원발성 종양의 전신 효과는 이제 전이성 전파 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 인식되고 있습니다. 그러나 이것은 실험적 전이 분석에서 종종 누락됩니다. 이 모델은 연구자에게 이 효과를 평가할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.
이 프로토콜에는 임상적으로 관련성이 있는 원발성 종양을 외과적으로 제거한 후 자발적 전이에 대한 평가가 포함됩니다. 또한 주로 생물 발광 이미징을 활용하여 폐 전이 성장을 실시간으로 모니터링합니다. 이 실험 설정은 신보조요법 환경에서 유방암에 대한 약리학적 또는 유전적 중재를 평가하고 전이성 과정에서 특정 신호 전달 경로의 관련성을 평가하기 위해 확장될 수 있습니다.
시작하려면 세포 배양 배지를 흡인하여 세포를 수확하고 멸균 PBS로 세척합니다. 다음으로, 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 약 2-3분 동안 0.25%Trypsin-EDTA 용액 2밀리리터로 배양한 다음 8밀리미터의 완전한 배지로 세척하여 반응을 소멸시킵니다. 상층액을 흡인하고 PBS로 세포를 세척한 후, 세포를 밀리리터당 600만 개의 세포로 희석하는 데 필요한 계산된 부피로 PBS의 세포를 재현탁시킵니다.
그런 다음 셀 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 주입할 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오. 전기 가위를 사용하여 마취된 쥐의 복부에 있는 털을 면도한 다음 누운 자세로 놓습니다. 다음으로 70% 에탄올과 포비돈-요오드 용액을 사용하여 준비된 복부를 청소합니다.
가위를 사용하여 네 번째 유방 조직 수준에서 복부 피부를 통해 작은 정중선을 절개하여 밑에 있는 복막을 노출시키지만 관통하지는 않습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 피부를 복막에서 멀리 유지하고 멸균 식염수를 적신 면봉으로 복막에서 피부를 분리하고 측면으로 이동하여 오른쪽 유방 지방 패드를 노출시키고 왼쪽에서 반복하여 왼쪽 유방 지방 패드를 노출시킵니다. 수동 피펫을 사용하여 E0771 세포 현탁액을 재현탁한 후 100마이크로리터를 새로운 1.5밀리리터 마이크로원심분리기 튜브에 옮깁니다.
그런 다음 동일한 양의 기저막 매트릭스 용액을 추가하고 기포가 발생하지 않도록 주의하면서 잘 섞습니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 두십시오. 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 28게이지 0.5밀리리터 U-100 인슐린 주사기에 넣고 얼음 속에 보관합니다.
겸자를 사용하여 피부를 들어 올리고 왼쪽 유방 지방 패드를 부드럽게 잡아 노출시킵니다. 다음으로, 50 마이크로리터의 세포 현탁액을 유방 지방 패드에 주입하고 주사기를 제거하기 전에 3-5초 동안 기다립니다. 그런 다음 겸자에서 피부를 풀어 자연스럽게 정상 위치로 돌아갈 수 있도록 하고 피부 절개 부위를 닫고 피부 스테이플을 적용합니다.
기립성 유방 종양 병변의 성장을 모니터링하려면 일주일에 세 번 캘리퍼스를 사용하여 원발성 종양의 길이와 너비를 측정합니다. 마취 후 통증 조절을 위해 40마이크로리터의 멜록시캠을 피하로 투여한 다음 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 다음으로, 필요한 경우 이전의 수술용 스테이플을 제거하고 70% 에탄올과 포비돈-요오드 용액으로 복부를 청소합니다.
가위를 사용하여 네 번째 유방 조직 수준에서 복부 피부를 통해 작은 정중선을 절개하여 밑에 있는 복막을 노출시키지만 관통하지는 않습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 종양에 근접 및 원위부에 위치한 정상 유방 조직을 절단하여 기교성 종양을 제거합니다. 종양 조직을 생물학적 위험 백에 버리고 반대쪽 종양에 대한 절차를 반복합니다.
