유전적으로 형광 단백질로 개별 세포를 표지하고 시간이 지남에 따라 그 세포를 따라, 색종이 마우스는 많은 생물학적 과정에 새로운 통찰력을 공개하는 연구원을 허용했습니다. 당사의 프로토콜은 조직 수집과 이미징 사이의 지연 시간을 최소화하고, 광물화 또는 비미네랄화 된 조직에 적용 될 수 있으며 몇 년 동안 형광을 보존합니다. 이 방법은 적절한 Cre 라인을 사용할 수있는 한 자신의 운명과 그들의 운동학을 연구하기 위해 다른 세포 집단에 적용 될 수 있기 때문에 재생 의학 및 발달 생물학의 모든 영역에 매우 유용합니다.
당사의 단계별 지침은 다른 형광 단백질에 의해 방출되는 형광 신호의 차이를 구별하는 가장 어려운 단계를 보여줍니다. 이미징을 위해 마우스 조직을 준비하여 시작합니다. 최대 45일 생쥐의 연조직 및 미네랄화된 경골과 페모라의 경우, 미리 냉각된 3.7%의 포름알데히드 PBS로 조직을 수정하고 회전기에서 부드럽게 구르면서 6시간 동안 섭씨 4도에서 배양합니다.
45일 이상 마우스로부터 의 경골및 페모라와 같은 미네랄화된 조직의 경우, 수산화나트륨으로 8.05로 조정된 pH로 1리터10%EDTA 용액을 준비하고 포름알데히드를 3.7%로 희석한다. 하룻밤 사이에 3.7%의 포름알데히드 PBS를 섭씨 4도에서 유지하여 조직을 수정합니다. 다음 날, 미리 냉각 된 포름알데히드 EDTA 용액에 넣고 48 시간 동안 회전하면서 섭씨 4도에서 인큐베이션하여 인큐베이션 중에 솔루션을 세 번 교체하십시오.
그런 다음 조직을 미리 냉각 된 30 % 자당에 넣고 용기를 가장자리에 채우고 섭씨 4도에서 밤새 부드럽게 회전하십시오. 아침에, 자당 용액에서 조직을 제거하고 최적의 절삭 온도 화합물의 다섯 밀리리터에 헹구기 위해 집게를 사용하여, 또는 10 월, 몇 초 동안. 10월로 미리 표시된 극저온을 채우고 조직을 바닥에 놓고, 샘플이 너무 오랫동안 실온에 앉아 있는 것을 피하기 위해 신속하게 작업합니다.
금형을 드라이 아이스에 넣고 10월이 응고되기를 기다리며 샘플을 포함시합니다. 샘플을 즉시 사용하지 않으면 섭씨 영하 20도에 보관할 수 있습니다. 금형에서 블록을 제거합니다.
블록 의 상단과 척 사이에 OCT를 적용하고 적어도 5 분 동안 또는 OCT가 완전히 고화 될 때까지 극저온에서 냉각. 샘플 홀더와 블레이드 홀더를 섭씨 영하 20도로 미리 식힌 다음 척 홀더와 블레이드 홀더에 샘플을 넣고 몇 분 동안 평형화할 수 있도록 합니다. 산후 성장 플레이트 분석을 위해 30 내지 160 마이크로미터인 섹션을 준비하십시오.
극저온을 사용하여 블록을 다듬고 조직 섹션을 적절한 두께로 자르고 슬라이드에서 수집합니다. 그런 다음 완전히 건조 할 때까지 실온에서 슬라이드를 건조하고 최대 36 개월 동안 영하 20도에서 보관하십시오. 슬라이드를 사용할 준비가 되면 냉동고에서 꺼내 슬라이드 홀더의 실온으로 가져옵니다.
10월을 제거하려면 파스퇴르 파이펫으로 PBS를 슬라이드에 부드럽게 발라주세요. 160 마이크로미터 두께의 섹션의 경우 슬라이드를 15분 동안 배양하고 액체를 제거하고 신선한 PBS를 5분 더 적용합니다. 60mm 길이의 커버 슬립이 있는 실온에서 75%의 티오디에탄올용용으로 슬라이드를 장착합니다.
먼저 채널 탭에서 RFP 채널을 선택하여 채널의 세부 정보가 라이트 패스 탭에 표시됩니다. 그런 다음 T-PMT 옆에 있는 체크 박스를 클릭합니다. 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 관심 있는 조직을 라이트 패스와 목표 렌즈 사이에 직접 배치합니다.
조직을 현지화하려면 채널 탭의 트랙 제목 아래 YFP 및 CFP 상자를 선택 해제합니다. 트랙 제목에서 T-PMT 채널을 선택한 다음 획득 탭에서 라이브를 클릭하고 화면에서 조직 선택을 시각화하기 위해 T-PMT 채널의 게인을 늘립니다. 슬라이드의 위치를 조정하여 관심 영역을 찾고 적절한 현미경 노브를 사용하여 초점을 맞춥니다.
그런 다음 수집 탭에서 중지를 클릭하여 레이저 노출을 끕니다. 원고 지침에 따라 이미징 매개 변수를 정의하고 필요한 경우 핀홀 크기를 조정합니다. 설정이 확인되어 기록된 신호가 겹치지 않도록 한 다음 채널 탭의 세 채널을 모두 선택하고 스냅 버튼을 누릅니다.
치수 탭의 각 채널 위의 파란색 강조 표시된 상자를 클릭하여 결과 이미지의 표시 채널 사이를 스크롤하고 화면의 채널 간에 수동으로 겹치는지 확인합니다. 신호가 겹치는 경우 매개 변수를 서로 구별할 수 있을 때까지 매개 변수를 재조정합니다. 이 프로토콜은 에피피실 연골에서 연골 세포에 라벨을 부착하고 나이가 들면서 클로날 확장을 시각화하는 데 사용되었습니다.
중앙 단면도는 상근 선각 성장 판에서 십자 인대와 클론을 시각화하여 결정되었다. Col2 양성이고 타목시펜 투여 시 색종이 형광 단백질로 표지된 개별 세포는 클론 확장을 거쳤고 그 후 성장 판에 남아 있었습니다. 형광 신호는 장기 저장 후에 시각화될 수 있습니다.
몇몇 단면도는 준비및 화상 진찰의 앞에 3 년 이상 저장되었습니다. 3차원 재구성은 이미지 분석 소프트웨어로 자동으로 수행되었으며 비디오로 내보냈습니다. 극저온 절개 단계에서 깨진 한 섹션에는 복제 분석을 방지할 수 있는 높은 수준의 재결합영역이 포함되어 있어 이 프로토콜과 함께 발생하는 일반적인 문제 중 하나를 보여 주어 있습니다.
연구 질문에 따라 관심 있는 셀에 특별히 라벨을 붙이는 Cre 라인을 사용하는 것이 매우 중요할 수 있습니다. 따라서 재결합 직후 해당 세포의 형광을 확인하는 것이 좋습니다. 유도형 Cre 라인을 사용하는 것은 비유도성 Cre 라인에서 진행 중인 DNA 재조합이 용액 세포의 형광 프로파일을 변화시켜 복제 분석을 배제할 수 있기 때문에 필수적입니다.
이 프로토콜은 유전자 조작 된 균주, 약리학적 치료, 외과 적 개입뿐만 아니라 준비 된 섹션의 면역 형광 얼룩과 같은 기능적 혼란과 결합 될 수 있습니다.
