우리는 전문가 기술 지원을 위한 Irmgard와 이즈를 감사합니다. 이 작품은 나노미터 범위에 현미경 검사 법에 대 한 우수성의 클러스터 (CNMPB, b 1-7, T.D.) 뇌의 분자 생리학을 통해 DFG에 의해 지원 되었다.

아니 살아있는 동물 연구를 실시 했다. 안락사 동물 세포 문화 승인 아래 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다를 포함 하는 실험 번호 T10/30. 실험 승인 프로토콜 실시 했다.
1. 기본 Hippocampal 세포 배양
<ol><li>배아 하루 1916,17에 쥐 해 마의 천연된 세포 배양을 준비 합니다. 12 m m coverslips polyethyleneimine (페이) 50000-60000 셀/잘의 조밀도에 24-잘 요리 코팅에 셀 접시 챔버 및 단계 대조 광학 계산 셀을 사용 하 여 밀도 확인 합니다.</li>
	<li>3 일 동안 (하루 생체 외에서 (DIV) 3) 5% CO2와 37 ° c 배양 기에서 24-잘 접시에서 뉴런을 문화.</li>
	<li>전송 된 가벼운 현미경 검사 법 (예를 들어, 단계 대조 광학 10-20의 확대)를 사용 하 여 셀 건강의 지표에 대 한 coverslips를 평가 합니다. 건강의 다음 지표에 대 한 확인: 명확한 단계 대비 후광, 파란색된 구조 없이 neurites 그리고 소마 클러스터링 또는 neurite 번들.</li>
</ol>2입니다. transfection
참고: 다음 프로토콜 3 웰 스에 대 한 이중 transfection를 말합니다. 그러나, 프로토콜 금액 4 우물에 대 한 충분 한 준비가 때 가장 잘 작동 합니다.
<ol><li>Transfection 버퍼 (274 m m NaCl, 10mm KCl, 1.4 m m 나2HPO4, 15 m m 포도 당, 42 mM HEPES)의 500 mL를 삼각 플라스 크에 준비 합니다.<ol>
<li>8.0 g의 NaCl, KCl의 0.37 g, 나2HPO4의 0.095 g, 포도 당의 1.35 g와 400 ml 삼각 플라스 크에 증류수의 HEPES의 5.0 g을 분해.</li>
		<li>PH 미터를 사용 하 여 1 M NaOH와 6.95에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>500 ml 증류수와 볼륨을 조정 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 확인 하십시오.</li>
		<li>Transfection 버퍼 pH 값의 20-30 mL aliquots pipetting 1 확인 transfection 버퍼에 M NaOH: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11. 참고: transfection 버퍼의 pH transfection 효능에 대 한 결정적 이다.</li>
		<li>테스트 하려면 transfected 세포의 높은 숫자가 있는 transfection 버퍼 리드, 7.11 6.96에서 각 pH 값을 테스트 합니다. 2.2 2.11 및 검증된 플라스 미드 GFP 표현에 설명 된 transfection 방법을 사용 합니다. 버퍼는 최고의 작품을 평가 하는 모든 transfection 버퍼 pH 값 coverslip 당 transfected 세포의 수를 결정 합니다.</li>
		<li>Aliquot 2 mL microcentrifuge 튜브로 높은 transfection 효율 버퍼 동결 및 저장-20 ° c.에 튜브</li>
	</ol>
</li>
	<li>미리 따뜻한 물 목욕에서 37 ° C에 증류수, 세포 배양 매체, 감소 된 혈 청 매체.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 transfection 믹스를 준비 합니다. 살 균 작업 조건을 보장 하기 위해 층 류 후드 작동 합니다.<ol>
<li>믹스 7.5 µ L 2 M 염화 칼슘의 각 내 무료 DNA (Synaptophysin-mOrange 및 mGFP/GFP-Rogdi)의 4 µ g. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 60 mL의 총 볼륨에 도달 물을 추가 합니다.</li>
		<li>믹스를 transfection 버퍼의 60 mL를 추가 합니다. 최상의 결과 얻으려면 추가 transfection 버퍼 dropwise 소용돌이에 DNA-믹스를 부드럽게 흔들어 동안.</li>
		<li>20 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어. 층 류 두건 옆 튜브를 배치 하 여 보육 시간 동안 부 화 튜브를 떨고 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>층 류 두건에서 1000 mL를 피펫으로 사용 하 우물에서 세포 배양 매체 (이 하 "조건된 매체")를 제거 하 고 인큐베이터에서 별도 컨테이너에 저장 합니다.</li>
	<li>각 우물에 감소 된 혈 청 매체의 500 mL를 추가 합니다. 20 분 잠복기 (2.3.3 단계)가 끝날 때까지 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 품 어.</li>
	<li>여러 상품 pipetting으로 각 잘 하 transfection 믹스의 30 mL를 추가 합니다. 튜브의 바닥에 찌 꺼 기를 삭제 합니다.</li>
	<li>모든 우물이 transfection 믹스와 함께 제공 된, 후 부드럽게 transfection 혼합 매체에서의 배포를 보장 하기 위해 24-잘 접시를 흔들.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO260 분 동안 우물을 품 어.</li>
	<li>제거 및 transfection 믹스를 폐기 하 고 세포 배양 매체와 세 번 씻어. 각 우물에 세포 배양 매체의 1 mL를 추가 하 고 매체의 실시간 제거 750 mL에서 30 초 동안 그들을 품 어 신선한 매체의 동일한 금액을 추가. 이 세 번 반복 합니다. 참고: 세척 단계는 중요 한. 최소한 각 잘 없는 매체는 시간 유지 (즉., 제거 하 고 잘에 의해 잘 대체) 부드럽게 세척 매체를 추가.</li>
	<li>제거 하 고 세포 배양 매체를 버리고 바른된 중간 잘-의해-우물의 450 mL를 추가.</li>
	<li>DIV 10 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 성숙한 뉴런을 하자.</li>
</ol>3. 자극과 Syt1 통풍 관
참고: 다음 프로토콜 글귀 3 웰 스에 적용 됩니다. 웰 스의 다른 수의 도발은에 대 한 금액을 적절 하 게 조정 합니다.
