우리가 제공 하는 CDDO-DFPA Reata 제약 감사. 우리는 또한 제인이 Seidman의 자 소아 암 혁신 (John Letterio)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 국방부의 [W81XWH-12-1-0452];에 의해 지원 되었다 앤 지 파울러 사춘기와 젊은 성인 암 연구 이니셔티브 경우 종합 암 센터; 그리고 F.J. 칼라 재단에서 Hsi 주 웨이 대 한 칼라 대학원 학술 상.

모든 연구는 케이스 서쪽 예비 대학의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1. 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs) 준비
<ol><li>압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>CO2 챔버를 사용 하 여 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 경골 비 골 및 대 퇴 골 뼈 수술가 위를 사용 하 여 삭제할 및 70% 에탄올 10 cm 배양 접시에 그들을 배치.</li>
	<li>외과 블레이드와 집게를 사용 하 여 조직 멀리 해 부 10 cm의 뚜껑에 가능한 만큼 요리 문화와 tibias 및 화관 6 cm 문화 접시에 70% 에탄올을 분리.</li>
	<li>외과 블레이드를 사용 하 여 tibias 화관의 양쪽 끝을 잘라. 23 G 바늘 3 ml 주사기에 3 mL PBS를 사용 하 여 12 ml PBS를 포함 하는 원뿔 튜브에 뼈의 한쪽 끝에서 골 수의 내용을 플러시합니다. 뼈의 양 끝에 대 한 3 배가이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>5 분 x 300g에 세포 현 탁 액 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 붉은 혈액 세포를 제거 하려면 5 분 동안 1 ml ACK lysing 버퍼 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>9 ml PBS ACK lysing 버퍼 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 희석에 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 ml 문화 매체 (RPMI 1640 플러스 L-글루타민, 10 %FBS, 1% 비 필수 아미노산 (100 배), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol, 및 5% 페니실린/스) resuspend. 참고: 내 수준 FBS에 EU/ml 미만 0.1을 수 있다.</li>
	<li>세포 현 탁 액 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 하 고 세포 현 탁 액의 20 µ l를 취할 trypan cytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하는 파란색의 80 µ l 믹스.</li>
	<li>1 x 106 셀/ml 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 셀 수를 조정 합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀/ml의 3 ml 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어. 참고: 주위에서 한 마우스 골 수 세포는 3-5 107 셀, 그것 수 있는 수 배치 됨을 나타내는 2에서 3 6 잘 플레이트에 배.</li>
	<li>3 일에 각 음에 2 ml 신선한 PBS를 추가 각 우물에서 모든 3 ml 문화 매체를 제거 하 고 부드럽게 소용돌이 모든 비 부착 한 세포를 제거 수 있도록 접시.</li>
	<li>3 ml 신선한 문화 매체를 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 각 잘 바꿉니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어.</li>
	<li>5 일에 직접 각 잘에서 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4 다른 3 ml 신선한 문화 매체를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어. 참고: 각 잘에서 총 볼륨은 이제 6 ml.</li>
	<li>7 일에 10 분 동안 얼음에 전체 접시를 넣어. 부드럽게 플라스틱에 서 스 펜 션에는 느슨하게 부착 BMDCs iDCs로 꺼내 려 각 잘 배양. 참고: 부착 세포는 판에 아직도 붙어있다. 낮은 온도 부드럽게 절차 추가 실험에 영향을 미칠 DC 활성화를 방지 하는.</li>
	<li>5 분 x 300g에 세포 현 탁 액을 원심 고 추가 실험에 대 한 신선한 문화 매체와 resuspend. 참고: BMDCs cytometry 여 CD11c 항 체 형광 표시로 확인할 수 있습니다 그리고 우리는 그림 1에서 추가 실험에 대 한 BMDCs의 제어 전략을 보였다.</li>
</ol>2. TolDC 유전자와 단백질 프로 파일 특징
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 와 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 1 h 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시. 참고: CDDO-DFPA, 합성 triterpenoid-처럼-2 요소 (Nrf2) 유도 및 핵 요인-κB (NF κB) 억제제 핵 요소 (erythroid 파생 2) 이다. IDCs, IL-10, 비타민 D3, dexamethasone 베이 11-7085, 등에서 TolDCs의 유도 대 한 다른 에이전트를 적용 하 고 각 에이전트에 대 한 최적의 조건으로이 단계를 수정 합니다.</li>
	<li>잠복기 4-24 시간 mDCs (부 화 시간은 다르다 때문에 mRNA 나 단백질 측정)를 유도 하는 것에 대 한 10 또는 100 ng/ml의 LPS 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 플라스틱 각 잘에서 배양 하 고 세포 현 탁 액 1 ml 피 펫을 사용 하 여 수확. 셀과 상쾌한, 각각 수집 하 5 분에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
	<li>Cytometry 같은 물질로 ligands에 의해 셀 펠 릿에서 표면 ligands를 분석: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL, 또는 억제 ligands: PD L1, L2 PD, ILT3, ILT4.</li>
	<li>셀 펠 릿에서 RNA를 분리 하 고 RNA와 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)와 ELISA, cytokine 프로필 및 유전자와 단백질 수준에 대 한 표면에 뜨는 샘플을 각각 분석. 참고: 예를 들면, 선 동적인 cytokines: TNF-α, IFNγ, EDN-1, 일리노이-6, IL-12, 및 IL-23, 또는 항 염증 성 cytokines: IL-4, IL-10 일-15, TGF-β1, 및 호-1.</li>
