저자는 그들의 협력 및 지원-특히 후세인 Almukhayzim, Hisham Aloudah에 대 한 실험적인 수술과 킹 사우드 대학, 의학 대학에서 동물 실험실의 직원을 감사 하 고 싶습니다. 저자 또한 시각을 준비 하기 위한 킹 사우드 빈 압둘 아지즈 대학에서 미디어 팀을 인정 하 고 싶습니다 자료 특히 Muath 빈 Ghannam 및 Abdulwahab Alsulami.

프로토콜의 킹 사우드 대학 윤리 위원회 동물 보호 지침을 따릅니다. 수술 절차, 마 취약, 그리고 동물에 이용 된 다른 약물 킹 사우드 대학 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다. 모든 실험 작업은 적절 하 게 훈련 된 직원에 의해 수행 됩니다.
1. 셀 시트 건설
<ol><li>Undiluted 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 문화 요리 (3.5 cm 온도 응답 문화 요리) 코트와 접시의 모든 표면을 커버를. 참고:이 단계는 단층에는 세포의 성장을 지원 하 고 셀 집계를 방지 이후 셀 시트의 분리에 대 한 중요 하다.</li>
	<li>포함 하는 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 24 시간을 위한 요리를 품 어.</li>
	<li>코팅된 요리에서 초과 FBS를 제거 하 고 요리 1 시간 이상 실 온 (RT)에서 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>3 셀 정지 준비: 1 x 106 HepG2 세포, BMMSCs, 1 x 106 HepG2 세포 및 (BMMSCs와 UCMSCs에 4: 1의 비율)에서 UCMSCs 가진 1 x 106 HepG2 세포.</li>
	<li>씨 각 레이블이 접시에 적절 한 세포 현 탁 액.</li>
	<li>DMEM 배양 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충에 있는 모든 셀을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>셀을 포함 하는 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>2. 셀 시트 분리
<ol><li>100% 셀 합류에서 37 ° C 배양 기에서 요리를 가져가 라.</li>
	<li>HepG2/BMMSC 및 HepG2/UCMSC 셀 시트 요리 포함 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 20 ° C에서 30-40 분 동안 잠복기 동안에 RT, 1 시간에 대 한 HepG2 세포 시트 접시를 품 어. 참고:만 HepG2에서 만든 셀 시트는 깨지기 쉬운; 20 ° C에 온도 감소 하면 시트의 구조에 손상을.</li>
</ol>3입니다. 수술의 성능
참고: 셀 시트 분리에 대 한 보육 시간 동안 동물 절차 시작.
<ol><li>
수술의 준비에 대 한 지침
	<ol>
<li>후드, 층 류 캐비닛, 등 무 균 수술 실, 실험실 내에서 살 균 별도 영역에서 모든 수술 절차를 수행 합니다. 수술의 모든 표면 비 다공성, 봉인, 내구성, 그리고 sanitizable 인지 확인 합니다.</li>
		<li>스크럽, 장갑, 검, 및 머리 및 구두 덮개를 포함 하 여 적절 한 보호 장구를 착용 하십시오.</li>
		<li>수술에 사용 하는 도구는 깨끗 하 고 소독 (압력가 마로 소독을통해 , 높은 압력에서 포화 줄기) 시작 부분에서의 수술.</li>
		<li>장갑을 쥐 사이 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술에 대 한 동물의 준비
	<ol>
<li>8 월에 12 주 된 누드 쥐를 사용 합니다.</li>
		<li>쥐에 대 한 주사 마 취를 만듭니다.<ol>
<li>마 취 솔루션을 준비, 케 타 민-xylazine, 2 mL의 마 취 제 (20 mg/mL의 농도)에 xylazine의 1 mL, 멸 균 생리 식 염 수 (예를 들어, 0.9% 염화 나트륨) 살 균 10 mL 혈 청 컬렉션 유리병에서의 1 mL를 혼합 하 고 전에 잘 흔들어 사용 하 여.</li>
			<li>마 취를 적용 하려면 intraperitoneally 쥐의 몸 무게의 100 g 당 케 타 민 xylazine 솔루션의 0.2 mL를 주사. 참고: 솔루션의 총 복용량은 100 mg/kg의 마 취 제 및 xylazine의 10 mg/kg 이다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수술 사이트에서 보이는 먼지/이물질을 제거 합니다.</li>
		<li>페달 철수 반사 (두 뒷 발에 발 패드 핀치)을 테스트 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다. 참고: 발 패드 핀치에 응답 하면 복용량의 0.05 mL/100 g (약 매 30 분), 반복 다음 마 취 깊이 다시 확인 합니다.</li>
		<li>Povidone-요오드/소 프로 파 놀에 의해 2 단계 스크럽으로 수술 영역을 치료.</li>
		<li>절 개의 오염을 피하기 위하여 무 균 드 레이프와 쥐를 커버.</li>
		<li>Buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 쥐를 피하 주사8 절 개를 하기 전에.</li>
		<li>살 균 메스를 사용 하는 7-하-10cm 스킨과 간 노출 기본 근육 사이 컷 확인 합니다.<ol>
<li>메스의 편평한 뒤 가장자리 피부에서 복 부 근육을 구분 합니다.</li>
			<li>조심 스럽게 찔 러는 교육 알바 메스를 사용 하 고 날카로운가 위 컷을 확장.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀 시트 이식
참고: 셀 시트 이식 간에 수행 됩니다.
<ol><li>문화 요리에서 셀 시트를 수집 합니다.<ol>
<li>부드럽게 벤치 시트는 표면에서 분리를 통해 문화 접시를 누릅니다.</li>
		<li>살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 30 원에 시트의 가장자리를 된다고 하 여 접시의 표면에서 셀 시트를 구분 합니다.</li>
		<li>부드럽게 문화 접시에서 전체 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>어떤 손상도 없이 그대로 시트 확인 그렇지 않으면, 그것은 수 없습니다 (그림 1)을 사용. 참고: 결과 시트를 직접 눈으로 감지할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 시트 접시에서 수확 살 균 막 (종이 필터)를 준비 합니다.<ol>
<li>첫째, 일반적인 염 분으로 막 담가. 그런 다음, 메 마른 목화 패드와 함께 과잉 염 분을 제거 합니다.</li>
