연구는 왕의 대학 런던, UCL 포괄적인 암 이미징 센터, MRC와도 (영국); 협회에 암 연구 영국의 EPSRC에 의해 자금에 의해 지원 되었다 건강 연구 (NIHR) 생물 의학 연구 센터 남자와 세인트 토마스 ' NHS 재단 신뢰와 왕의 대학 런던;에 대 한 국립 연구소 의료 공학 부여 번호 WT 088641/Z/09/Z; 아래 Wellcome 신뢰와 EPSRC에 의해 자금에서 우수의 센터 암 연구 영국 종합 프로젝트 상 GOF와 PJB, GOF는 국왕의 건강 파트너 부여. NanoPET/CT 및 nanoSPECT/CT 스캐너 구입 하 고 Wellcome 트러스트에서 장비 부여에 의해 유지 되었다. 표현 하는 작가 반드시 보 건국, NIHR, 또는 DoH의.

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 방법에 의해 암 세포 추적 vivo에서 렌더링 하는 첫 번째 단계 NIS FP 퓨전 기자를 표현할 수 엔지니어링이 필요 합니다. 퓨전 기자에 형광 단백질의 선택은 중요 한 인공 기자 클러스터링, 기능 저하로 이어질 수 있습니다 oligomerizing 형광 단백질으로. 우리는 입증 된 단위체 형광 성 단백질 (와 monomerizing 돌연변이 A206K36,37) mEGFP, mTagRFP, mCherry 등으로 성공을 했다. NIS 인간의 수 또는 실험 및 암 모델의 목적에 따라 마우스 원점 (hNIS 또는 msNIS). 변환 효율성은 일반적으로 다른 암 세포 선 사이 다. 그러나, 생성 된 암 세포 라인 변환 조건 최적화에 대 한 필요성을 줄여이 프로토콜에 FACS에 의해 정화 이후에. 감염의 높은 다양성으로 변환 권장 하지 않습니다 항상 게놈에 여러 구문 통합은 더 원치 않는 관계가 게놈 수정에 뿐만 아니라 더 높은 구조 식에서 뿐만 아니라 발생할. 따라서, polyclonal 불리고 셀 (cytometry에 의해 모니터링) 하는 식의 안정성에 성장 하 고 밝은 클론 FACS에 의해서만 정렬 방지 하 게 중요 하다. 그것은 또한 렌더링 비 기자 기능의 기능 유효성 검사 중요 한 전에 이러한 세포 vivo에서 실험을 위해 사용 해야 합니다. 바이러스 성 유전자 전달에 최근에 개발 된 대안이 이다 유전자 편집 기술38, 바이러스 성 통합 사이트 보다 구체적인 제어를 제공 하. Cytometry와 immunoblotting 식 분석은 중요 하다. Cytometry 수집을 인구 기반 단일 셀 데이터, 예: 시간이 지남에 기자 식 수준에 어떤 드리프트는 여부를 확인할 수 있습니다. 셀은 또한 표면 또는 전체 NIS에 대하여 지시 된 항 체와 스테인드 하지 않으면 FP moiety만,에 의존 합니다. Cytometry 퓨전 기자 무결성에 알리지 않습니다. 반면, immunoblotting 퓨전 기자 무결성에 보고합니다. 국정원과 FP의 분자량 새로 선택한 NIS FP. 공초점 형광 현미경 검사 법 시연 퓨전 기자 colocalization 모든 플라즈마 멤브레인 마커 밀 싹 agglutinin와의 예상된 분자량을 결정 하기 위해 추가 해야 합니다. 셀 라인을 했다. 이 단백질의 대부분에 대 한 예상 되는 휴대 전화 위치 고 후속 기능 유효성 검사에 대 한 전진 이정표를 표시. 최소/아니 국정원-FP이 셀 라인 또는 영향을 미치는 퓨전 기자의 잠재적인 돌연변이 퓨전 기자와 세포 생물학 문제를 나타내는 것이 원형질 막 (예: 내부 세포질 구획에서 서만)에 발견 되었다 경우는 세포내 매매입니다. 그것은 우리가 하지 우리가 지금까지 테스트에 포함 된 암 세포의 경우 관찰: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (인간 흑색 종); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (인간의 유방암); NCI-H1975 (인간 폐암); SK-Hep1 (인간 간 암); 4T1, 4T1.2, 66 cl 4, 67NR, FARN168 (murine 염증 성 유방암); B16F0, B16F3, B16F10 (murine 흑색 종); MTLn3 (쥐 유 방 선 암).
NIS 기능 방사성 NIS 기판으로 이해 분석 실험을 사용 하 여 측정 해야 합니다. SPECT radiotracer 99 mTcO4- 고 발전기 생산 따라서 널리 모든 radiotracer 합성에 대 한 필요 없이 병원에서 뿐만 아니라 데 더 편리한 더 이상 반감기 (6.01 h 99 m 인 Tc 18F 110 분에 비해), 우리 새 NIS FP 표현 셀 라인의 일상적인 기능 유효성 검사가 NIS 기판에 사용. NIS 공동 기판 나트륨과 염화와 NIS 표현 세포의 사전 차단 예상된 감소/폐지 radiotracer 통풍 관의 특이성을 시연 함으로써 radiotracer 통풍 관의 결과. NIS 특이성 시험이 중요 한 유효성 검사 단계입니다. NIS 특이성 실험 하지 감소 radiotracer 통풍 관 각 부모의 셀에 비해 귀 착될 것입니다, 실험 기간 동안 기술적인 오류가 발생 하거나 radiotracer 통풍 관 때문에 NIS 아니었다. 그것은 또한 그는 부모의 셀 선 통풍 관 radiotracer 감소 나트륨 과염소산염 사전 차단 이 생 기능 NIS 식 셀 라인을 식별 것입니다 (예: 자극된 갑 상선 세포6).