<ol><li>50 mL 삼각 플라스 크에 10 x 도발은 버퍼 (640 m m NaCl, 700 m m KCl, 10mm MgCl2, 20 m m CaCl2, 포도 당 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7.4)을 준비 합니다. 참고: 도발은 버퍼 수 보관 4 ° C에서 몇 주 동안. Depolarizing 비 솔루션은 또한, 사용 하는 경우, 10 준비 1290 m m로 구성 된 x Tyrode의 솔루션 NaCl, KCl, 10mm MgCl2, 50mm 20 m m CaCl2, 300 m m 포도 당, 200 mM HEPES pH 7.4 비교 하기 위해 자극 유발 자발적 재활용 재활용. 1 x 희석, 1 µ M 테트로도톡신의 활동 전위 생성을 차단 하는 사용 하기 전에 추가 합니다.<ol>
<li>1.87 g의 NaCl, KCl, MgCl2-6 H20의 0.1 g, CaCl2-2 H2O의 0.15 g과 포도 당-1 H2O의 3.0 g와 삼각 플라스 크에 증류수 50ml에 HEPES의 2.38 g의 2.61 g을 분해. NaOH와 살 균 필터 솔루션 pH를 조정 합니다. 1 x 농도 달성 하기 위해 증류수에 희석 버퍼 1시 10분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>자극 후 고정을 위한 1 개의 x PBS (pH 7.4)에 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.<ol>
<li>4%의 500 mL에 대 한 1 x PBS에 PFA 분해 450 ml 증류수 H2o.의 paraformaldehyde의 20 g 참고: 솔루션을가 열 용 해, 최대 속도 수 있습니다 하지만 PFA 수 분해로 솔루션 70 ° C 이상가 열 하지 마십시오. 주의: PFA 이며 독성, 잠재적으로 발암 성 않았음. PFA 작업할 경우 장갑을 착용 연기 후드, 작업과 섭취 하지 않도록 합니다.</li>
		<li>Rt 솔루션 식 고 10 배 PBS 재고 솔루션 50 mL를 추가 합니다. NaOH/HCl pH 미터를 사용 하 여 함께 pH 7.4에 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미리 버퍼 도발은 x 1의 600 mL와 10 mL 물 목욕에서 37 ° C에 세포 배양 매체의 따뜻한.</li>
	<li>10 초 동안 x 도발은 버퍼 및 회오리 1 마우스 안티 Syt1 항 체 (클론 604.2)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>제거 하 고 세포에서 세포 배양 매체를 삭제. 각 잘 하는 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 5 분 동안 품 어 도발은 항 체 혼합의 200 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>제거 및 삭제 도발은 항 체 혼합 하 고 세포 배양 매체와 세 번 씻어. 각 우물에 세포 배양 매체의 1 mL를 추가 하 고 매체의 실시간 제거 750 mL에서 30 초 동안 품 어 신선한 매체의 동일한 금액을 추가. 세 번 반복 합니다.</li>
	<li>제거 및 세포 배양 매체를 삭제 하 고 300 mL 4%의 추가 PFA 1 x PBS에. 4 ° c.에 20 분 동안 품 어</li>
	<li>1 x PBS 각 5 분 동안 세 번 씻는 다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>4입니다. Immunocytochemistry
<ol><li>블로킹 버퍼의 50 mL를 준비 합니다. 참고: 버퍼를 차단 수 있습니다 보관-20 ° C에서 몇 달 동안.<ol>
<li>10 x PBS 재고 솔루션의 5 mL에 자당의과 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 1 g 2.5 g를 용 해. 10% 세제 재고 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다. 모든 구성 요소는 제대로 녹이 고 증류수 H2O 50 mL의 최종 볼륨을 도달할 때까지 추가 때까지 솔루션을 저 어. 약 수는 솔루션 및 스토리지에 대 한 aliquots를 동결.</li>
	</ol>
</li>
	<li>보조, fluorophore 결합 항 체 (기본 Syt1 항 체 종에 대 한 감독)에 1:1000의 희석에 각 잘 차단 버퍼의 200 mL에 희석.</li>
	<li>제거 하 고 각 잘을 포함 하는 coverslip에서 1 x PBS를 삭제.</li>
	<li>버퍼-항 체 혼합 각 잘 차단의 200 mL를 추가 하 고 실시간에 60 분 동안 품 어 주의: 2 차 항 체는 빛에 민감한, 때문에 앞으로 이동 하는 모든 단계는 어둠 속에서 수행 합니다.</li>
	<li>부 화, 후 셀 1 x PBS의 1 mL와 5 분 동안 세 번 씻어.</li>
	<li>포함 매체와 현미경 슬라이드에 coverslips를 포함 합니다.<ol>
<li>현미경 슬라이드에 매체를 포함 한 7 mL 방울을 추가 합니다. 주사기와 그것을 해제 하 고 집게로 잡아 여는 coverslip 24-잘 접시에서 제거 합니다. 주의:는 coverslip의 표면에 세포는 쉽게 손상, 그래서 집게 관리와 처리 해야 합니다.</li>