		<li>주름과 기포 막과 셀 시트 사이 피하 면 서 젖은 막 셀 시트 장소.</li>
		<li>막 그리고 그들을 쉽게 수집 하 셀 시트 정상적인 염 분의 몇 방울을 추가 합니다. 참고: 셀 시트를 위반을 피하기 위해, 하 하지 차가운 식 염 수를 사용 하 고 집게와 막 셀 시트를 올려.</li>
		<li>셀 시트는 막에 제대로 장착 되었는지 확인 하려면 몇 초 동안 막 두고 그것을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간 세포 시트 이식에 대 한 준비.<ol>
<li>간 표면 살 균 목화 패드와 함께 부드럽게 그것을 활용 하 여 건조 하다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>소독 집게를 사용 하 여 셀 시트와 막 쥐의 간 단일 엽 놓습니다.</li>
		<li>살 균 염 분의 몇 방울을 추가 하 고 그것에서 셀 시트 분리 막에 부드러운 압력을 적용.</li>
		<li>신중 하 게 막 제거 하기 전에 5 분 기다립니다. 참고:이 셀 시트 제대로 간 연결 위해 수행 됩니다.</li>
		<li>마지막으로, 기본 근육 닫고 5-0 나일론 봉합 절 개 피부.</li>
		<li>Povidone-요오드와 수술 영역을 치료. 참고: 그림 2 누드 쥐의 간장에 셀 시트 이식 절차의 다이어그램을 보여 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 수술 후 관리
<ol><li>즉시 수술 후, 식인 풍습 또는 질 식, 방지 하려면 개별적으로 쥐를 집 고 그것은 정기적으로 (매 15 분) 모니터링 의식과 완전히 ambulant 때까지.</li>
	<li>그런 다음, post-operatively, 합병증을 매일 5-14 d, 5 d 이상에 대 한 쥐를 평가 합니다. 매일 평가 하는 동안 다음의 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>상처가 닫히고는 봉합 지나치게 꽉 되지 않고 그대로 있습니다.</li>
		<li>과도 한 열, 등 절 개 사이트에서 감염의 흔적은, 붓기 또는 purulent 방전.</li>
		<li>통증, 음식 및 물 소비를 감소, 체중 감소, 탈수, 피부 tenting, 또는 빠르고 오픈 입 호흡 등와 관련 된 흔적을 확인 하 고 있습니다. 제어 심한 수술 후 통증에 적당 한 경우, 주사 쥐 피하 buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 최소 48-72 h에 대 한 모든 6-8 h9 postoperatively.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 이식된 지역 분석
<ol><li>Scarifice 쥐 이식 후 한 달에 대 한 이식된 지역 수집 조직학 및 immunohistochemical 분석.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma:+an+overview.">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces.">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li><li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+(N-isopropylacrylamide).">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).</li><li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+1+(MSC1)-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis.">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).</li><li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats.">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li><li>. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats">https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats</a> (2017)</li><li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models.">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).</li><li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland.">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).</li><li>Driscoll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preclinical+new+drug+research+program+of+the+National+Cancer+Institute.">The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute.</a> Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).</li><li>Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+in+vivo+cancer+model+using+cell+sheet+engineering.">Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering.</a> Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering.">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li><li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair.">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li><li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology.">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent?.">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?.</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li></ol>