이미징이 프로토콜의 중요 한 장점은 3d에서와 시간이 지남에 정보 수집입니다. 이 시간, 그로 인하여 짝된 데이터를 제공 하 고 따라서 간 동물 다양성에 의해 발생 하는 문제 극복에 같은 동물에서 이미지의 비교를 수 있습니다. 이 다른 시간 지점에서 다른 동물 희생에 기반 하는 가장 비 이미징 관련된 전이 평가 방법와 대조. 그림 3B 에서 그것은 분명 얼마나 전이성 확산 및 파생물 개별 동물에 시간이 지남에 진행입니다. PET/CT 영상에서 검색 하는 신호는 기본적으로 NIS 식으로 발생 합니다. 이 암 세포를 NIS을 표현 하는 것에서 모든 신호 뿐만 아니라 endogenously NIS를 표현 하는 모든 기관 포함 됩니다. 일반 생 NIS 신호 갑 상선 및 침 샘, 위, 그리고, 유 방 및 lachrymal 동맥의 일부 지역에서 낮은 수준에서 찾을 수 있습니다. 생 NIS 식 이외에 NIS radiotracer [18F] BF4- 는 또한 그로 인하여 소변 가득 방광에 radiotracer 이해를 설명 하는 신장 통해 배설 됩니다. 신장 통풍 관은 더 이상이 프로토콜 (45 분 게시물 radiotracer 주입6)에서 권장 하는 이미징 시간 시점 감지. 하면 소변 가득 방광에서 신호 한다 신호 대 배경 문제, 이미징 하기 전에 마 취 방광을 기계적으로 비워 수 있습니다. 중요 한 것은, 내 생 신호는 동물 변종 사이의 달라질 수 있습니다. 그것은 또한 주목할 만한 유 방 땀 샘에 내 생 NIS 식 수 조건10에서 더 높을 수 있습니다. 제시 하는 경우에, 성공적으로 (cf. 위의 목록) 전에 특징 그 전이성 세포 라인의 경우에 우리 생 NIS 식 전이 탐지 크게 방해를 찾지 못했습니다. 그것은, 요오드 화물은 갑 상선 호르몬6에 대사 때문에 그 [18F] BF4- 요오드 화물에 비해 암 조직으로 통풍 관에 대 한 더 사용할 수 있다. 이 현상 또한 radioiodide [18F] BF4-6에 비해 혈 류에서 더 많은 양의에 기여할 수 있습니다. 다른 응용 프로그램 (다른 암 또는 비 암 세포 추적 응용 프로그램에서 추적 되는 암 세포)이 다를 수 있습니다, 그리고 그것은 따라서 생 NIS 식이 통해 신호-배경 문제가 발생할 수 있는지를 평가 하 추천 예비 실험입니다. 전 임상 영상에 중요 한 측면은 radiotracer의 어 금 니 활동입니다. 여기 설명 하는 방법을 시작 소재14 GBq 18F- ~1.5를 사용 하 고 크게 이전에 보고 된 대체 방법12위의 어 금 니 활동을 생산 하기 위해 표시 되었습니다. [18F] NIS 표현 조직에 감소 된 통풍 관 BF4- 어 금 니 활동 ≤1 GBq / µ12 에서 생산 될 수 있습니다. 이것은 특히 중요 때 킬로그램 당 방사능의 주입 된 금액은 높은, 즉 때 쥐 같은 작은 동물 들이 몇 군데39; 그것은40를 설정 인간에서 덜 중요 한입니다. 높은 어 금 니 활동은 그러므로 높은-품질 전 임상 애완 동물 화상 진 찰을 위해 필수적. 어 금 니 활동 여는 붕 소 trifluoride 추가 방법14이 프로토콜에는 자동화 된 형태로 표시 되는이 문제를 극복 합니다. 또한, 그것은 [18F] BF4- 합성에 대 한 제시 프로토콜은 좋은 제조 관행 (GMP) 준수 하지 및 따라서이 양식에 인간 임상 시험에 사용 하기 위해 부적 한. (BF4-radiolabel 18F 대체 방법)를 통해 GMP 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수 있는40.
PET/CT 영상 radiotracer 통풍 관, NIS 중재 radiotracer 글귀 NIS FP 표현 암 세포에서 형태소 분석을 나타내는입니다 시각화 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 관련된 애완 동물 신호를 측정할 수 있습니다. 그것은 어떤 잠재적인 배경에서 관련 신호의 일관 되 고 편견 차별화 되도록 신뢰할 수 있는 임계 처리 절차를 적용 해야 합니다. 배경 vivo에서서로 다른 위치에 변화 한다, 그것은 지방/지역 임계 처리 및 세분화를 고려 하는 중요 합니다. 한 그러한 방법에 의해 개발 되었고 오쓰34의 이름을 따서 고 3D 구현 기본 종양과 전이이 프로토콜에서의 3D 렌더링. 