이 작품은 남부 텍사스 기술 관리 (POCrr 2009.041), 연구 자원을위한 국립 센터 (UL 1RR025767)에서 의학 및 과학의 통합을위한 연구소에서 교부금에 의해 및 치과와 Craniofacial 연구 진흥원 (에서 부분적으로 추진하는 사업 5R21DE017294).

1. 기능화 슬라이드의 작성 <ol><li> 이동식 슬라이드 랙에 현미경 슬라이드를 삽입하고, 99 % 에탄올 (histological 학년)를 포함하는 염색법 항아리에 immersing로 두 번 씻는다. 슬라이드가 압축된 질소 가스의 제트를 사용하여 종이 타올 (종이 먼지를 생성하지 않도록 보장) 및 건조를 사용하여 깨끗하게 닦아주십시오. </li></ol> 참고 : 고급 종이 먼지를 생성하는 것처럼 슬라이드를 없애기 위해 김 - 잎사귀를 사용하지 마십시오. <ol start="2"><li> 하룻밤 실온에서 농축 황산과 부화로 가득 염색법 항아리에 슬라이드가 포함된 슬라이드 선반 젖어. </li></ol> 참고 : 집중 지방산과 독성과 부식성 화학 물질과 함께 작업하는 동안 피부와의 접촉을 피하려면, 화학 방지 장갑과 안전 고글을 사용합니다. <ol start="3"><li> 30 분 용 밀리 Q로 30 분 및 세차 (MΩ 18) 물 공급을 위해 슬라이드를 Sonicate, 다른 세척 따르5 분 대한 cetone. 이 치료는 유리 표면의 silanol 그룹을 제공합니다. </li><li> 코트 30 분 동안 APTES의 슬라이드 선반을 immersing 각 세차 15 분 동안 밀리 Q 워터에서 3 번 세척하고, 제빵에 의한 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) 솔루션의 2.5 %와 깨끗한 슬라이드 (물에 권 / 권) 110의 용광로에서 슬라이드 ° C ~ 15 분입니다. 제빵은 표면의-NH2-작용화 그 결과 APTES의 가교 있습니다. </li></ol> 참고 : 우선적 유리 용기의 벽에 APTES 예금 이후 플라스틱 용기에 APTES 솔루션을 확인하십시오. <ol start="5"><li> 소수성 코팅 6 모노 레이어를 달성하는 데 1 % (톨루엔의 wt / 권) 폴리스티렌 - 공동 Maleic 무수물 (PS-MA) (시그마)로 스핀 coater, 코트에게 슬라이드를 사용합니다. 30의 3,000 rpm으로 스핀 coater와 코트에 장착된 깨끗한 유리 슬라이드에 PS-MA 2.0 ML을 추가합니다. 이러한 조건은 같은 코팅과 같은 스핀 코팅 매개 변수에 따라 다를 수 있으므로lution, 기판, 코팅의 두께는 다음 방정식 7에 의거하여 </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> H 필름 코팅의 두께이고, E는 증발의 비율이고, η, C와 ρ는 각각 코팅 용액의 점도, 농도 및 밀도이고, ω는 각속도이다. 참고 : 퓸 후드의 긴 시간과 사용을 위해 흡입시 톨루엔이 해로운 것을 권장합니다. <ol start="6"><li> 8 ° C. - 슬라이드는 2 시에 건조하고 먼지가없는 조건에서 1 개월 최대 슬라이드 선반에 저장할 수 있습니다 </li></ol> 2. 효모 Inocula과 콜라겐 캡슐화의 작성 <ol><li> C의 야간 문화를 준비 효모 펩톤 덱스 트로 오스의 albicans 변형 SC5314, [YPD, 10 G / L 효모 추출물, 20 G / L 펩톤 및 20 G / L 덱스 트로 오스] C.의 단일 식민지를 inoculating하여 액체 배지 알10로 bicans - YPD 8 20 ML. 30 ° C 하룻밤 사이에서 - 궤도 흔드는 (200 RPM이 약 150)에서 문화를 품다. 10 밀리미터 인산 버퍼, 2.7 MM 염화칼륨; 수확 한 ML 칸디다 albicans 효모 하룻밤 YPD 문화 (5-10 분 동안 5,000 rpm으로 원심 분리에 의해)의 세포 및 멸균 인산 1 ML 10 분 동안 두 번 씻어도 (PBS 염분 버퍼 137 밀리미터 나트륨 염화물, 세차 당 산도 7.4) (시그마). 수확은 10 분 동안 1,900 rpm으로 원심 분리하여 또한 세포를 씻어. 