		<li>으로 PBS를 제거 하 고 부드러운 조직에 한 가장자리를 만져 그것을 신중 하 게 건조 하는 coverslip 찍어.</li>
		<li>셀을 운반 표면 얼굴 현미경 슬라이드, 그로 인하여 포함 매체 셀에 포함 되도록 포함 중간 물방울에 coverslip 플립.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1-2 h의 후드 아래에서 말리를 슬라이드를 두고 (빛에 노출을 피하기 위해 그들을 커버) 4 ° c.에 현미경 슬라이드 상자에 보관 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>5. 현미경 분석
<ol><li>coverslips, 건조 후 목표와 카메라 현미경 그들을 놓습니다.</li>
	<li>회색 값의 최대 배포 되도록 몇 픽셀 과도 노출 되도록 모든 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다. 참고: 노출 시간 채널 간에 다를 수 있지만, 그것은 해야는 coverslips 사이 comparability을 위해 1 개 채널에 대 한 상수.</li>
	<li>관심 (ROIs) coverslip 당 10 영역에 대 한 다중 채널 이미지를 취득 합니다. Punctate 해야하는 GFP 형광을 확인 하 여 투자 수익에 transfected 신경에서 axonal 프로세스 포함 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>.Tif 파일로 이미지를 내보냅니다. 파일 을 클릭 하 여 오픈 뷰18 에 이미지를 로드 | 로드 이미지 파일입니다.</li>
	<li>채널 1로 Synaptophysin mOrange 이미지, Rogdi-GFP/mGFP 이미지로 2, 채널 및 채널 3로 Alexa647 형광 이미지를 선택 합니다.</li>
	<li>ROIs 임계값입니다.<ol>
<li>분석 을 클릭 | Puncta 이상의 장소 지역. 육안 검사에 따라 확산 형광 제외, 채널 1의 이미지에만 punctate 신호 (대표 Synaptophysin mOrange 형광)을 떠나 있도록 임계값 및 델타 강도 값을 선택 합니다. 모든 이미지에 대 한 동일한 임계값을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지금 실행을 클릭 하 여 해당 채널 2에 이러한 ROIs (GFP-Rogdi/mGFP 형광) 및 3 (Syt1-형광) 각 coverslip 영역을 전송. 참고: 셀이 더블 페는 ROIs만 고려 한다. 이 방법에서는, mOrange 및 GFP 형광 명확 하 게 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>로그 데이터를 클릭 하 여 분석 로그 편집기에 데이터를 저장 합니다.</li>
	<li>분석 로그 편집기 Windows 탭에서 열고 각 채널에 대 한 값을 복사 합니다. 스프레드시트에 별도 채널에 대 한 값을 붙여 넣습니다.</li>
	<li>두 transfection 조건 (GFP-Rogdi 및 mGFP)에서 ROIs에서 Syt1 채널의 평균 형광 강도 결정 합니다.</li>
	<li>상당한 차이 확인 하기 위해 학생의 t-검정 등 적절 한 통계적 테스트를 적용 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

정기적으로 재활용 시 냅 스 소포 (SV)를 공부 하는 데 사용 하는 3 개의 분석을 확인 하 고 있습니다. 처음 두의 사용을 포함 한) 형광 styryl FM1-43 (이 막에 통합 하 고 세포로 endocytosis, 동안 채택 exocytosis 후 해제 됩니다); 같은 염료 그리고 b) 붙일 재조합 SV 단백질 (, overexpression, 따라 배치할 재활용 기계에 통합) 태그. 연결 된 fluorophores 그들의 형광은 pH에 따라 변경는 SV의 산 성 내부와 extracellular 매체의 pH 변화를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 재조합 형 단백질 GFP의 pH에 민감한 변종 태그 Phluorins 라고 합니다. 두 분석 논의 되었습니다 모두 이전19,20, 그리고 각각의 찬 부 양론 또한 검토21되었습니다.
여기, 우리는 세 번째, 잘 설립 방법4,5,6,7,,914설명합니다. SV 재활용을 테스트 하려면 우리 활용 사실 소포 관련 단백질 Synaptotagmin-1 (Syt1)의 luminal 도메인 exocytosis 시 세포 표면에 노출 된다. 첫째, 우리는 항 체는 다음에 의해 촬영에 소포 SV 재활용 하는 동안 문화 매체에 luminal 도메인에 대 한 감독을 추가 합니다. 이 항 체 이해 시각 이며 면역 형광에 의해 정량 합니다. 또는, 직접 레이블이 Syt1 항 체를 사용할 수 있습니다. 라벨은 pH-독립, 지역화 Syt1-항 체의 내부와 SVs, 또는 pH 의존의 외부 표면에 형광 변화를 기반으로 하는 지역화 보고 보고 될 수 있습니다. 우리는 또한이 SV 재활용 분석 결과 단백질, GFP-Rogdi, 관심 대상 기능 synapses와 SV 재활용에 영향을 미치는 여부를 테스트 하려면 양식된 뉴런의 더블 transfection의 조합을 설명 합니다. GFP Rogdi는이 접근; 그러나, 관심사의 어떤 단백질에 대 한 같은 질문을 해결할 수 있습니다.