</ol>3. TolDCs의 기능 평가 생체 외에서 그리고 Vivo에서
<ol><li>
T-세포 Syngeneic 확산 분석 실험
	<ol>
<li>압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.</li>
		<li>0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 500 ml PBS 2 mM EDTA 사용 하 여 MAC 버퍼를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 필터링 하 여 버퍼를 소독. 참고: 다음 실험 기간 동안 얼음에 버퍼를 유지.</li>
		<li>CD4를+ T 세포, CO2 챔버를 사용 하 여 나이의 8-10 주 OT II T 세포 수용 체 (TCR) 유전자 변형 마우스를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다.</li>
		<li>6 cm 문화 접시에 2 ml PBS와 함께 비장을 넣고 3 ml 주사기의 푸시 스틱의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장을 말하다.</li>
		<li>셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.</li>
		<li>맥에서 버퍼의 400 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>CD4의 100 μ 추가+ T 셀 비오 틴-항 체 칵테일 5 분 동안 4 ° C에서. 참고: 항 체 칵테일 CD4 제외 하 고 다른 셀 형식에 바인딩+ T 세포, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, 안티-MHC 종류 II, Ter-119, 그리고 TCRγ/δ.</li>
		<li>10 분 4 ° C에서 맥 버퍼의 300 μ와 반대로 Biotin 구슬 (자료 테이블)의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>강자성 분야 (자료 테이블)의 열으로 구성 하는 장소 및 사전 분리 필터는 자석에 함께 필드와 맥 버퍼의 3 ml와 함께 그것을 씻어.</li>
		<li>셀에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 맥 버퍼의 9 ml를 추가 합니다.</li>
		<li>3 ml 맥 버퍼의 셀 펠 릿 resuspend 고 열에 적용 합니다. 수집 흐름-통해 포함 CD4+ T 세포.</li>
		<li>맥에서 버퍼의 또 다른 3 ml 열 세척 하 고 또한 흐름 통해 수집.</li>
		<li>비장 팬 Dc를, 안락사 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주 공동2 챔버를 사용 하 여. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다. 콜라 D 솔루션의 2 개 ml를 포함 하는 6 cm 문화 접시에 비장을 넣어 (2 mg/ml 콜라 D 칼슘, 마그네슘을 포함 하는 HBSS에 용 해).</li>
		<li>두 번 1 ml 주사기와 25 G 바늘 비장에 콜라 D 솔루션의 1 ml를 주사. 작은 위 비장을 작은 조각으로 잘라.</li>
		<li>동요 하 고 25 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 실 온에서 0.5 M EDTA의 500 μ를 추가 합니다. 참고: 3.1.13-3.1.14에서 단계는 Dc의 수율을 높이기 위한 중요 합니다.</li>
		<li>이제 푸시 스틱 3 ml 주사기의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장 슬러리를 말하다 centrifuging 5 분에 대 한 300 x g에 의해 세포 현 탁 액을 수집 하.</li>
		<li>맥 버퍼, FcR 차단 시 약의 50 μ와 10 분 동안 4 ° C에서의 팬 수지상 세포 Biotin 항 체 칵테일 100 μ의 350 μ에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: 항 체 DCs에 의해 표현 되지 않는다 항 원에 대 한 칵테일.</li>
		<li>5 분에 대 한 300 x g에서 맥 버퍼 및 원심 분리기의 9 ml를 추가 하 여 셀을 씻어.</li>
		<li>맥 버퍼의 800 μ에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 10 분 4 ° C에서 안티 Biotin 구슬의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>Dc를 수집 하는 3.1.9-3.1.11에서 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>씻어 맥 버퍼의 또 다른 3 ml와 함께 열 두 번을 통해 흐름 또한 수집 합니다.</li>
		<li>2 x 105 Dc/ml 100-400 nM 37 ° C에서 1 시간 별도로, 라벨은 CD4+ CDDO-DFPA T 세포 (1 x 107/ml)의 유무에 15 분 동안 37 ° C에서 1 μ M CFSE와, PBS로 세척 2 x 106 T 셀/ml에서 최종 농도 얻으려면 볼륨을 조정 하 고.</li>
		<li>다음으로 96 잘 접시에서 공동 CFSE 표시 된 CD4의 동일한 볼륨 처리 수지상 세포의 100 μ 문화+ T 세포, 1시 10분을 위의 단계에서 수집 된 둘 다 비율. 이제 보육의 2-3 일 후 잘 측정 CFSE 강도 cytometry에 의하여 T 세포의 당 100 ng/mL ovalbumin (OVA) 펩 티 드 323-329를 추가 합니다. 참고: 셀 숫자와 비율 Dc와 T의 세포 우리의 이전 작품37에서 최적화 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수동 유도 BMDCs를 주입 하 여 EAE Myelin Oligodendrocyte 당단백질 (MOG) (35-55)와 펄스
	<ol>
<li>1 시간 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시.</li>
		<li>추가 10 ng/ml LPS의 잠복기 24 시간.</li>
		<li>추가 100 μ g/ml 집 고 양이 (35-55)의 잠복기 4 시간.</li>
		<li>셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수확.</li>
		<li>PBS와 셀 펠 릿 resuspend 및 셀.</li>
		<li>피하 주사 200 μ 2 x 106 셀 8 10 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스 (100 μ 각 뒷 다리에).</li>
		<li>BMDC 주입 및 48의 날에 시간. 나중에, 200 주사 각 마우스에 백 일 해 독 소 (PTX)의 ng.</li>
		<li>반복 단계 3.2.6-3.2.7 4 연속적인 주 동안 매주 한 번 합니다.</li>
		<li>표준 기준37 (0.5-다리를 절 며 꼬리 끝, 1-다리를 절 며 꼬리, 2-보통 후방 사지 약점, 3 심각한 후방 사지 약점, 4 완전 한 뒷 다리 마비, 5 사지 또는 죽어가는 상태, 6-죽음)를 사용 하 여 매일 EAE의 임상 증상을 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