한 ML 재구성 버퍼 (2.2 % (wt / 권) 나트륨 중탄산염 및 4.8 % (wt / 권) HEPES, pH는 7.2와 0.2 N NaOH 용액)에 입힌 세포를 Resuspend. </li></ol> 참고 : C. albicans는 위험 그룹 1/BSL1 미생물이다. 항상이 미생물과 함께 작업에 좋은 무균 / 무균 기술을 사용하고 biohazardous 재료의 적절한 처분을위한 제도적 절차를 따르도록 기억 해요. <ol start="2"><li> hemocyt를 사용하여 세포를 세어명시야 현미경에 ometer 5의 세포 밀도 × 10 7 세포 / ML로 조정합니다. </li><li> 또한 10 이외에 의해 정지를 열 번은 희석 × RPMI-1640은 L-글루타민과 함께 보완하고 morpholinepropanesulfonic (대걸레) 산성 (산도 7.2)와 버퍼. </li><li> 콜라겐 (1.8 밀리그램 / ML)와 RPMI-1640에 세포 현탁액을 혼합하여 콜라겐의 효모 세포를 캡슐 (쥐의 꼬리에서 타입 1, BD Biosciences, 베드 포드, MA)은 / 4의 최종 농도 × 10 6 세포를 얻는 방법 ML. 인쇄하기 전에 콜라겐의 겔화 방지를 위해 얼음 콜라겐 - 세포 현탁액을 유지. </li></ol> 3. 칼슘 BChip의 작성 <ol><li> 청소 및 70% 이소프로판올으로 닦는하여 소스 판 역 세척 및 진공 역, 진공 슬라이드 플래터 및 인쇄 챔버를 포함 microarrayer의 모든 표면, 소독. </li><li> 마이크의 슬라이드 갑판에 PS-MA-코팅 유리 슬라이드의 원하는 숫자를 놓고 진공에 의해 개최roarrayer. </li><li> 와동 셀 적극적으로 콜라겐의 서스펜션과 바로 인쇄하기 전에 96 - 웰 플레이트의 우물로 잘 혼합 정학 100 μL를 기음. 로딩 스테이션에서이 소스 접시를 놓습니다. </li><li> 인쇄 과정에서 microarray 챔버 100 %의 상대 습도를 유지하기 위해 가습기를 전환합니다. </li><li> conically 테이퍼 190 μm의 오리피스 세라믹 팁을 사용하여 비 접촉 증착하여 microarray 망보고 (Omnigrid 마이크로, Digilab 주식 Holliston, MA)를 사용하여 1.2 mm 간격 잊어버리고 명소로 48 행 16 열의 배열의 세포 현탁액의 50 NL 인쇄 (Digilab). </li><li> 프라임 인쇄의 각 라운드마다 조언 두 번 씻어 진공 건조. </li><li> 즉시 인쇄 후, 공기 꽉 humidified 챔버 (하이브 리다이 제이션 카세트, ArrayIt 공사, 서니 베일, 캘리포니아)에 슬라이드를 넣고 37 ° C biofilm 형성을 할 수 있도록 24 시간 동안 알을 품다. </li></ol> 4. 저얼의 자화율 시험Antifungal 에이전트 반대 칼슘 BChip의 eformed의 Biofilms <ol><li> antifungal 약물 주식 솔루션이나 분말에서 RPMI-1640 배지에서 작업 솔루션을 준비합니다. 작업 솔루션의 일반적인 최대 농도는 1,024 μg / fluconazole에 대한 ML 및 amphotericin B 5 16 μg / ML 있습니다. 다른 농도는 여러 에이전트에 사용할 수 있습니다. </li><li> 가운데에있는 화합물의 예상 IC에서 50까지의 범위를 두 배 dilutions에서 재고 솔루션을 diluting하여 화합물의 8 개의 농도를 준비합니다. </li><li> biofilm 성장 24 시간 후, 최소한으로 (20 분 나트륨 차아 염소 산염 대우) 긍정 (단 미디어없이 약물 즉 세포)와 부정과 함께 컨트롤을 약물의 8 개의 농도의 50 NL를 인쇄하는 microarrayer를 사용하여 여섯 biofilms 위에 복제합니다. </li></ol> 참고 : 추가하면서 반점의 건조 방지를 위해 100 % 상대 습도를 유지마약을 접근한. <ol start="4"><li> 곧 마약을 추가한 후, 24 시간 동안 37 ° C에서 humidified 챔버에서 마약 칩을 알을 품다. </li><li> CaBChip에게 2 분 3-5 번 PBS의 모든 시간을 그런 일은하여 약물 씻어 37에서 0.5 μm의 FUN1와 30에 대한 ° C 분 9 칼슘 BChip을 잠복기로 얼룩. </li><li> 워시 모든 덩크 1-3 분 동안 PBS에서 