다음으로, 1-3개의 스테이플을 사용하여 수술 부위를 닫고 마우스를 아래에 따뜻한 가열 패드가 있는 깨끗한 회복 케이지로 옮깁니다. 뼈의 저항이 느껴질 때까지 코에서 45도 각도로 눈의 내측 안각에 바늘을 삽입하여 후안와 주사를 사용하여 동물에게 100마이크로리터의 D-루시페린 용액을 주입하고 바늘이 후안와 정맥동 내에 놓이도록 합니다. 배송 시 액체의 세척이 없어 성공적인 주입을 확인하고 이미징 2분 전에 기다립니다.
기다리는 동안 동물을 누운 자세로 생물 발광 이미저 내부에 있는 코뿔로 옮깁니다. 광자 플럭스를 측정하려면 정사각형 ROI 버튼을 클릭하여 ROI 도구의 드롭다운 메뉴에서 이미지에 표시된 각 동물에 대한 정사각형 ROI를 생성합니다. 자동으로 생성된 ROI를 마우스로 클릭하고 드래그하여 각 동물의 흉부 위로 재배치합니다.
그런 다음 ROI 측정 버튼을 클릭합니다. 시푸스 돌기 아래의 정중선을 절개하여 피부, 근육 조직 및 복막을 절단하여 횡격막이 보일 때까지 가위를 사용하여 흉강의 아래쪽 부분을 노출시킵니다. 그런 다음 횡격막에 구멍을 뚫어 폐를 무너뜨린 다음 횡격막을 절단합니다.
오른쪽과 왼쪽의 흉곽을 절개한 다음 지혈제를 사용하여 시푸스 돌기를 잡고 흉곽을 밖으로 이동시켜 심장과 폐를 노출시킵니다. 그런 다음 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움을 자릅니다. 그런 다음 좌심실을 통해 얼음처럼 차가운 PBS 10ml를 동물에게 관류하고 우심방에서 흐르는 액체가 맑아지고 간이 옅은 노란색으로 변하는지 확인하여 관류의 완전성을 평가합니다.
다음으로, 기관을 식별하고 4% 파라포름알데히드 3밀리리터가 들어 있는 22게이지 바늘 주사기를 기관과 평행하게 유지합니다. 그런 다음 폐가 완전히 부풀어 오를 때까지 느린 속도로 용액을 전달하십시오. 기관을 계속 부드럽게 잡습니다.
집게 위의 가위로 자르고 모든 결합 조직을 제거하면서 조직을 조심스럽게 들어 올리기 시작합니다. 그런 다음 폐에서 심장을 절개합니다. 그 후, 폐 조직을 PBS의 4% 파라포름알데히드에 밤새 넣고 섭씨 4도에서 보관하여 고정합니다.
C57 블랙 6 마우스를 활용하면 일반적으로 원발성 종양 절제 후 약 2주 후에 유의한 폐 전이 생물 발광 신호가 감지되고 시간이 지남에 따라 추적 관찰할 수 있지만, 루시페라아제 리포터 유형 및 마우스 균주에 따라 약간의 차이가 발견될 수 있습니다. 종말점에서 폐 조직의 생체 외 생물 발광 이미징은 다른 치료법과 비교하기 위해 플롯할 수 있는 폐 전이성 부담에 대한 정확하고 감도 높은 정량화를 제공합니다. 입체경에 따른 폐 결절 계수와 헤마톡실린 및 에오신 조직학적 분석은 정량화 연구를 보완하는 데 활용될 수 있습니다.
유방 지방 패드 주입 후 바늘 빼기를 약간 지연시키면 매트릭스 용액이 겔화될 수 있으며, 이는 세포 현탁액의 누출과 유방 외 종양의 발생을 방지하는 데 중요합니다. 우리는 현재 이 기술을 다양한 유전자 knockout 및 knockin 마우스 모델과 함께 활용하여 전이성 캐스케이드, 특히 전이성 틈새의 개발을 추가로 연구하고 있습니다.