일반적으로, 이미지 관찰자에 의해 시각적으로 본 최고의 정량된 % 주입 량 (%ID) 값에 해당 합니다. 이미지 기반 정량화에 관해서는 그것은 또한 그들의 볼륨을 다른 조직의 측정 된 방사능 값을 정규화 하는 것이 중요. 정규화 결과, 볼륨 (예: %ID/mL), 및 (ii) 표준 이해 값 (SUV35) (i) %ID 표현 하는 두 개의 주로 사용된 방법 있다. 그들은 %ID/mL 고려만, 개별 볼륨 SUV 전체 동물에 걸쳐 평균 방사능 기준으로 하는 측정값은 다릅니다. 그것은 또한는 NIS 영상 렌더링 라이브 종양 볼륨 (LTV), 더 이상 수 없습니다 ATP를 합성 하는 죽은/죽어가는 셀 가져올 radiotracer10없기 때문에 주의 하는 것이 중요. 이 종양 세포 죽음/괴의 영역을 나타내는 기본 종양 ("도넛 모양의" 종양) 내 큰 낮은 신호 영역을 설명 합니다. 중요 한 것은, LTV 종양 부담 원유 종양 볼륨 캘리퍼스 측정 액세스할 수 (있는 계정 생존 능력을 고려 하지 않는 표면 종양 지역만 평가)에 비해 훨씬 더 신뢰할 수 있는 측정 했다.
이 듀얼 모드 추적 전략의 주요 장점은 조직 동물 학살 후 수확 할 때 분명 하다. Vivo에서 이미지에 의해 인도 동물 해 부 동안 형광 암 세포에 의해 지원, 작고 깊은 장기/전이 수 또한 안정적으로 수확 될. 냉동된 조직 보존/단면 방법론 가능 하지만 포 르 말린 고정에 비해 감소 구조 조직 보존 안티 GFP 항 체와 얼룩에 대 한 필요 없이 GFP의 직접 형광 이미징 파라핀 끼워 넣어진 방법론 (FFPE)입니다. 후자의 비판적 필요 합니다 또한 안티-FP 얼룩, FFPE 방법 그대로 보존 (고정/탈수/재) 때문에 형광 단백질의와 호환 되지 않기 때문에. 형광 신호는 종양 세포의 존재를 나타내는,이 분류는 수확된 조직 ('biodistribution')의 방사능 측정 ex vivo에 의해 확인 된다 보장 하기 위해 중요 하다. 방사능 측정 ex vivo 형광의 시각적 탐지 따라서 수 암의 식별 그렇지 않으면 들 키 지 않고 남아 있을 것입니다 셀-종속 신호 보다 더 민감합니다. 터미널 세션을 이미징 경우 radiotracer 방사능 측정, 동물 주입, 동물 학살, 시간 뿐만 아니라 주입된 radiotracer 금액 정확 하 게 주의 하는 중요 한 고 섬광 카운터 측정의 보정 수확된 조직입니다. 이것은 radiotracer 부패에 대 한 보정을 보장 하 고 그로 인하여 안정적인 biodistribution 분석을 사용 하는 중요 한입니다.
PET/CT 활성화 이미징 전신 수준에 전이성 확산의 평가 포함 하는 종양 진행의 비-침략 적 3D 정량화를 반복. 이 기능은 종종 시간 포인트를 다양 한 종양 진행의 평가 대 한 안락사는 동물의 큰 동료에 의존 하는 기존의 방법에 비해 상당한 이점을. 이 영상 기반 접근 방법의 장점으로는: (i) 매우 중요 한 비-침략 적 3D vivo에서 정량화, (ii) 동물성 숫자 반복 이미징, (iii) 경도 쌍된 데이터의 취득의 가능성 때문에 상당한 감소 후속 이미징 차례로 더욱 동물 숫자 감소, 간 동물 다양성을 제외 하 여 통계를 개선 하는 세션 (4) 높은 특정 활동, 그리고 (v)에서 [18F] BF4- 의 생산 자동화를 ex vivo 형광 현미경 등 cytometry 방법론에 의해 조직에 확인에 대 한 기본 옵션입니다.
Vivo에서 세포 추적 성장 하는 분야 이다. 그것은 최근 발전 이미징 기술, 향상 된 해상도, 검출 한계 및 (멀티 모달 영상)를 통해 다중 기능 결과에 의해 연료 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 반복 영상 3d에서 자연 암 세포 전이 등 종양 진행을 추적 하기 위해이 개념을 적용. 응용 프로그램의 자연 스러운 암 세포 전이 메커니즘을 탈피 하기 위한 연구를 포함 합니다. 예를 들어 추적 종양 세포 다른 면역 세포 구성 요소 (현재/기능 immunocompromisation의 다른 수준의 동물 변종에) 전이성 프로세스에 미치는 영향을 연구에 사용 될 수 있습니다. 마찬가지로, 개별 유전자, 동물 스트레인 또는 암 세포 선에서의 영향을 공부 수 있습니다. 또한, 제시 프로토콜은 특정 약물 또는 종양 진행에 대 한 치료 개념의 효능 평가/유효성을 사용 될 수 있습니다. 중요 한 것은,이 기자 유전자: radiotracer 쌍 애완 동물 화상 진 찰 (NIS: [18F] BF4-) 응용 프로그램을 추적 하는 다른 셀에도 사용할 수 있는. 예를 들어 여러 셀 요법으로 유망한 치료 접근 신흥 현재는. 세포 치료제 이식42 및 재생 의학43,44 설정 뿐만 아니라 암 치료41 에 대 한 포함 됩니다. 전체-바디에서 vivo에서 세포 추적 안전 평가 및 치료 모니터링에 대 한 개발 및 세포 치료제의 임상 번역에 대 한 점점 더 중요 해지고 있다.

