우리는 망 토-브라질, CNPq-브라질, FAP/DF 재정 지원에 대 한 감사합니다. 우리는 수정 원고에 대 한 박사 휴고 코스타 Paes에 감사입니다.

1. 솔루션 및 미디어
<ol><li>2 X 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), Sabouraud 포도 당 국물, 및 표 1에 의하여 Sabouraud 포도 당 한 천 준비.</li>
</ol>2. 균 Inoculum 성장 조건
<ol><li>필요할 때까지-80 ° C에서 35% 글리세롤에 냉동된 주식으로 모든 곰 팡이 긴장을 저장 합니다.</li>
	<li>각 실험 하기 전에 다음 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>Candida albicans 종자에 대 한:<ol>
<li>재고 유리병을 해 동 하 고 동요 (200 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 문화와 모자 살 균 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 200 µ L를 전송. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 문화의 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>대 한 Cryptococcus neoformans 긴장:<ol>
<li>재고 유리병의 얼어붙은 표면 다쳤어요. 플레이트 Sabouraud 포도 당 한 천 배지 위에 셀 및 48 h 30 ° c.에 대 한 품 어 고립 된 식민지의 성장을 볼 수, 후 최대 15 일 동안 파라핀 필름으로 밀봉 냉장고 (4 ° C)에 번호판을 유지.</li>
			<li>메 마른이 쑤 시 게 또는 살 균 접종 루프를 사용 하 여 접시에서 중간 크기의 고립 된 식민지를 수집 하 고 살 균 50 mL 원뿔 튜브에서 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 접종. 동요 (200 rpm)에서 30 ° C에서 약 24 h에 대 한 품 어.</li>
			<li>24 시간 보육을 초과 하지 마십시오. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오. 그것은 항상 좋은 항균 성 저항에 영향을 미치는 중요 한 요소 이므로 각 테스트 전에 세포의 성장 단계를 표준화. 참고: 두 균 급속 한 전파, 우리의 실험에서 30 ° C에서 성장 했다 하지만 온도 예 임상 치료 (37 ° C) 연구의 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 가장 중요 한 것은,이 초기 보육 시간 미리 각 균 분리 설립 한다 고 재현성을 보장 하기 위해 모든 테스트를 통해 유지.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>곰 팡이 성장 후 실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 원뿔 관 centrifuging 여 세포를 수집 합니다. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 세포와 원심 분리기 다시 resuspend.</li>
	<li>PBS 세척 및 원심 분리 두 번 더 반복 합니다. 3 세척 후 2 X RPMI-1640 매체의 (에 따라 펠 릿 크기) 5 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 (에 따라 세포 현 탁 액의 탁도)에서 1: 100 또는 1:1,000 희석의 1 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>이 희석의 aliquot 10 µ L 그것 hemocytometer 챔버에 놓고 현미경은 4 개의 코너 사분면에 셀의 총 수를 계산 합니다. 농도 계산 하는 수식으로: (총 셀 수/4) x 희석 요인 x 104 (챔버 희석 상수).<ol>
<li>가능성 조사 및 성장 조건을 체계적으로 공부 되 고 격리에 대 한 상관 되었다 있다 100% 생존 능력을 고려 합니다. 참고: 표준화 및 품질 관리의 생존 할 수 효 모10에 대 한 항균 성 자화 율 테스트 (EUCAST) 항진균 최소 억제 농도 (MIC) 방법에 유럽 위원회에 따라에서 다시 도금 .</li>
		<li>성장/생존 상관 관계 연구 분리에 대 한 설립 되지 않았습니다, phloxine B11, trypan 블루 등 죽은 세포를 선택적으로 색상 염료의 도움으로 hemocytometer 라이브 셀을 계산 하 여 곰 팡이 생존 능력을 측정 12, 야누스 그린13또는. 이 프로토콜에 대 한 곰 팡이 세포를 사용 하 여 경우에이 시점에서 인구의 생존 능력은 90% 이상. 참고: 죽은 살아 있는 염료 선택의 균 류와 함께 잘 작동 하지 않을 수 있습니다. 제발 그들을 사용 하기 전에 테스트 합니다. 예를 들어 trypan blue 염료 C. neoformans와 함께 잘 작동 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그 후, 2 X RPMI-1640 중간에 셀 정지 준비 (2 X 조정 inoculum RPMI 1640 매체에서). 96 잘 접시 각 접시 5 mL의 볼륨을 고려 하십시오.<ol>
<li>모든 C. albicans 변종에 대 한 4 x 103 셀/mL의 재고 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 이 농도 각 음 (2 x 103 셀/mL)에서 최종 셀 농도의 2 배입니다.</li>
		<li>C. neoformans 변종에 대 한 셀 2 × 104 셀/mL의 사진 문화를 준비 합니다. 이 농도 각 잘 (1 x 104 셀/mL)에서 최종 셀 농도 두 번.</li>
		<li>다른 버섯에 대 한 어떤 농도 부 화 시간에 관하여 특정 연구에 대 한 이상적인 것 알려진된 항진균 테스트. 곰 팡이의 물질 대사 및 복제 시간 고려해 서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 펩 티 드 (알 수 없는 에이전트)