이 분석 결과 SVs4 의 자발적인 재활용 모니터링을 1992 년에 처음 도입 하 고 갖는 SV12재활용을 모니터링 하는 데 같은 그룹에 의해 더 개발 되었다. 그들의 실험 Syt1 글귀는 SV exocytosis12차단 clostridial 신경에 민감한 설립. 그들은 또한 자극 도발은 37 ° C에 의해 문화의 대부분 endocytosis 방지, 얼음에 보관 된 문화 1)에 비해 2) 문화, 자극 없이 37 ° C에서 incubated Syt1 항 체의 국제화 강화 보여주었다는 자발적 재활용 가능 하지만 재활용12,22를 연상 하지 않습니다. 분석 결과 쉽게와 관심의 분자 없이 SV와 같은 두 가지 조건 사이 재활용 비교할 수 있습니다. 특히,이 프로토콜은 특정 overexpressed 단백질의 부재와 존재에서 Syt1 항 체 이해를 비교에 집중 한다. 표면-바인딩, 자발적인 재활용 및 재활용 evoked의 상대적 기여 평가 될 필요가 있는 경우 프로토콜을 확장할 수 있습니다. 예를 들어 신경 자극 없이 얼음에 잠복기 endocytosis Syt1 항 체의 어떤 표면 바인딩을 공개를 방지할 수 있습니다. 테트로도톡신 기저 솔루션에서 37 ° C에서 뉴런 잠복기 자발적 재활용 공개 활동 전위 전파를 방지 합니다. 따라서, 잠복기 신경 자극 조건 수에서 37 ° C에서 갖는 SV 재활용의 범위를 공개 했다.
라이브 셀 이상적인 생리 조건;에 민감합니다. 따라서, 유지 보수, transfection, 및 버퍼 도발은 항상 시험 되어야 한다 pH, 온도 등 생리 적인 매개 변수에 대 한. 도발은 버퍼 산도 조정 되었습니다 후 살 균 필터를 통해 전달 될 수 있습니다, 하는 동안 transfection 버퍼 살 균 필터링 민감합니다. 따라서, 우리의 pH 조정, 사용까지 동결 그것을 유지 하 고 작은 어떤 박테리아를 탁상 원심 분리기에서 회전. Transfection를 위해 적절 하 게 인산 칼슘 크리스탈 플라스 미드의 협회를 위해 버퍼를 혼합에 생명 이다. 칼슘 인산 염 transfection 작품 최고의 하루에서 생체 외에서 (DIV) 2-4. 태그 Synaptophysin, SV 막 횡단 단백질 transfected 신경 연 접 맨끝을 식별 하기 위한 표식으로 사용 합니다. SV2, Synapsin, 뱀파이어/Synaptobrevin 등 다른 SV 단백질 또는 바 순, RIM, Munc13-1, 그리고 캐스트와 같은 활성 영역 분자의 태그 버전도 사용할 수 있습니다.
MCherry와 mOrange 둘 다 빨간 형광 방출. MCherry는 mOrange 보다 밝게, 더 큰 방출 mOrange 보다 긴 파장에 있다. 따라서, 트리플 형광 이미징 GFP, 붉은 염료, 그리고 700 nm 범위에서 방출 하는 염료, mOrange mCherry 보다 더 나은 옵션입니다. 그것이 이기 때문에 밝은 염료 GFP와 붉은 염료 형광 두에 대 한 mCherry는 유리한 수 있습니다. 스파스 transfection를 하려면 transfection 믹스 해야 하지 알을 품을 60 분 이상. 그것은 또한 외피 depolarizing 버퍼에 모든 소포 exocytosis 되도록 시간의 오른쪽 길이. 그러나, depolarizing 버퍼에 확장된 노출은 피해 야 한다. 이미지 수집, 동안 또한 동일한 노출 시간 및 정량 비교 실험의 다른 세트를 위해 가벼운 강렬을 적용할 필수적 이다.
마지막으로, 이미지 분석, 중 우리의 프로토콜 몇 가지 고려 사항이 포함 되어 있습니다. 재조합 Synaptophysin puncta를 보여주는 관심의 한 영역에 대 한 낮은-강도 임계값 확산 형광 제외 되도록 설정 됩니다. 다음,이 임계값은 다른 지역과 coverslips punctate 신호에의 유사한 포함 및 제외 확산 형광의 관찰 하에 테스트 됩니다. 적절 한 임계값을 확인 한 재조합 Synaptophysin (mCherry 또는 mOrange 태그로) 채널에 관심 (ROIs) punctate 영역을 생산 하는 모든 이미지에 적용 됩니다. 마지막으로, Syt1 강도 ROIs9에 대 한 결정 됩니다.