이 문서 사용할 수 있습니다. reproducibly iDCs를 생성 하 고 이후에 TolDCs로 그들을 분화 하는 효율적인 프로토콜을 설명 하 고 우리가 제안 하는이 TolDC를 유도 하기 위해 새로운 분자 대상 에이전트의 용량 평가에 적용할 수 있습니다. 표현 형입니다. 이 보고서에 설명 된 대로 우리는 우리가 먼저 표면 ligands의 TolDC 표현에 의해 분석 cytometry qRT-PCR과 ELISA로 측정 된 DC cytokine 프로필의 평가 다음 순서를 ...

모 수석 세포 (DCs)은 타고 난 면역 시스템의 필수적인 부분 및 처음 발견 되었고 기본 전문 항 원 제시 세포1로 1973 년에 랄 프 Steinman와 Zanvil Cohn에 의해 특징. Dc 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템22 차 림프 기관에 T 세포와 B 세포 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC) 통해 처리 항을 제시 하 여 면역 활성화에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 포유류 면역 시스템에서 Dc 골수성 Dc 및 plasmacytoid Dc (Pdc)3설명의 적어도 두 종류 있습니다. 기존의 DCs (cDCs)는 CD11c 표현의 특징이 며 골 조상 세포 또는 말 초 혈액 monocytes 사용 미 숙 Dc (iDCs) 체 외 로 분화 될 수 있다로 알려져 골수성 Dc granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 고 murine 또는 인간 종에서 각각4일 4.
'위험'을 활성화 신호, 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 또는 손상에 관련 된 분자 패턴 (습기), 다양 한 패턴 인식 수용 체 바인딩를 통해 성숙한 Dc (mDCs)으로 면역성 Dc 향해 iDCs 성숙 드라이브 것 이다와 같은 DC 표면5. 면역성 Dc 더 프라임 naïve T 세포 확산 및 MHCII2, costimulatory ligands (CD80, CD86, CD40)6, cytokines, 및 다른 수용 성 중재자7의 upregulation 통해 감 별 법. 면역성 Dc에서 프로-염증 성 중재자 생산의 T 세포 중재 하는 cytokine 분화에 대 한 필수적입니다. 예를 들어 IFN-γ와 IL-12은 Th1 차별화8 및 일리노이-1, 필요 일리노이-6, 및 IL-23가 순진한 Th17 세포9으로 T 세포 양극 화 합니다. 성숙한 Dc 외국 항 원에 반응, 비록 자기 항 원에 의해 통제 DC 활성화 수 있습니다 허용 오차 제거 원인과 그 활성화 조직 파괴10 리드 autoreactive T 세포를 생성 하 여 자가 면역 질환의 개발 육성 .
최근 보고서 그들의 능력과 그들의 조직 microenvironment 내에서 다른 큐와 상호 작용 하는 다른 이펙터/억압 DC 하위 집합으로 구분 하 여 exemplified 하는 DC가 소성의 분명 한 증거 제공. 안티-염증 성 중재자, IL-1011, TGF-β12,13 호-1 등 tolerogenic Dc (TolDCs)를 유도 하 여 면역 억제에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 이 TolDCs는 규정 하는 기능을 취득 하 고 T 세포 확산14억제. 또한, DCs에 의해 공동 자극의 부족 TolDCs에서 안티-염증 성 중재자의 생산 모두 규제 T 세포 (Tregs)의 감 응 작용을 하 고도 효과적으로 억제 하는 Th1과 Th17 차별화 및 확장15. 과거 2 년간, TolDCs의 치료 잠재력 보고 되었습니다 여러 수 사관. 이러한 연구에서 전 비보 의 자가 면역 질환16 의 다른 전 임상 모델에서 TolDCs 뿐만 아니라 ameliorated 병 적인 증상을 생성 하지만 환자17 면역 관용의 개발을 ,18. 흥미롭게도, 오늘 TolDCs 치료는 되었습니다 간주 대체 또는 대체 접근 방식으로 자가 면역 질환 등 여러 가지 임상 실험에 타입 1 당뇨병 mellitus19, 류 마티스 관절염20, 21, 다 발성 경화 증 (MS)22,,2324, 그리고 Crohn의 질병25.
다양 한 프로토콜을 TolDCs를 개발 하기 위해 고용 되어 있으며 여러 실험실 생성 및 TolDCs의 phenotypic 특성에 대 한 방법을 보고 있다. Reproducibly 조 혈 창시자에서 생체 외에서 TolDCs 생성 하 고 안정적으로는 tolerogenic 상태 vivo에서26,,2728,29에서 그들을 유지 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. iDCs 다양 한 immunomodulatory 약리학 대리인 또는 항 염증 성 cytokines에 노출에 의해 TolDCs로 변환할 수 있습니다. 예를 들어 비타민 d 3는 IL-10 생산을 증강 하 고 Dc에서 IL-12 분 비를 억제 하 고 그로 인하여 그들의 면역 기능30높일 수 알려져 유명한 약리 에이전트. 또한, Dc lipopolysaccharides (LPS) 등 강력한 염증 성 자극에 노출 되 면 dexamethasone31, rapamycin32, 코르 티 코 스테로이드33 등 여러 가지 약리 에이전트 표시 되었습니다 유도 하는 CD40, CD80 그리고 CD86, MHCII34의 DC 표면 식 줄여 TolDC 표현 형. IL-10과 TGF-β는 DC 내성35 와 이러한 cytokines의 둘 다에 수 반하는 노출 유도를 대부분 공부 항 염증 성 cytokines Dc36에서 tolerogenic 표현 형을 유도 하기 위해 표시 되었습니다.