전이성 질환은 대부분 암 관련 된 죽음 1에 대 한 원인입니다. 전이성 프로세스에 광범위 한 연구에도 불구 하 고 동물 모델 시스템에서 암 전이의 신뢰할 수 있는 모니터링은 달성 하기 어렵습니다. 전체-바디 이미징 기술과 멀티 모달 이미징 접근의 최근 발전 비-침략 적 vivo에서 세포 추적2,3,,45를 활성화 했습니다. 후자는 사용할 수 있습니다 비 접촉 존재, 유통, 수량, 및 세포의 생존 능력을 모니터 하는 도구로 서 그리고 반복 해 서 살아있는 동물 또는 인간.
여기 설명 하는 방법의 목적은 경도 및 비 접촉 3D 생활 설치류 종양 모델에서 암 세포를 추적 하는 것입니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 종양 진행 성 전이성 확산을 포함 하 여 3 차원에서 정확 하 게 정할 수 있게 됩니다. 전통적인 이미지 기반 기술에 비해,이 방법은 크게 감소 동물 숫자 정량적 데이터의 수집을 제공 합니다. 이 방법의 또 다른 기능은 조직학 또는 cytometry3,6분석 간소화 된 다운스트림 비보 전 수확된 조직에 추적된 세포 vivo에서 화상의 상관 관계를 수 있다는.
이 방법의 개발에 대 한 근거는 모니터링 및 설치류 종양 모델에서 전체 전이성 프로세스의 정량화를 위한 vivo에서 도구를 제공 했다. 중요 한 것은, 그것은 간 동물 다양성을 줄이는 동시에 동물 사용을 최소화 하도록 설계 되었습니다. 경도 비-침략 적 전신 화상 진 찰은 전이성 파생물, 어떤 글 에 대 한 그것은 시간 및 그 발생의 위치를 정확 하 게 예측 하기 어려운에 게 무척 적합 합니다. 전체-바디 3D 이미징 방법 개발의 센터에 따라서 되었습니다. 이미징 및 다운스트림 ex vivo 조직학 확인, 다중 스케일 듀얼 모드 방사성 핵 종-형광 기자를 기반으로 하는 이미징 접근 했다 잠재력 채택3, vivo에서 전신 간의 규모 격차를 닫습니다. 6.
양전자 방출 단층 촬영 (PET)은 가장 중요 한 3D 전신 이미징 기술은 현재 사용할 수 있는 우수한 깊이 침투와 절대 정량화7 의 해상도 제공 하 고 < 1 m m8,9. 현재, 방사성 핵 종 영상 전체 바디 수준에서 추적 하는 전 임상 세포 밀도 백만의 볼륨 당 ~ 1000 셀에 셀 세포3,6 서브 밀리미터 지역에서 해상도와 안정적으로 검색할 수 있습니다. Intravital 현미경 검사 법, 달리 단일 퍼지는 암 세포를 감지할 수 없습니다 하지만 수술 절차 (예: 창 챔버)을 필요로 하지 않습니다, 보기의 작은 분야 그리고 낮은 조직 침투와 분산형 국한 되지 않습니다. 생물 발광 영상 저렴 한 대안을 제공 하지만 가난한 깊이 침투 뿐만 아니라 분산형 및 빛 흡수 문제를 연관 이며 따라서 정량화2심각 하 게 제한. 하지만 형광 전신 영상 3D 이미지의 수집에 대 한 사용 되는 그것은 훨씬 덜 민감한 생물 발광 또는 방사성 핵 종 기술2에 비해. 그럼에도 불구 하 고, 형광 cytometry 또는 현미경 다운스트림 조직 분석 비보 전 을 수행할 기회를 제공 합니다. 후자는 거시적인 전신 영상 (mm 해상도) 및 형광 현미경 조직 분석 (µ m 해상도)3간의 규모 격차를 닫습니다. 따라서, 방사성 핵 종 및 형광 modalities (sub-) 세포 규모 전체 바디 수준에서까지 서로 보완.
리포터 유전자 영상은 장기간된 셀 전이 연구에 필요에 따라 추적에 대 한 이상적입니다. 이 응용 프로그램에서 직접 셀 라벨 (i) 상표 희석에 의해 영향을 하 고 따라서, 추적에 국한 되지 않음에 우수한 이며 (ii) 더 나은 라이브 셀 번호를 반영 합니다. 따라서, 응용 프로그램에 추적 세포 증식 또는 vivo에서, 예 암3,6, 줄기에 기형종 형성의 검출에 대 한 연구에 대 한 전체-바디 셀 추적 특히 유용 연구, 세포 또는 면역의 정량화에 대 한 셀 확장5.
다양 한 방사성 핵 종 기반 리포터 유전자는 사용할 수 있는2. 이 헤 르 페 스 심 플렉스 바이러스 HSV11 티 미 딘 키 니 아 제 (HSV1-tk), 나트륨 요오드 화물 symporter (NIS) 같은 전송기 또는 norepinephrine 전송 (인터넷), 등 효소 뿐만 아니라 세포 표면 수용 체는 도파민 D2 수용 체 (등 포함 D2R)입니다. 국정원은 요오드 화물 통풍 관, 갑 상선 호르몬10의 후속 합성에 대 한 상선에 follicular 셀에 예를 적극적으로 중재 하는 당화 횡단 막 단백질. 이 과정 나+ 의 symport에 의해 고 나+에 의해 유지 된다 세포질 나트륨 그라데이션 /K+-ATPase11. 따라서, NIS는 더 나은 생활을 반영으로 요오드 화물/radiotracer 글귀 활성 나+에 연결 된 다른 기자 들 보다 숫자를 셀 전송의 단순한 존재 보다는 /K+ 그라데이션. 전통적으로, radioiodide 사용 된 NIS 이미징. 셀 추적용 metabolically 갑 상선에 침투 하지 대체 NIS radiotracers 우수한6되도록 보고 되었습니다. 이 최근 애완 동물 radiotracer [18F] tetrafluoroborate 개발 ([18F] BF4-)12,13 되는 동안 radioiodide6 에 비해 우수한 약 동학을 보여줍니다 높은 특정 활동14 복잡 한 radiochemistry 시설에 대 한 필요 없이 사용할 수 있습니다. [18F] BF4- 통해 두 가지 방법으로 합성 될 수 있다. 첫 번째 방법은 방사성 비 19F BF4- 방사성 18F12의 동위 원소 교환을 기반으로 합니다. 두 번째 방법은 비 방사성 붕 trifluoride14 18F의 추가 통해 이다. 후자의 방법을 수익률 높은 특정 활동14 으로 알려졌다 고 전 임상 영상에 대 한 선택의 방법입니다.
NIS는 갑 상선 조직에 매우 표현 된다. 그것은 또한 침, lachrymal와 젖이 유 방 땀 샘, 위장에 하지만 갑 상선10에 비해 낮은 수준에 표시 됩니다. 따라서, 다른 몸 지구에 대조 이미징 NIS를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 그것은 또한 높은 동종 간의 인간, 쥐 및 마우스10. 또한, 소성 NIS 식 비 thyroidal 셀에 따라 독성의 보고 있다. 중요 한 것은, NIS는 또한 되지 호스트 면역 반응, 인간도 설치류와 연결. 국정원은 발기인 활동15,,1617 및 유전자 식18,19,20,21,22 측정 하 리포터 유전자로 사용 되었습니다. ,23 여러 다른 문맥에서. 그것은 또한 유전자 치료 벡터24,25, 그리고 심장4세포, 조 혈 모26, 염증5, 신경 연구27추적 하 비 침략 적 영상에 대 한 사용 되었습니다. 최근, NIS 또한 사용 되었습니다 리포터 유전자로 암 전이 vivo에서3,6추적 하.
요약 하자면, 이전 기술을 통해이 방법의 주요 장점은: (i) 매우 중요 한 비-침략 적 3D vivo에서 현지화 및 정량화의 전이성 확산, (ii)에서 [18F] BF4- 의 생산 자동화 높은 어 금 니 활동, (iii) 경도 이미징, (iv) 향상 된 통계 데이터, 이후의 이미징 세션에서 쌍된 데이터의 수집에 차례로 추가 동물 사용, 및 (v)를 감소 시키는 통해 필요한 동물에 뜻깊은 감소 ex vivo cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 조직에 암 세포의 확인에 대 한 기본 옵션입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Step 1) Engineering and characterization&amp;nbsp; of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5&#039;-Bi-1H-benzimidazole</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td>Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.