, 태아 오르가노이드는 성숙한 성인 상태로 개발되었다.
근위마커 Onecut2및 Gata4는 주로 근위 가구성 배양에서 발현되었고, 말단 마커 Fabp6 및 Guca2a는 대부분 탈구 오르가노이드 배양에서 발현되었다. 태아 마커 락타제, Ass1, Blimp-1 및 신생아 Fc 수용체는 상대적 발현에서 감소했으며, 성인 마커 수크라세 이소말타제, 아르게나아제 2, 트레할라제 및 리소지메는 근해 및 탈구 오르간구 배양 모두에서 시간이 지남에 따라 증가하였다. 외인성의 효력은 반드시 게놈이어야 하는 것은 아닙니다.
태아 마커 Blimp-1의 유전자 발현은 대조군 오르가노이드에 비해 덱사메타손 처리 된 오르가노이드에 대해 12 일째에 감소하였다. 그러나, 성인 마커 의 유전자 발현 및 효소 활성 모두 수크라세 이소말타제가 증가하였다. 이 프로토콜을 사용할 때, 만 늦은 태아 단계 오르가노이드는 체외에서 성인 오르가노이드로 통과 할 수 있다는 것을 깨닫는 것이 중요합니다.
이 문화의 출발점으로 6~10개의 태아의 수는 전체 장내를 사용하여 전반적인 성숙을 연구함으로써 더욱 감소될 수 있다. 이 모델의 번역 값은 높은 그룹 극단 이펙터가 포유류 를 빨아 사이에 보존 되는 과정인 장 성숙을 조절 할 수있는 가능성에 있다.