DC phenotypic 표식으로 있다 보다는 기능적 특성에 의해 정의 됩니다 tolerogenic 이후 큰 TolDCs의 세포 및 기능 특성에 대 한 일관 된 방법을 개발 해야 합니다. 또한, 엄격 하 고 일관 된 프로토콜을 설정 해야 합니다 일관 된 평가 및 tolerogenic DC 형의 특성에 대 한 만약 우리가 효과적으로 그리고 reproducibly에서 TolDC 표현 형을 유도 하기 위해 새로운 에이전트의 능력을 비교 하는 실험실입니다. 여기 우리가 제공 상세한 프로토콜 단계별 방법 iDCs 마우스의 조 혈 창시자에서 분리 하 고 이후 TolDCs로 iDCs를 변환 하는 그들의 능력에 대 한 평가에서 새로운 에이전트의 효능을 분석 하는 강력한를 제공 하 TolDCs의 기능 그리고 phenotypic 특성 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 설명에는 그들의 표면 ligands, cytokine 단면도, 및 면역 기능에 생체 외에서TolDCs 하는 정교한 메서드가 포함 됩니다. 우리는 또한 MS, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)의 전 임상 모델에서 이러한 TolDCs의 잠재적인 치료 응용 프로그램을 탐색 하는 방법의 예를 제공 합니다. 이 설립된 프로토콜 조사 TolDCs의 유도 홍보 하기 위해 새로운 에이전트의 용량을 평가 하는 데 도움이 됩니다 그리고 TolDC 치료 개발의 범위를 확대 하기 위해 노력을 촉진 한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td>
			<td>Reata Pharmaceuticals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse GM-CSF</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>315-03</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-4</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>214-14</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>L2880</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>516732</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3097</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG (35&#8211;55) peptide</td>
			<td>21stCentury Biochemicals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated PD-L1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124307</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated MHCII</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-112-388</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423801</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan dendritic cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>A2058</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase D</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin (OVA) peptide 323&#8211;329</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>O1641</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01168134_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00434165</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY419-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse EDN-1 ELISA</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>ELM-EDN1-1</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00443258</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00446190</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>M6000B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-23a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01160011</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY1887-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm99999154_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01288386_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01178820_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13248</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8226</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Inc.</td>
			<td></td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