우리의 접근은 스파스 transfection에 최적화 되어 있습니다. 우리는 복잡 한 설정에 연 접 기능 분석 SV untransfected 신경에 의해 둘러싸인 transfected 뉴런의 축 삭에 재활용입니다. 이 설정에서 더블 transfection 신경 기능을 조작 하 여 transfected 신경의 연 접 맨끝을 찾을 수 있습니다. Transfected 연 접 신경 postsynaptic 신경 untransfected 문의 SV 재활용에 대 한 연 접 신경의 효과 평가에 중요 한 요소 이다. 설정은 postsynaptic 조작 하면 연 접 변경 여부 테스트를 쉽게 적응 수 있습니다 또한. 이 경우에, 신경 postsynaptic 사이트를 대상으로 하는 단백질의 스파스 transfection transfected 뉴런의 postsynaptic 사이트 지역화 됩니다 그리고 Syt1 통풍 관 untransfected 신경의 시 냅 스 boutons에서 확인할 수 있습니다.
스파스 transfection 필요 하지 않을 경우, 다른 transfection 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 예를 들어 DIV 7-8 결과 높은 transfection 요금, 하지만 그것에 Lipofectamine와 transfection에 각 transfected 세포9에 강한 식 임무 인. 또한, 바이러스 성 변환 교양된 뉴런14,,2324의 거의 100%에 식에서 발생할 수 있습니다. SV 재활용을 모니터링 하기 위한 실험, transfection 단일 단백질에 대 한 수행 하거나 완전히 탈락 될 수 있습니다. 예를 들어 때 전반적으로 시 냅 스 재활용 wildtype에서 뉴런 사이 비교 유전자 변형 생쥐, transfection에 의해 개별 뉴런 라벨 필요 하지 않습니다. 또한, 내 생 단백질의 immunolabeling 수 있습니다. Transfection는 실패 하면, 그것은 유효한 플라스 미드와 transfection 버퍼를 테스트 하거나 다른 ph 버퍼를 사용 하는 것이 중요 ( transfection 버퍼의 준비참조). 내 무료 DNA 준비를 사용 하 여 또한 중요 한 것 같다. Immunostaining 모두 PFA 고정 및 메탄올 고정 샘플에서 Syt1 항 체 작품을 내 면. 그것은 GFP와 RFP autofluorescence 메탄올 고정 후 손실 됩니다 주목 해야한다. GFP 또는 RFP 메탄올 고정 셀에 지역화 될 필요가,이 단백질 immunolabeled 이어야 합니다. Syt1 이해 못하면 도발은 시간과 도발은 버퍼에 K+ 농도 변경 해야 그에 따라. 45 m m, 50mm, 70mm, 및 110 m m6,25,26 K+ 농도 도발은 60 분12, 90 s25 까지 시간 함께 많은 프로토콜 변형 출판 되었습니다. ,27. 재발 활동은 방지 되어야 한다, 도발은 동안 또한 글루타민 산 염 수용 체 차단제를 추가 수 있습니다. 마지막으로, 동안 높은 K+ 도발은 강한 자극 생각, 활동 전위는 SV 재활용 더 많은 생리 적 자극22,28을 통해 유도할 수 있다. 쥐와 쥐 문화에서 Syt1 항 체 이해 효능에 차이가 발생할 수 있습니다. 우리의 방법에 단일 클로 널 마우스 안티 Syt1 클론 604.2 (RRID:AB_993036) 생산 polyclonal 토끼 안티 Syt1 항 체 (RRID:AB_11042457) 생산 마우스 문화에 더 강한 얼룩 하는 동안 마우스 문화에 보다 쥐 문화에 강한 얼룩 하지만 주의의 몇 가지 메모 아래 설명 되어 있습니다.
SVs로 통풍 관에 대 한 안티-Synaptotagmin 항 체의 사용에 관한 몇 가지 주의 사항은 고려해 야 합니다. 첫째, 아스파라긴 24 Syt1의의 N glycosylation 단백질29,30endocytotic 이해를 촉진합니다. 아스파라긴 24 Syt1 luminal 도메인의 일부입니다. 우리가 사용 하는 마우스와 토끼 항 체 아미노산 1-12, 1-8, Syt1의 각각에 대 한 이동 합니다. 그들의 epitopes N glycosylation 사이트와 중복 되지 않습니다, 하는 동안 입체 방해 또는, 반대로, 항 체 바인딩에 의해 통풍 관의 유도 제외할 수 없습니다. Syt1에 N glycosylation 사이트의 돌연변이 endocytosis의 활동 및 Syt1 SVs 대상으로 변경 되지 않습니다. 그것은 증가 endocytosis 약한 자극에 의해 유발 됩니다 때 외부 원형질 막 표면에 남아 있는 Syt1의 분수. 높은 K+ 도발은 등 강한 자극, 적용 될 때30Syt1 통풍 관에 있는 감소는 관찰 됩니다. 전반적으로, 항 체는 어떤 식으로든에서 N glycosylation 사이트와 방해 하는 경우 그들은 SV endocytosis 항 체 없는 조건에 비해 변경 될 수 있습니다 하지만이 변경 (우리의 케이스에서 GFP Rogdi의 overexpression) 실험을 위해 유사 해야 하 고 (우리의 케이스에서 GFP의 표현) 컨트롤입니다. 또한, polyclonal 항 체 항 체의 큰 복사본 수는 epitope에 바인딩하므로 입체 문제 및 단일 클론 항 체, 보다 가교를 유도 하 더 가능성이 있을 수 있습니다. 우리는 서로;와 함께 사용할 수 있는 항 체를 비교 하는 체계적인 학문의 인식 그러나, 일부 연구는 특정 항 체의 유효성을 해결 하 고 있다. 예를 들어 SV 재활용 활동 직접 비교의 단일 클로 널 마우스 안티 Syt1 항 체 클론 604.2 및 Synaptophluorin 형광 변화를 사용 하 여 조사 했다 때 비슷한 결과 얻은 했다,이 항 체28를 사용 하 여 유효성 검사. Polyclonal 토끼 Syt1 항 체와 SVs를 로드 및 electrophysiologically 시 냅 스 전송 녹음 로드 시 냅 스에 손실의 기능 돌연변이의 연상 Syt1 시 냅 스 전송 감소 했다 밝혔다. 따라서, 이러한 polyclonal 항 체는 시 냅 스 전송 영향 을지 않습니다. 실제 통풍 관 모두 자연과 갖는 재활용, polyclonal 항 체는 SV 재활용의 한 라운드를 모니터링 하는 데 적합 하지만 이러한 항 체31의 후 결과 해석할 때 주의 취해야 한다 밝혔다.