저자는 공개 없다.

연구의 광범위 한 금액은 적절 한 비보에 전 임상 동물 모델 인간의 암과 유사한 개발에 전념 하 고 있습니다. 현재, 암 동물 모델을 만드는 데 사용 하는 주요 접근 유전 공학 및 세포 이식11를 포함 한다. 유전자 변형된 동물 모델 식별 및 기본 약물 유발 독성 분자 메커니즘을 이해 뿐만 아니라 대상 유전자의 유효성 검사에 대 한 좋은 도구입니다. 그러나,이 모델은 관련 ?...

HCC는 간 크게 빈약한 예 지와 관련 된 기본 암입니다. 매년, 거의 절반 백만 새로운 환자 진단 HCC, 간 암 환자 세계1의 85%를 대표 하는. Hepatocarcinogenesis는 단일 형태의 질병; 오히려, 그것은 이외에 다른 histopathological 기능 및 유전자와 게놈 다양성, 질병의 모음 다양 한 전조 결과1. 따라서, HCC에 대 한 효과적인 치료 전략의 개발의 주요 과제는 HCC 생물학의 제한 된 지식과이 복잡 한 질병을 이해 하는 것을 도울 수 있는 적합 한 실험 동물 모델의 부족. Vivo에서 동물성 모형 인간 암 모방 하는 후보 유전자를 선택 하 고 연루 조사 암 응답에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인 뿐만 아니라 암 유도, 전조/예측 마커 식별에 필요한 치료 요원입니다.
시험관에 암 연구는 여전히 주요 한계에 연관 된다. 이 사실은 암 세포 기능의 그들의 비보에 문화에서 유지 될 때 많은 손실입니다. 세포 생체 외에서 결과 비보 전 설정에서 전체 조직 생리학의 부재에서 발생 하는 변경 합니다. 암 세포 세포 상호 작용 (실질, 면역, 맥 관 구조, 상피, 등) 종양 microenvironment 내 암 세포 특성2에 크게 반영합니다. 종양 microenvironment 암 세포 유전자/단백질 표정 및 angiogenetic 및 전이성 잠재력 phenotypic 특성을 변경할 수 있습니다. 2 차원 (2 차원) 생체 외에서 문화 시스템은 또한 종양의 진행을 조절 하는 데 필요한 적합 한 조직 매트릭스를 결여 된다. 따라서, 이러한 제한으로 인해 모델 vivo에서 항상 체 외에 모델의 예비 결과 지원 하기 위해 활용 되어야 합니다. 이 연구에서 우리는 vivo에서 동물 모델을 기본 HCC 완전 한 생물학 과정을 보통 개발 하 셀 시트 기술을 사용 합니다.
이상 10 년 전, 오 카노의 실험실 설립 셀 시트 기술3에 따라 조직 공학의 새로운 방법. 이 기술은 표면 hydrophobicity를 제어 하 여 가역 세포 접착/분리 수 있도록 온도 응답 문화 플라스틱을 이용 한다. 이 메서드는 잘된 세포 외 기질 (ECM) 및 셀 상호 그대로 3 차원 (3 차원) 형식 (i.e.,cell 시트), 배양된 세포의 부드러운 수확을 수 있습니다. 셀 시트 기술은 상업적으로 사용할 수 및 사용할 준비가 문화 요리 (PIPA) 오전, 온도 반응 중합체 poly(N-isopropylacrylamide) precoating을 해야 합니다. 온도 20 ° c에서 PIPA 오전 고분자 화 되 고 반면, 더 높은 온도 (37 ° C)에서 중합체 탈수 되 고 혼 탁 한 침전 변환 수성 솔루션에 용 해. 고분자는 친수성 아 미드 체인 및 소수 성 측 쇄 (이소프로필 그룹)를 포함합니다. 높은 온도에서 물 분자의 브라운 운동 강화입니다, 반면에, 낮은 온도에서 수산화 구조 분석의 이소프로필 그룹 및 소수 성 이소프로필 그룹을 둘러싼 물의 분자 집계 때문에 소수 성 상호 작용. 따라서, 고분자의 전체 체인 집계 하 고 침전 물이4.
제시 연구에서이 기술은 세 가지 다른 셀 시트를 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발 채택 된다. 첫 번째 시트 고용 이루어져 HCC 셀 라인만, 반면 다른 두 시트 HCC 셀 라인 셀과 두 개의 서로 다른 소스에서 MSCs의 조합으로 구성: 골 MSCs (BMMSCs) 및 탯 MSCs (UCMSCs). MSCs는 비 조 혈 stromal 세포 adipocytes, 등 osteocytes, chondrocytes, myocytes5엽 혈통의 intocell 파생 상품을 차별화 할 수 있다. 암 셀 시트를 만들 때 이러한 세포를 사용 하는 우리가 하는 이유는 암에 MSCs의 효과에 일치 하지 않는 보고. MSCs가 두 가지 고기를 가질 수 있습니다 제안 되었습니다: "MSC1", proinflammatory 표현 형 및 "MSC2", 면역 표현 형6. MSCs는 수용 체 통행세 같이 (TLRs)를 표현 한다. MSCs의 TLR4 못쓰게 TLR3 못쓰게 면역 요인6의 그들의 분 비를 증가 하는 반면 proinflammatory 요인의 그들의 분 비를 증가 시킵니다. 