</td></tr><tr><td>4T1 murine breast cancer cell line</td><td>ATCC</td><td>CRl-2539</td><td>for details see ATCC website</td></tr><tr><td>Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5651697001</td><td>CASY Model TT Cell Counter and Analyzer</td></tr><tr><td>CASYclean Cleaning Reagent</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501036</td><td></td></tr><tr><td>CASYton Isotonic Diluent</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501037</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Fluorescence Microscope, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Leica TCS SP5</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Equipped with Plan-Neofluor 25&amp;times;0.5NA and Plan-Apochromat 63&amp;times;1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis</td></tr><tr><td>Cover slips No. 1.5 thickness</td><td>VWR International</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td>Supplement with 10 % (v/v) FBS and &lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.</td></tr><tr><td>FACS sorter, e.g. BD FACSAria III&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 &amp;mu;m nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 &amp;mu;m, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Heat inactivated at 56 &amp;deg;C for 30 min</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>&lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;Tc-pertechnetate energy window 110-155 keV&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 18F energy window 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1-3 &amp;micro;g/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Linear polyethylenimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 human breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>for details see ATCC website</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mEGFP</td><td>request from our lab</td><td>n/a</td><td>For details (generation and maps) see Supplementary Information</td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mCherry</td><td>request from our lab</td><td>n/a</td><td>For details (generation and maps) see Supplementary Information</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>plasmids encoding for the VSV-G envelope</td></tr><tr><td>pRRE</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>packaging plasmid</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>packaging plasmid</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P43330</td><td>Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate)</td><td>Polysciences</td><td>17951</td><td>Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>From &lt;em&gt;Streptomyces alboniger&lt;/em&gt;, reconstituted in sterile water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge</td><td>Hettich Lab Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td>Supplement with 10% (v/v) FBS and &lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.</td></tr><tr><td>SFCA Syringe filter 0.45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes 10 mL</td><td>BD Emerald</td><td></td><td>Disposable non-sterile syringes</td></tr><tr><td>Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Cell Imaging System equipped with a 10&amp;times; objective (PlanFL PH2, 10&amp;times;/0.25, &amp;infin;/1.2) and a colour camera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution 10X&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td>(0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>W21404</td><td>Used at 1:1000 (2 &amp;micro;g/mL) for cell immunofluorescence</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Step 2) Establishment of &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; tumor models.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital caliper</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>For inhalation</td></tr><tr><td>Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)</td></tr><tr><td>Syringes 0.3 mL U-100 insulin</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &amp;times; 1/2&#039;&#039; - 0.33 &amp;times; 12 mm</td></tr><tr><td>Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Step 3) Production of [&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;F]BF&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt; using an automated radiotracer synthesis platform.