3 분석 SV 재활용 공부 하는 일상적으로 사용, 막 styryl와 라벨을 포함 하는 염료, Phluorins의 overexpression 그리고 Syt1 항 체 이해 여기 수행 모든 3 개의 분석 실험 SV 재활용의 endocytotic 및 exocytotic 다리를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 모든 3 개의 분석 실험 강력한 혜택을가지고, 또한 마다 원칙 주의 해야. FM 염료 전체 세포 표면에 레이블을 하 고는 모든 재활용 멤브레인과 셀으로 채택. Phluorins는 overexpression에 의해 도입 해야 합니다. Syt1 항 체 라벨 생 단백질, 하지만 일부 항 체 특정 조건 하에서 그것의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 각 경고, 수 있다 적절 하 게 제시 된21.
전반적으로, Syt1 항 체 이해 분석 결과 다양 한 목적을 역임 했다. 첫째, 자발적 또는 갖는 재활용, 각각28,31,,3233겪고 SVs를 선택적으로 사용 되었다. 둘째, SV 재활용;의 범위에는 약물 또는 단백질의 효과 결정 하는 데 사용 했다 예를 들어, BDNF 자연과 갖는 SV6재활용 향상을 보여. 셋째, SVs 형태학 상으로 정의 된 시 냅 스34,35의 총 수의 재활용과 시 냅 스의 수를 결정 하기 위해 사용 되었다. 이 계시는 SVs25 재활용과 시 냅 스의 비율 증가 postsynaptic 세포 접착 분자 Neuroligin-1 overexpressing와 그의 비율을 감소 감소 AMPA 형 글루타민 산 염 수용 체의 표현 SVs, presynaptically 침묵 시 냅 스36의 비율이 증가 재활용과 시 냅 스. 또한, 분석 결과 이라는 SVs27 의 이동성을 분석 하 고 Syt1 nanoscopy13,22,33를 사용 하 여 지역화를 결정 하기 위해 사용 되었다. 마지막으로,이 메서드는 특정 단백질 기능 시 냅 스9지역화 여부 테스트를 여전히 사용 됩니다. Syt1 항 체도 사용할 수 있습니다 장기 연구에 대 한 항 체는 신경에 다음과 같은 글귀37일 동안 남아. 이 별도로 분류 Syt1 항 체 또는 항 체의 다른 SV 단백질 luminal 도메인에 대 한 지시를 사용 하 여 통풍 관의 2 차 결합 될 수 있다. SVs 처음 재활용 하 고 있는 실험의 끝에 의해 재활용의 테스트 수 있습니다. 그것은이 분석 결과 급성 조각 organotypic 조각 문화 등 더 많은 그대로 모델 시스템에 맞게 재미 있을 것. 원칙적으로, 통풍 관 분석 결과 조직 wildtype에서의 비교를 허용 한다 유전자 동물 수정 및 바이러스 배달 또는 biolistics, 즉결합 될 수 있습니다., "유전자 총"이 모델 시스템에서 단백질 식이 조작 하. 이러한 시스템에서 연 접 기계, 통풍 관 분석 결과, 및 네트워크 역동성에 의해 감시에 특정 물결의 영향을 동시에 공부 수 있습니다.