이러한 두 고기의 생체 외에서 연구 보고 MSC2 공동 문화 반대 효과7를 했다 하는 동안 암 세포 라인 MSC1의 공동 문화 암 세포 성장를 감쇠. 이 연루 MSCs 프로 암 또는 항 암 제, 그들의 표현 형에 따라 될 수 있습니다. 따라서, 셀 시트 기술을 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발, 뿐만 아니라 우리 종양 개발에 MSC 이식의 효과 탐험 하고자 이러한 세포를 사용 하 여 것입니다 향상 여부 등이 모델의 개발을 줄이기 위해.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sterile physiologic saline</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Human HepG2 cell line</td><td>ATCC, USA</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Human bone marrow MSCs cell line</td><td>PromoCell, USA</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>human umbilical cord tissue MSCs</td><td>PromoCell, USA&amp;nbsp;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 50%</td><td>Rompun, Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 2%</td><td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>Alphadine&amp;reg;&amp;nbsp;solution.</td><td>Riyadh Pharma</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Disposables:&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)</td><td>Sigma</td><td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &amp;micro;l &amp;nbsp;Pipette Tips&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CLS4868-1000EA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Basic Procedure Drape</td><td>Thermofisher</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus pipette, variable volume</td><td>Eppendorf&amp;reg;&amp;nbsp;Research&amp;reg;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture incubator 37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture incubator 20 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical tools and nude rats:&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scalpel&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Nylon Suture&amp;nbsp; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>Monofilament, Lancet</td></tr><tr><td>1 ml Tuberculin Syringes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>Nude rats&amp;nbsp;</td><td>Charles river</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

exploring the potential of mesenchymal stem cell sheet on the development of hepatocellular carcinoma in vivo