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-crown-5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>188832</td><td>CAS 33100-27-5</td></tr><tr><td>Acetonitrile (anhydrous)</td><td>Acros Organics</td><td>326811000</td><td></td></tr><tr><td>Boron trifluoride diethyl etherate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216607</td><td>BF&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;.OEt&lt;sub&gt;2,&lt;/sub&gt; purified by redistillation, &amp;ge;46.5 % BF&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; basis. CAS 109-63-7</td></tr><tr><td>Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FASTlab Developer pack</td></tr><tr><td>Polygram Alox N/UV254 polyester sheets</td><td>Macherey-Nagel</td><td>802021</td><td>RadioTLC plates, 40&amp;times;80 mm</td></tr><tr><td>Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023525</td><td>Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)</td></tr><tr><td>Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023561</td><td>Condition with H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)</td></tr><tr><td>Water for injection USP</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen filter</td><td>Millipore</td><td>SE2M049I05</td><td>Sterile 0.2 &amp;micro;m FG Millex 13 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Step 4) &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>For inhalation</td></tr><tr><td>Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)</td></tr><tr><td>Rodent anesthesia induction chamber</td><td>Vet-Tech</td><td>AN010R</td><td>With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)</td></tr><tr><td>Rodent anesthesia system</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001B</td><td>Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer</td></tr><tr><td>Sterile physiological saline</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BO0334B</td><td></td></tr><tr><td>Syringes 0.3 mL U-100 insulin</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &amp;times; 1/2&#039;&#039; - 0.33 &amp;times; 12 mm, for intravenous injection of radiotracer</td></tr><tr><td>Veterinary Scavenger</td><td>Vet-Tech</td><td>AN200</td><td>VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5) &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; data analysis.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant Software</td><td>Invicro LLC., Boston, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6) &lt;em&gt;Ex vivo&lt;/em&gt; analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59070-1L-D</td><td>Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 22&amp;times;50 mm</td><td>VWR International</td><td>SMITMCQ211022X50</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat, e.g. Cryostat MNT</td><td>SLEE Medical</td><td></td><td>two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson/Stratech</td><td>111-175-144</td><td>Used at 1:500 (2 &amp;micro;g/mL)</td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>Microtome blades, e.g. Feather S35&amp;nbsp;</td><td>CellPath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Equipped with 10&amp;times;, 20&amp;times; (air) and ideally 40&amp;times; (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>&lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;Tc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipped with GFP and RFP emission filters</td></tr><tr><td>O.C.T. compound&amp;nbsp;</td><td>VWR international</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Wax pen, e.g. PAP-PEN</td><td>Dako UK Ltd</td><td></td><td>Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 &amp;micro;g/mL) for tissues immunofluorescence</td></tr><tr><td>Microscope slides, e.g. Superfrost slides</td><td>VWR, Lutterworth, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline (TBS)</td><td>available from various suppliers.</td><td></td><td>Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4</td></tr></tbody></table>