연 접 속성 변경, 시 냅 스가 소성 또는 시 냅 스 기능의 섭 동에 대응에서 하는 방법 시 냅 스 소포 재활용 공부 하는 것은 결정에 중요 하다. Synaptotagmin-1 (Syt1) 공부 항 체 이해는 SV 재활용의 양을 측정 한 방법을 제공 합니다. Syt1 Ca2 + 센서 역할을 신경 전달 물질1,2의 exocytotic 출시에 필요한 SV 관련 된 단백질 이다. 그것은 SV 외부 단자 세포질 도메인와 SV3내부 N 맨끝 luminal 도메인 막 횡단 단백질. Exocytosis, 동안 Syt1 luminal 도메인 외부 매체에 노출 된다. 이 외부 매체에 우리 endocytosis 동안 내 면 된다 세포질 도메인에 대하여 지시 하는 항 체를 추가 합니다. 이러한 항 체 중 미리 fluorophores 또는 이차 항 체4,,56,7immunostained와 함께 활용 될 수 있습니다. 결과 immunosignal의 형광 강도 SV 재활용의 양에 비례 합니다. 이 방법은6,8재활용 제정 및 도발은 유도 SV를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
접시에 거의 모든 세포에 바이러스 중재 하는 유전자 이동 또는 세포의 작은 숫자의 스파스 transfection Syt1 이해 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 우리의 방법은 칼슘 인산 염9를 사용 하 여 기본 hippocampal 신경의 스파스 더블 transfection 분석 결과 결합 합니다. 재조합 마커 단백질 presynapses에서 축적 하는 것으로 알려져 붙일 태그 Synaptophysin, 연 접 맨끝을 찾아서 우리의 단백질, Rogdi의 overexpress를 사용 합니다. 수 있습니다 테스트 여부 Rogdi 기능 synapses 대상과 SV 재활용에 영향을 줍니다. Rogdi 인코딩 유전자 초파리 돌연변이 장애인된 메모리10특징에 대 한 화면에서 원래 확인 되었다. 인간에서는, Rogdi 유전자에 있는 돌연변이 Kohlschütter Tönz 증후군 이라는 희귀 하 고 치명적인 질병을 일으킬. 치과 나 멜 기형, pharmacoresistant 간 질 및 정신 운동 지연;에서 고통 받는 환자 그러나, 유전자 제품의 subcellular 지 방화 하기 어려운11남아 있었다. 따라서, Syt1 이해 분석 결과 제공 기능 시 냅 스9에서 GFP 태그 Rogdi의 지역화에 대 한 주요 증거.
이 통풍 관 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, SV 재활용 관찰할 수 있습니다 모두 실시간으로 라이브 이미징7,12, 수행 하 여 및 고정6,9 후 Syt1 형광 라벨의 형광 강도 측정 하 여. 또한, 여러 Syt1 항 체 변종 개발 되었습니다. 다음 표준 immunostaining 프로토콜, 고정 후 2 차 항 체로 표시 될 수 있습니다 태그 변종 그리고 이미 연결 된 형광 라벨와 사전 활용된 이체 있다. 마지막으로, 형광 항 체 기반으로 사용할 수 있는 상용 보조 또는 활용 된 염료의 큰 선택 때문에 유리 하다.
때 고정 하 고 immunostaining 신경, 그것은 또한 추가적인 단백질을 위한 얼룩 colocalization 분석을 수행 하. 이 그들이 있는 재활용 SVs에 관하여 결정을 도울 수 있다. 형광 라벨의 강도 SV 재활용의 양 직접 측정. 또한, 항 체는 선택적으로 포함 하는 Syt1 구조, 높은 특이성 및 작은 배경 형광4결과로 라벨. 다른 자극 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다, 같은 도발은 버퍼 또는 전기 자극 프로토콜9,12,,1314. 그러나, 기초 SV 재활용 신경 문화15자극 없이 측정할 수 있습니다.
우리의 방법은 구체적으로 고정 후 이차 항 체 immunolabeling와 더블 페 뉴런에서 Syt1 항 체 이해를 해결합니다. 그러나, 우리는 시청자에 게 프로토콜 특정 요구에 적응 하는 기회를 우리의 논의에 분석 결과의 모든 일상적으로 사용 된 이체를 참조 하십시오.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>donkey anti mouse Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>antibody</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>tube (50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>1,083,421,000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td><td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application</td><td>Free software, see comments</td><td></td><td>written by Noam E. Ziv, Technion &amp;ndash; Israel Institute of Technology, Haifa, Israel</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>safety hood</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Serial No. 40649111</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311</td><td>mouse monoclonal; clone 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&amp;nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an optical assay for synaptic vesicle recycling in cultured neurons overexpressing presynaptic proteins

활성 연 접 신경 맨끝에서 시 냅 스 소포 주기를 및 endocytosis를 받 다. 재활용, 하는 동안 SV 막 횡단 단백질의 luminal 도메인 세포 표면에 노출 된다. 이러한 단백질 중 Synaptotagmin-1 (Syt1) 이다. 항 체를 한 번 문화 매체에 추가 하는 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 엑 소 endocytotic 주기 동안 가져온 것입니다. 이 글귀 SV 재활용의 금액에 비례 하 고 면역 형광을 통해 정해질 수 있다. 여기, 우리가 교양된 hippocampal 신경의 이중 transfection Syt1 항 체 통풍 관 결합. (1) 연 접 사이트 재조합 연 접 마커 Synaptophysin의 식에 따라 지역화, (2) 결정 Syt1 통풍 관을 사용 하 여 그들의 기능 및 (3) 특성화 고 대상으로 우리와 관심, GFP Rogdi 단백질의 효과 수 있습니다.

이 접근의 예상된 결과 잘 당 50000 뉴런의 밀도에 coverslip 당 약 50 더블 페 뉴런 찾는 것입니다. 각 신경의 축 삭 붙일 태그 Synaptophysin 축적, 나타내는 클러스터 ofSVs의 여러 핫스팟 표시 예정 이다. 기능적 연 접 사이트에서 재조합 Synaptophysin 신호 punctate Syt1 형광으로 colocalizes. 더블 transfection를 사용 하 여, 관심 (그림 1)의 단백질으로 GFP-Rogdi 또는 mGFP 제어 재조합 Synaptophysin와 공동 표현 이다.