칼슘 BChip에게 3-5 번 그런 일은으로 꺼져 얼룩 및 질소 스트림을 사용하여 CA BChip을 건조. 380의 PMT 게인과 532 nm의 파장의에서 microarray 스캐너 (GenePix 4100A, 축삭 인 스트 루먼트, CA)를 사용하여 형광 강도를 읽어보십시오. </li><li> 긍정적인 컨트롤 (노 약물) 및 100 %와 0 %에서 사망 (표백-대우) biofilm 명소의 형광 강도 각각 설정합니다. </li><li> 다음 방정식을 사용하여 제어 장소의 평균에 대한 상대 형광 강도 (F)의 감소에 의해 비율 억제를 결정 </li></ol><img alt="등식이" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> F, F 맥스와 F O는 원시 형광 약물 치료의 농도, 노 - 약물 제어 및 표백제 - 대우 명소, 각각 어디에 있는지. 스캐너 설정이 각각 F 맥스와 30000 및 4000 RFU의 F O를 얻기 위해 조정되었다. <ol start="9"><li> GraphPad 프리즘 소프트웨어 (라 Jolla, CA)를 사용하여 변수 경사의 언덕 방정식을 맞추하여 50 % 억제 농도 또는 IC에서 50 계산합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 48으로 구성된 대표적인 칼슘 BChip, × C의 나노 biofilms 16 배열 albicans은 그림 2에 표시됩니다. 명시야 현미경은 나노 biofilm의 전반적인 건축 기능을 보여줍니다. 곰팡이 균사가의 매트릭스 내에 내장되는 biofilm 쇼의 스캐닝 전자 현미경 이미지직경이 약 2 μm의 100 nm의 위치 콜라겐 섬유, 각각. FUN1 묻은 microarray 스캐너 이미지는 곰팡이 biofilms의 특성이지만 효모와 hyphal 형태를 보여줍니다. FUN1 묻은 biofilms의 2D 및 3D-공촛점 형광 이미지는 세포외 기질 (가 아니라 생산 exopolymeric 재료의 캡슐 재료와 가능성이 높습로 콜라겐으로 구성되어 내에 interspersed metabolically 활성 세포 지역으로 공간적 이질을 가지고 볼 수 있습니다 신진 대사 염색으로 물들일되지 biofilm 세포). biofilm의 두께는 약 50 μm의 것으로 추정되었다. 칼슘 BChip 두 약물, fluconazole과 amphotericin B의 antifungal 자화율을 추정하는 데 사용되었고, 그 결과는 그림 3에 표시됩니다. 업계 표준 96 - 웰 플레이트 assays에 게시된 보고서와 일치, biofilms는 fluconazole 10 계산 IC에서 50에 대한 저항력이 있습니다<html> amphotericin B는 0.3 μg / ML 11. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> 칼슘 BChip의 제조를위한 그림 1. 플로우 차트. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> 그림 2. 인쇄 높은 thoughput 칼슘 BChip의 사진이 로봇 microarrayer을 사용하고 PS-MA-코팅 슬라이드에 768 명소를 포함. 각 반구형 스폿 지름이 대략 700 μm의, 그리고 관광 명소 사이에 1.2 밀리미터 분리와, 볼륨 년 50 NL이다. 또한 (시계 방향) 표시 가벼운 현미경, microarray 스캐너, 2D 및 3D-형광 현미경, 그리고 칼슘 BChip에 대한 개별 biofilms의 전자 현미경 이미지를 스캔할 수 있습니다. 25,000 X의 높은 배율에서 SEM의 그림은 폭이 2 μm의의 hyphal 필라멘트를 보여줍니다. 그림 3은 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. 칼슘 BChip를 사용하여 () fluconazole 및 (B) amphotericin B에 대한 IC 50 값 antifungal 자화율 테스트 및 결정의 결과. amphotericin B-대우 biofilms의 형광 현미경 이미지 (C)에 표시됩니다. 결과는 평균 ± 표준 오차는 10를 포함하는 두 개의 개별 칩을위한 의미있는 것은 각각의 컨디션에 복제합니다.