<ol><li>-20 ° C에서 동결 건조 된 펩 티 드를 저장 하 고 각 실험 전에 이온된 수에 그들을 분해. 최대 저장 시간 한 번 물속에에서 녹아 있는 각 펩 티 드의 성격에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>두 번 분석 결과 (2 배)에 테스트 높은 최종 농도의 aliquots을 준비 합니다. 이상적으로, freeze-thaw 주기를 피하기 위해 사용 하는 한 시간에 대 한 충분 한 펩 티 드와 aliquots의 작은 수를 준비 합니다. 참고: 농도 문학 및 펩 티 드의 속성에 근거 한다. 직렬 희석, 펩 티 드의 약 100 µ M와 함께 시작 하 고 다음 줄이거나 얻은 결과 따라이 농도 범위를 증가 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 참조 Antifungals (긍정적인 컨트롤)
<ol><li>그 물에 희석: 분석의 높은 농도의 2 배 솔루션 준비 (섹션 5 참조: 희석 단계에 대 한 항진균 분석 결과).<ol>
<li>C. albicans 변종에 대 한 fluconazole의 128 µ g/mL 또는 caspofungin의 128 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 모두 접시 농도 64 µ g/mL를 될 것입니다.</li>
		<li>C. neoformans 변종에 대 한 암포 B (수용 성 솔루션)의 32 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 플레이트 농도 16 µ g/mL를 될 것입니다. 참고: 일반적으로 암포 B는 희석 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 이후이 항진균 저조한 물에 용 해. 그러나, 상업적으로 이용 가능한 수용 성 암포 B 준비 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antifungals 유기 용 매에 희석에 대 한: DMSO, 재고 솔루션 X 100을 준비 다음에 사용 하기 위해 물에 10 배 희석. 참고: 이렇게, 잘, DMSO의 최종 농도 초과 하지 않습니다 1%. 곰 팡이 컨트롤은 필요한 일부 버섯 용납 하지 않습니다 잘 솔벤트의이 농도 1 %DMSO 포함 하는 미디어에서 성장할 것입니다 우물. DMSO는 감광, 그래서 호 일 접시 커버 또는 잠복기 동안 어두운 챔버에 배치.</li>
</ol>5. 항진균 분석 결과
참고: 항진균 분석 실험 체 외에 는 국물 microdilution 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침 일부 수정에서 시험에 따라 수행 됩니다.
<ol><li>각 펩 티 드의 두 배 직렬 희석을 준비 하 고 항진균 50 µ L의 최종 볼륨을 96 잘 폴리스 티 렌 microplates에서 제어.<ol>
<li>100 µ L의 최고 2 배 농도에서 항진균/펩 티 드의 원하는 열에 최종 농도 1-3, 시내 행 대답 하는 것을 추가 피 펫을 사용 하 여</li>
		<li>H. B 행에, 다른 우물으로 살 균 물의 50 µ L을 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여,</li>
		<li>최고 농도 (A 행)와 우물의 50 µ L을 제거 하 고 농도 (B 행)의 다음에 전송 균질.</li>
		<li>최저 농도와 잘 때까지 위의 단계를 반복 하 고이 잘 (행 H) 50 µ L를 삭제. 빈 컨트롤 또는 네거티브/성장 제어에 대 한만 물에 두고 열 11 및 12 (행 A, B, C).</li>
		<li>추가할 조정된 inoculum X 2의 50 µ L RPMI 1640 매체에 각 음 (열 1-3 플러스 열 11 (네거티브/성장 제어)); C. albicans 에 대 한 최종 농도 2 x 103 셀/mL, 그리고 최종 농도 C. neoformans 변종 104 셀/mL에 될 것입니다 될 것입니다.</li>
		<li>빈 컨트롤을 준비 (50 µ L 물 + 50 µ L 2 셀 없이 X RPMI-1640 매체) 및 부정/성장 제어 (50 µ L 물 + 항진균 없이 50 µ L 조정 inoculum 2 X RPMI-1640 매체), 그리고 위의 설명 대로 잘 플레이트에 부하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테스트할 각 화합물에 대 한 절차 및 선택한 항진균 제어 (열 4-10)를 반복 합니다. 참고: 직렬 희석 할 수 있습니다 세로로 또는 가로로 (즉, 테스트 하는 주어진된 화합물/추출의 희석 수는 8 개 이상의 경우) 접시에 아래, 실험으로.<ol>
<li>화합물, 참조 하는 경우 약물, 또는 그 구성 요소 중 하나는 감광, 감소 빛에 분석 결과 수행, 호, 플레이트 커버 또는 외피 동안 어두운 챔버에 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 옵션 권장 사항을 고려 하십시오.<ol>
<li>로이 증발 감소 가스 교환을 허용 하는 명확한 커버 플레이트 플레이트를 봉인.</li>
		<li>습 한 챔버;에 접시를 놓으십시오 그것은 또한 증발 줄일 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>C. neoformans를 흔들어 200 rpm으로 24 시간 또는 48 h 모든 C. albicans 긴장, 및 48 h 37 ° C에서 번호판을 품 어. 낮은 최종 볼륨 (100 µ L) 아무 일 좀 발생 하는 것을 보장 합니다. 참고: 24 시간에 마이크 읽기와 C. albicans 긴장에 대 한 48 h 사이 상당한 차이가 관찰 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 48 h 수치는 시각화 하기 쉽습니다.</li>
	<li>형태 또한 오염의 흔적을 확인으로 변경 사항을 확인 하려면 잠복기 전후 반전된 광학 현미경의 도움으로 모든 우물을 관찰 합니다. 참고: 읽기 시각적으로 수행 및 실험의 끝에 촬영 될 수 있습니다. 각 읽기 전에 접시 약간 균질. 600의 OD를 측정 하 여 읽기를 수행할 수 있습니다, 셀 묶습니다 경우 또는 filamentation 하지 관찰 된다.</li>
	<li>별도 날짜에 세 번 이상 실험을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Microdilution 테스트는 화합물, 화합물의 소량을 사용 하 여 대상의 잠재적인 항진균 성 활동을 분석 하 고 동시에 농도의 범위에서 테스트 수 있습니다. 이 따라,이 프로토콜은 잠재적인 새로운 항진균 성 화합물에 대 한 심사의 첫 번째 단계도 권장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 처음 클리닉, 항진균 치료의 선택에 도움을 설계 되었습니다 M27-A3 프로토콜에 기반은 그리고 새로운 항진균 성 화합?...