radionuclide-fluorescence reporter gene imaging to track tumor progression in rodent tumor models

전이 대부분의 암 죽음에 대 한 책임. 광범위 한 연구에도 불구 하 고 전이 경 세 하는 복잡 한 프로세스의 기계적 이해 불완전 한 남아 있습니다. Vivo에서 모델 전이 연구, 파라마운트는 그러나 구체화를 요구 한다. 비-침략 적 비보에 의해 자연 스러운 전이 추적 영상 수, 하지만 그것은 오랜 관찰과 높은 감도 필요로 도전 남아 있습니다. 우리는 경도 결합 된 방사성 핵 종 및 형광 전신 vivo에서 이미징 종양 진행과 자연 스러운 전이 추적 하기 위한 접근 방식을 설명 합니다. 이 리포터 유전자 방법론 (FP) 형광 단백질을 융합 하는 나트륨 요오드 화물 symporter (NIS)를 사용 합니다. 암 세포는 안정적으로 빠른 NIS FP 뒤에 형광 활성화 된 세포 분류에 따라 선택 하도록 설계 됩니다. 해당 종양 모델 쥐에서 설정 됩니다. NIS FP 표현 암 세포는 vivo에서 양전자 방출 단층 촬영 (애완 동물)에 의해 전체-바디 수준에서 NIS를 사용 하 여 비 접촉 추적 radiotracer [18F] BF4-. 애완 동물 현재는 가장 민감한 vivo에서 이미징이 규모에서 사용할 수 있는 기술 이며 안정적이 고 절대 정량화를 수 있습니다. 현재 방법 시간 점, 다양 한 전이 평가 대 한 안락사는 동물의 큰 동료에 의존 하거나 거의 정량 2D 영상에 의존 합니다. 설명된 방법의 장점으로는: (i) 매우 중요 한 비-침략 적 vivo에서 3D 애완 동물 화상 진 찰 및 정량화, (ii) 자동화 된 애완 동물 추적기 생산, (iii) 필요한 동물 숫자 반복 이미징 옵션 때문에 상당한 감소 (4) 더 나은 통계 데이터 (v) ex vivo 형광 현미경 검사 법 또는 cytometry 조직에서 암 세포의 확인에 대 한 기본 옵션을 제공 하는 후속 이미징 세션에서 쌍된 데이터의 취득. 이 프로토콜에서 우리는 일상적인 NIS FP 여유 비-침략 적 생체 내에서 암 세포 추적 vivo에서 결과의 PET/CT 및 비보 전 확인을 사용 하 여에 필요한 모든 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 때마다 vivo에서 현지화, 확장 및 세포 인구의 장기간 모니터링의 암 연구 응용 프로그램 있다.