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	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

호세 L. 로페스 - Ribot과 antifungal 요원을 개발하고 MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사에서 아난드 K. Ramasubramanian 자신의 자본. MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사는 이러한 연구에 대한 재정적 지원을 제공 않습니다.

우리는 칸디다 albicans biofilms의 nanoliter 볼륨으로 구성된 셀 기반의 고밀도 microarray, CA BChip을 개발했습니다. microarray는 비 확산, 반구형 3D 젤 필요한 소수성을 제공함과 동시에 콜라겐 겔 명소 강력한 첨부 파일에 허용되는 수정일 유리 기판에 인쇄되었다. 하나 카 BChip은 약 팔 96 - 웰 플레이트를 대체할 수 있으며, 여러 칩은 동시에 인쇄 및 처리할 수 있습니다. 칩, 나노 스케일...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 3 aminopropyltriethoxysilane (APTES) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 440,140 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 - 공동 Maleic 무수물 (PS-MA) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 426,946 </td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> 쥐의 꼬리 콜라겐 유형 I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,236 </td></tr><tr><td> 로봇 Microarrayer </td><td> Omnigrid 마이크로 </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Microarray 스캐너 </td><td> Genepix 개인 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> 하이브리드화 카세트 </td><td> ArrayIt 주식 회사 </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2 - 동생아RO-4-(2,3-dihydro-3 - 메틸 (benzo -1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-페닐 quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen 사 </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Fluconazole </td><td> Sicor 제약 주식 회사 </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> 시그마 </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech 주식 회사 </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> 세라믹 팁 190 μm의 오리피스 </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad 프리즘 소프트웨어 </td><td> GraphPad 소프트웨어 주식 회사 </td><td></td></tr><tr><td> Genepix 프로 V4.1 </td><td> 분자 장치 </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

칸디다 albicans는 현재 미국의 병원 1 번째 가장 일반적인 nosocomial 혈류 감염을 나타내는 칸디다 증의 주요 etiological 대리인, 남아있다. 이러한 기회 감염은 감염된 개인의 증가를위한 성장 위협하고 unacceptably 높은 사망률 속도를 가지고 다니십시오. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 antifungal 요원에 대한 저항의 출현에 또 antifungal 약물의 제한 무기고로 인한 부분이지만. 또한 치료를 복잡하게하는 것은 칸디다 증의 발현의 과반수가 biofilms의 형성과 관련있다는 사실이며, 이러한 biofilms 내의 세포는 대부분 임상적으로 사용되는 antifungal 요원 2 ~ 저항의 증가 수준을 보여줍니다. 여기 C. 구성되어 고밀도 microarray의 개발을 설명 우리가 칼슘 BChip 3라는했습니다 albicans 나노 biofilms. 간단히, 로봇 microarrayer이 t를 사용C의 O 인쇄 효모 세포 고체 기판 진입 albicans. 인쇄하는 동안, 효모 세포는 같은 50 NL 같은 낮은 적합한 코팅 유리 기판에 고정화 볼륨을 사용하여 입체 매트릭스로 묶여있다. 초기 인쇄 후 슬라이드는 biofilm 개발을 할 수 있도록 24 시간 동안 37 ° C에서 incubated됩니다. 이 기간 동안 반점이 성숙 C.와 관련된 일반적인 구조와 phenotypic 특성을 표시 그 완벽하게 개발된 &#39;나노 biofilms&#39;로 성장 albicans biofilms (즉 형태학의 복잡성, 입체 아키텍처 및 약제 내성) 4. 전반적으로, 칼슘 BChip는 ~ 750 상당하고 spatially 뚜렷한 biofilms 구성되어있다; 여러 개의 칩을 인쇄와 동시에 처리될 수있는 추가적인 장점과 함께. 세포 생존 능력은 FUN1 신진 대사의 형광 강도 microarray 스캐너를 사용하여 얼룩을 측정하여 추정된다. 이 곰팡이 칩은적으로 U 적합합니다antifungal 약물 발견을위한 진정한 높은 처리량 검사에서 SE. 현재 기준 (즉 biofilm 형성 5 96 - 웰 microtiter 플레이트 모델)에 비해 곰팡이 biofilm 칩의 주요 장점은 자동화, 소형화, 금액 및 시약과 분석 시간의 비용 절감뿐만 아니라 노동의 철폐입니다 집중 단계. 우리는 이러한 칩이 크게 antifungal 약물 발견 과정을 빠르게 것입니다.

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Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을 개발했습니다<em&gt; C. albicans</em&gt;라는<em&gt; 칼슘</em&gt; BChip. 약물 자화율 프로필에서 테스트<em&gt; 칼슘</em&gt; BChip는 곰팡이 칩이 이상적으로 antifungal 약물의 진정한 높은 처리량 검사에 적합 것을 제안하고, 기존의 96 - 웰 플레이트 모델과 비교입니다.

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K 조회수.  University of Texas at San Antonio. 우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을 개발했습니다 C. albicans라는 칼슘 BChip. 약물 자화율 프로필에서 테스트 칼슘 BChip는 곰팡이 칩이 이상적으로 antifungal 약물의 진정한 높은 처리량 검사에 적합 것을 제안하고, 기존의 96 - 웰 플레이트 모델과 비교입니다.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

연구

생체공학

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

오픈 소스 마이크로플레이트 호환 조명 패널용 애플리케이션

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...