곰 팡이 감염 되는 중요 한 의료 우려 최근 수십 년간, 상당히 immunocompromised 개인 등 암 치료 및 HIV/에이즈와 함께 사는 사람들의 숫자에 있는 상승 때문에 주로 증가 하는 데 또는 이식 장기1,2. 그러나, 매우 제한 된 배열 사용 가능한 항진균 약물의과 그들에 게 곰 팡이 저항에 대 한 보고서의 증가 조직의 사상 균 병3의 치료제에 관한 주요 문제에 기여.
새로운 항진균 성 화합물의 항균 성 펩 티 드 (암페어), 작은 양이온 펩 티 드 감염4그들의 타고 난 면역 반응의 일환으로 많은 유기 체에 의해 생산 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 심사 방법 곰 팡이 병원 균에 대 한 이러한 화합물을 테스트 하는 표준화 되지. 다른 절차 때때로 동일한 모델 미생물5,,67에 대 한 앰프의 항진균 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 차이 부족의 일부 프로토콜 세부 화합물 및 저해 재현성 사이 비교를 복잡 하 게.
새로운 약 후보자의 테스트를 표준화 하기 위한 한 가지 방법은 항진균 민감성은 임상 등 임상 설정에서 정의 하는 데 사용 하는 지침 및 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침입니다. 그러나, 이러한 antifungal 감도 테스트 너무 제한적 그리고 받지 않습니다 고려 대사에서 변화에 종에 걸쳐 그들은 단지 몇 가지 선택 에이전트에 대 한 설립 했다. 예를 들어 그들은 할 고려 하지 계정 비 발효 효 모에의 대사 요구.
이 프로토콜 잠재 항진균 성 화합물의 활동의 평가 허용 하 고 항진균 펩 티 드에 대 한 검색에 대 한 여기에 구현 됩니다. 그것은 국물 microdilution 새로운 화합물8,9의 심사를 최적화 하는 수정 CLSI M27-A3 지침에서 시험 기반으로 합니다. 이러한 변경 내용은 컨트롤로 참조 antifungals 사용 하 여 결과 표준화 하는 동안 최적의 사전 테스트 성장 위한 소량의 화합물, 온도 또는 초기 inoculum와 다른 미디어를 사용 하 여 허용 합니다. 다 잘 배양 배지를 사용 하 여이 방법을 신속 하 고 안정적으로 화면 화합물의 많은 수를 가능 하 게.
그것의 고유의 유연성으로 인해이 프로토콜 및 몇 가지 각 색으로 다른 미생물에 대 한 화합물의 다른 화학 클래스와 함께 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um s&#243;dio, completa o nome dele please)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use to buffer 2X RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Din&#226;mica</td>
			<td>1528-1</td>
			<td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000129</td>
			<td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60230</td>
			<td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>238230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>210950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000123</td>
			<td>35% for (solu&#231;&#227;o de estoque? Criopreserva&#231;&#227;o?)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Para dilui&#231;&#227;o das drogas na dilui&#231;&#227;o seriada</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifungal drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish petri</td>
			<td>J.Prolab</td>
			<td>0304-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Solution Reservoir</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K30-208</td>
			<td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and other materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MegaFuge 16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Ethik Technology</td>
			<td>403-3D</td>
			<td>Set to 37&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td>Set to 37&#176; C, 200 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>BOECO Germany</td>
			<td>BOE 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>HTL</td>
			<td>5123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