vivo 동물 모델을 모방한 인간의 암 중요 한 임상 정보를 제공 하는 다양 한 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. Vivo에서 암 모델의 개발에 대 한 현재 사용 된 기술에는 상당한 제한이. 따라서, 본이 연구에서는 우리 셀 시트 기술을 vivo에서 암 모델 개발을 구현 하고자 합니다. 간세포 암 (HCC) 누드 쥐 HCC 셀 선 세포에서 만들어진 셀 시트를 사용 하 여 성공적으로 개발 됩니다. 암 셀 시트는 세포내 접착 및 세포 외 매트릭스 제어 층 상된 구조 형성을 통해 생성 됩니다. HCC 시트 이식 간 고 한 달 내 종양-베어링 동물 모델의 생성에 대 한 수 있습니다. 또한,이 암 모델 개발에서 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 역할은 조사. HCC 셀 라인 시트 외에 다른 두 셀 시트 만들어집니다: HCC 세포와 골 MSCs (BMMSCs)와 HCC 전지와 탯 MSCs (UCMSCs)의 시트의 시트. HCC 세포와 MSCs의 시트는 종양 방위 동물을 생산 할 수 있습니다. 그러나, MSCs의 추가 구성 된 종양의 크기 줄이고 종양 개발에 불리 한 영향이 사용된 MSCs의 소스에 따라 달라 집니다. 이 특정 MSC의 만든 셀 시트 종양 관리 및 제어에 활용 될 수 나타냅니다.

쥐에 이식된 셀 시트 tumorigenicity:
이식 후 1 개월 쥐의 간은에서 모든 이식된 셀 시트 종양 (그림 3)를 개발 했습니다. HepG2, HepG2/BMMSC, HepG2/UCMSC 셀 시트에서 개발 된 종양의 평균 크기 4.5 cm, 4 cm, 및 2.5 cm, 각각10했다.
간 조직?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo at JoVE.com

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

여기, 우리는 vivo에서 암 모델 셀 시트 기술을 사용 하 여 개발 하는 프로토콜을 제시. 이러한 모델은 항 암 치료제의 평가 위한 매우 유용할 수 있었다.

Vivo에서 간세포 암 종 개발에 중간 엽 줄기 세포의 잠재력을 탐험

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

exploring-potential-mesenchymal-stem-cell-sheet-on-development

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

5.8K 조회수.  Ministry of National Guard Health Affairs. 여기, 우리는 vivo에서 암 모델 셀 시트 기술을 사용 하 여 개발 하는 프로토콜을 제시. 이러한 모델은 항 암 치료제의 평가 위한 매우 유용할 수 있었다.

비디오: Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded elucidation of the underlying mechanisms and development of innovative immunotherapeutic strategies. To develop an ideal animal model recapitulating human HCC, immunocompetent male C57BL/6J mice first receive a carbon tetrachloride (CCl4) injection to induce liver fibrosis, then receive histologically-normal oncogenic hepatocytes from young male SV40 T antigen (TAg)-transgenic mice (MTD2) by intra-splenic (ISPL) inoculation. Androgen generated in recipient male mice at puberty initiates TAg expression under control of a liver-specific promoter. As a result, the transferred hepatocytes become cancer cells and form tumor masses in the setting of liver fibrosis/cirrhosis. This novel model mimics human HCC initiation and progression in the context of liver fibrosis/cirrhosis and reflects the most typical features of human HCC including immune dysfunction.

Here, we describe the development of a clinically relevant murine model of liver cancer recapitulating the typical immune features of hepatocellular cancer (HCC).

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

연구

암 연구학

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

의학

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

&quot;환자와 같은&quot;동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

생체공학

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

생물학

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of clinical efficacy, they are until now imperfect solutions. Stem cell therapy using ASC sheets could provide a solution to this problem. ASCs are considered as promising candidates for promoting tissue healing because of their trophic and immunomodulatory properties. Here, we provide methods to produce high-density ASC sheets, that are transplanted onto a colorectal anastomosis in a rat model to reduce the leakage. ASCs formed cell sheets in thermo-responsive culture dishes that could be easily detached. On the day of the transplantation, a partial colectomy with a 5-suture colorectal anastomosis was performed. Animals were immediately transplanted with 1 ASC sheet per rat. ASC sheets adhered spontaneously to the anastomosis without any glue, suture, or any biomaterial. Animal groups were sacrificed 3 and 7 days postoperatively. Compared to transplanted animals, the incidence of anastomotic abscesses and leakage was higher in control animals. In our model, the transplantation of ASC sheets after colorectal anastomosis was successful and associated with a lower leakage rate.

The preparation and transplantation of adipose tissue derived stem cell (ASC) sheets onto insufficiently sutured colorectal anastomoses in a rat model is presented. This novel application shows that ASC sheets can reduce colorectal anastomosis leakage.

쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

면역학 및 감염병학

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.