이 실험에서 우리는 SV GFP-Rogdi 또는 mGFP을 표현 하는 신경 세포 연 접 사이트에서 재활용 분석. 경우 컨트롤 단백질, mGFP, 균질 전체 셀에 걸쳐 배포 됩니다 하지만 시 냅 스 사이트에서 영향력 여전히 공부 될 공동 transfect 농축 presynaptically 두 번째 단백질 필요 하다, 붙일 태그 Synaptophysin입니다.
앞서 설명한 대로 셀 도발은 유도 송신기 릴리스를 받 다. 그 결과, 기능 시 냅 스 Syt1 항 체는 매체에 추가 차지 합니다. Immunolabeling는 Syt1 붙일 레이블된 이차 항 체와 항 체, 후 Syt1 통풍 관의 범위는 immunosignal (그림 2)를 사용 하 여 측정할 마침내는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58043/58043fig1.jpg"> 그림 1입니다. 더블 페 셀. 보기의 필드 GFP-Rogdi (A)와 Synaptophysin-mCherry (B) 더블 페 셀을 보여 줍니다. Synaptophysin는 풍부한 시 냅 스 소포 단백질 이다. 그것의 재조합 변형 시 냅 스 boutons를 라벨에 대 한 사용할 수 있습니다. GFP-Rogdi의 지역화 패턴 Synaptophysin-mCherry (C)의 유사합니다. 스케일 바 = 10 μ m. 상자 2.5 배 확대를 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58043/58043fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58043/58043fig2.jpg"> 그림 2입니다. 기능 시 냅 스에서 GFP-Rogdi. 라이브 Syt1 통풍 관 더블 페 셀 (녹색) mGFP와 Synaptophysin-mOrange (빨강;에서 수행 되었다 A-D) 또는 GFP-Rogdi (녹색)와 Synaptophysin-mOrange (빨강; E-H). Syt1 항 체 이해 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 마우스 단일 클론 항 체를 사용 하 여 수행 되었다. PFA 고정 후 셀 토끼 안티-GFP 항 체와 얼룩이 있었다. 2 차 항 체 (항 토끼 알 렉 사 488와 안티 마우스 알 렉 사 647) 감지 GFP 또는 GFP Rogdi Syt1, 각각에 추가 되었습니다. Autofluorescence Synaptophysin-mOrange의 연 접 단자 (B와 F)을 감지 하 사용 되었다. 면역 형광 Syt1 punctate 나타냅니다 소포 (블루; 재활용의 사이트 C와 G)입니다. Note 대부분 Syt1 표시 된 시 냅 스의 페 비 신경에 지역화 됩니다. GFP Rogdi 활성 시 냅 스를 대상 고 시 냅 스 소포 (I)을 재활용 하는 것은 변화 하지 않았다. 3 독립적인 문화 실험 수행 되었습니다 (N = 3). 각 문화 (10 총)에서 적어도 3 coverslips 분석을 위해 사용 되었다. 마지막으로, 3 지역 coverslip 당 분석 되었다 (n = 30). Student´s t-검정 큰 차이 보였다. 스케일 바 = 10 μ m. 오차 막대 (S.E.M.) 의미의 표준 오류를 나타냅니다. "N.s." 아무 의미를 나타냅니다. 이 그림에서 리만 외 수정 되었습니다. 9 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58043/58043fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K 조회수.  University Medical Centre Göttingen. 우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

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Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become imperative to develop objective approaches to quantify changes in synaptic connectivity. Starting from sample fixation, this protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers. The number of these colocalizations is quantified using a plug in Puncta Analyzer (written by Bary Wark, available upon request, c.eroglu@cellbio.duke.edu) under the ImageJ analysis software platform. The synapse assay described in this protocol can be applied to any neural tissue or culture preparation for which you have selective pre- and postsynaptic markers. This synapse assay is a valuable tool that can be widely utilized in the study of synaptic development.

This protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

연구

신경과학

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in appropriate order by transport from cell bodies and/or local translation in immature synapses. However, it is not fully understood how synaptic proteins accumulate in synapses in proper order. Here, we present a novel method to analyze presynaptic formation by using the combination of neuron ball culture with beads to induce presynapse formation. Neuron balls that is neuronal cell aggregates provide axonal sheets far from cell bodies and dendrites, so that weak fluorescent signals of presynapses can be detected by avoiding overwhelming signals of cell bodies. As beads to trigger presynapse formation, we use beads conjugated with leucine-rich repeat transmembrane neuronal 2 (LRRTM2), an excitatory presynaptic organizer. Using this method, we demonstrated that vesicular glutamate transporter 1 (vGlut1), a synaptic vesicle protein, accumulated in presynapses faster than Munc18-1, an active zone protein. Munc18-1 accumulated translation-dependently in presynapse even after removing cell bodies. This finding indicates the Munc18-1 accumulation by local translation in axons, not transport from cell bodies. In conclusion, this method is suitable to analyze accumulation of synaptic proteins in presynapses and source of synaptic proteins. As neuron ball culture is simple and it is not necessary to use special apparatus, this method could be applicable to other experimental platforms.

Presynapse formation is a dynamic process including accumulation of synaptic proteins in proper order. In this method, presynapse formation is triggered by beads conjugated with a presynapse organizer protein on axonal sheets of &#8220;neuron ball&#8221; culture, so that accumulation of synaptic proteins is easy to be analyzed during presynapse formation.

Presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 "뉴런 공" 문화를 사용 하 여

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...