곰 팡이 감염 마지막 십 년간에 중요 한 의료 상태 되 있지만 사용 가능한 항진균 약물의 수는 제한. 이 시나리오에서는 새로운 항진균 약물에 대 한 검색이 필요 합니다. 여기 보고 프로토콜 화면 펩 티 드 그들의 항진균 속성에 대 한 방법을 자세히 설명 합니다. 그것은 잠재적인 새로운 antifungals로 항균 성 펩 티 드의 연구에 맞게 수정 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침에서 국물 microdilution 자화 율 시험을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 항진균 성 화합물의 활동을 평가 하는 기능 분석 결과 설명 하 고 조사 분자의 특정 클래스에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 분석 실험 96 잘 접시 작은 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다, 이후 대규모 심사 자동화 환경에서 실시 하는 경우에 특히 시간, 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 표준화 되 고 조정 가능한 임상 프로토콜 곰 팡이 질병의 치료를 개선 하기 위해 새로운 분자의 벤치 작업 추구를 도울 수 있는 방법를 보여 줍니다.

마이크는 완전히 잠복기의 끝에 보이는 곰 팡이 성장을 억제 하는 최저 항균 화합물 농도로 정의 됩니다. 반면 탁도 부정/성장 제어 웰 스에 유사한 어떤 잘 분명 미디어 빈 우물에 유사한 어떤 잘 긍정적인 결과 여겨진다이 프로토콜의 목적은 화면 잠재적인 antifungals 빠른 방법 이므로, 부정적인 것으로 간주. 그러나, 주어진된 앰프 fungistatic 또는 살 진 균 인지 알고에 관?...

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Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.7K 조회수.  University of Brasília. 항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

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Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

체외에서 분리된 뉴런을 조작에 대한 레이저 족집게를 사용하여

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

연구

생물학

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it virtually impossible to build and maintain typical rodent facilities for research. Zebrafish research has been demonstrated to be a valuable alternative for in vivo research in pharmacology, physiology, development and genetic studies. This article demonstrates that a functional zebrafish facility can be built in an easy and affordable manner. We demonstrate that such a facility could be built in about one working day with minimal tools and expertise. The cost of the 27 1.8 L fish tank zebrafish facility constructed in this study was approximately $1,500. We estimate that the maintenance of an initial working 150 fish colony for 3 months is $1,000. This project involved students, who were introduced to aquaculturing of zebrafish for research proposes.

A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

저렴하고 간편한 구축 Zebrafish의 시설의 건설

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in turn requires accurate determination of disease phenotypes of plants upon infection with a particular fungal pathogen. However, accurate disease phenotyping with unculturable biotrophic fungal pathogens such as powdery mildew is not easy to achieve and can be a rate-limiting step of a research project. Here, we have developed a safe, efficient, and easy-to-operate disease phenotyping system using the Arabidopsis-powdery mildew interaction as an example. This system mainly consists of three components: (i) a wooden inoculation box fitted with a removable lid mounted with a stainless steel or nylon mesh of ~50 &#181;m pores for inoculating a flat of plants with fungal spores, (ii) a transparent plastic chamber with a small front opening for minimizing spore escape while conducting inoculation inside, and (iii) a spore-dislodging and distribution method for even and effective inoculation. The protocols described here include the steps and parameters for making the inoculation box and the plastic chamber at a low cost, and a video demonstration of how to use the system to enable even inoculation with powdery mildew spores, thereby improving accuracy and reproducibility of disease phenotyping.

We present a protocol for constructing a simple spore-distribution system consisting of an inoculation box with a ~50 &#181;m mesh and a transparent plastic chamber. This can be used to evenly inoculate plants with powdery mildew spores, thereby enabling accurate and reproducible assessment of disease phenotypes of plants under study.

애기장대 및 기타 식물의 흰가루병 감염 표현형을 정확하게 평가하기 위한 쉽고 유연한 접종 방법

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...