면역 체계는 외국 항 원에 대 한 조정 응답 사이 단단한 균형을 유지 하 여 운영 하 고 공생 생물에서 파생 된 항 원 뿐 아니라 자기 항 원에 대 한 응답 상태를 유지 하. 이 면역 항상성 장애 만성 염증 및 면역의 개발에 발생할 수 있습니다. 모 수석 세포 (DCs) 외국 항 원에 대 한 면역 반응 시작 naïve T 세포 활성화에 관련 된 타고 난 면역 계통의 전문 항 원 제시 세포 이다. 그러나, Dc T 세포 허용을 추진 하 고 유지 하 고 어느 면역 또는 만성 염증의 발전에 기여 하는 효과 기 세포를 억제 하는 TolDCs에 또한 분화 될 수 있습니다. TolDCs의 우리의 이해에 있는 최근 전진 그들의 분화 상태를 변조 하 여 DC 허용 오차를 얻을 수 있습니다 나왔다. 이 현상을 면역 관용에 휴식을 인해 발생 하는 수많은 면역 장애에 대 한 TolDC 요법 개발에 엄청난 성장을 주도하 고 있다. 전 임상 면역 murine 모델에서 성공적인 연구 자가 면역 질환의 치료에 TolDCs의 immunotherapeutic 유틸리티 유효성 검사 추가 있다. 오늘, TolDCs는 보호 면역을 그대로 하면서 병원 성 면역 응답을 대상으로 다양 한 면역 질환에서 면역 관용을 복원에 대 한 클리닉에서 유망한 immunotherapeutic 도구 되고있다. 전략의 배열을 TolDCs를 유도 하기 위해 여러 연구소에 의해 제안 되었습니다, 이러한 세포의 세포 고 기능 형 특성화에 없음 일관성. 이 프로토콜은 골 파생 Dc 큰 숫자, 합성 triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic와 TolDCs로 그들을 차별화 하는 데 사용 되는 독특한 방법의 개발에 대 한 단계별 가이드를 제공 합니다. 산 성-difluoro-틸-아 미드 (CDDO-DFPA), 그리고 TolDCs의 필수 분자 서명의 분석을 포함 하 여 그들의 표현 형을 확인 하는 데 사용 하는 기술. 마지막으로, 우리는 그들의 면역 반응에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 다 발성 경화 증의 전 임상 모델에서 테스트 하 여 TolDC 기능을 평가 하는 방법을 보여줍니다.

차별화와 BMDCs의 선택:
골 조상 세포는 7 일 (그림 1A)로 iDCs 분화 GM-CSF와 IL-4의 완전 한 RPMI 매체에 경작 했다. 하루에 1, 셀 크기에 작은 되었고 구형 형태를 보였다. 3 일에 신선한 매체의 교체 형태 클러스터 셀을 도움이 CD11c의 인구 증가 하기 전에 PBS로 세척+ 세포. 하루에 4, BMDCs 크기?...

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Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K 조회수.  Case Western Reserve University. 여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

비디오: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

세분화 및 Murine 비만 모델에서 지방 볼륨 측정 X 선 계산된 Tomography를 사용하여

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

연구

의학

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

Orthotopic 폐 이식의 Murine 모델에 Obliterative Bronchiolitis의 개발

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

PLAYLIST