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Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

radionuclide-fluorescence-reporter-gene-imaging-to-track-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.9K 조회수.  King's College London. 우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합?...

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

췌장암의 형광 동소 이식 마우스 모델

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

연구

암 연구학

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting immunodeficient mice subcutaneously with cancer cells and measuring the tumor mass after it becomes visible and palpable. Orthotopic injections of cancer cells aim to introduce the xenograft in the microenvironment that most closely resembles the tissue of origin of the tumor being studied. Brain cancer research requires intracranial injection of cancer cells to allow the tumor formation and analysis in the unique microenvironment of the brain. The in vivo imaging of intracranial xenografts monitors instantaneously the tumor mass of orthotopically engrafted mice. Here we report the use of fluorescence molecular tomography (FMT) of brain tumor xenografts. The cancer cells are first transduced with near infrared fluorescent proteins and then injected in the brain of immunocompromised mice. The animals are then scanned to obtain quantitative information about the tumor mass over an extended period of time. Cell pre-labeling allows for cost effective, reproducible, and reliable quantification of the tumor burden within each mouse. We eliminated the need for injecting imaging substrates, and thus reduced the stress on the animals. A limitation of this approach is represented by the inability to detect very small masses; however, it has better resolution for larger masses than other techniques. It can be applied to evaluate the efficacy of a drug treatment or genetic alterations of glioma cell lines and patient-derived samples.

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Orthotopic intracranial injection of tumor cells has been used in cancer research to study brain tumor biology, progression, evolution, and therapeutic response. Here we present fluorescence molecular tomography of tumor xenografts, which provides real-time intravital imaging and quantification of a tumor mass in preclinical glioblastoma models.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters2. Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals3.
Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity4-9, while our group and a few others10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.
The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation11. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control14, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system15. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers18. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density27. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.
Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat17.

Diffuse fluorescence tomography offers a relatively low-cost and potentially high-throughout approach to preclinical in vivo tumor imaging. The methodology of optical data collection, calibration, and image reconstruction is presented for a computed tomography-guided non-contact time-domain system using fluorescent targeting of the tumor biomarker epidermal growth factor receptor in a mouse glioma model.

암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light ...

의학

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>orthotopically 주입된 유방 종양 세포의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 In vivo imaging

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

비 침습적 영상에 대한 생쥐 모델 검색 및 모니터 난소 암 재발

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

In Vivo Fluorescence Imaging to Localize Antibodies in a Mouse Tumor Xenograft Model

Source: Shivange, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60727">Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
The video demonstrates a fluorescence imaging method for in vivo antibody localization in a mouse tumor xenograft model. It involves the injection of tumor cells in a mouse to generate solid xenografts beneath the skin. Subsequent injection of fluorescent antibodies confirms specific localization through enhanced fluorescence signals within the tumor xenograft.

마우스 종양 이종이식 모델에서 항체 국소화를 위한 In vivo Fluorescence Imaging

1. Expression and purification of antibodies

	Maintenance of CHO cells
	
		Grow CHO cells in FreeStyle CHO Media supplemented with commercially available ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Antibody-Based Imaging and Detection Methods

An In Vivo PET Imaging Technique to Detect Tumors in a Murine Model Using Radiolabeled Antibodies

Source: Zeglis, B. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52521">The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique involving a radioimmunoconjugate for the in vivo imaging of a tumor in a mouse model. Upon injection of the radioimmunoconjugate, the antibodies of the conjugate bind to a specific membrane antigen on the cancer cells. The radiotracer of the conjugate emits positrons that interact with neighboring electrons to produce energy, which is detected by a positron emission tomography (PET) scanner to create an image of the tumor.

방사선 표지된 항체를 사용하여 쥐 모델에서 종양을 감지하는 In Vivo PET 이미징 기술

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. In ...

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

요약

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