이 프로토콜은 전신 단백질이 어디에서 유래하는지 조사하기에 적합합니다: 세포 체 또는 축축. 그리고 시냅스 형성 중에 사전 시냅스 형태로 사전 합성 단백질이 축적되는 방법. 이 기술은 동시에 수천 개의 presynapses를 유도할 수 있으며, 축산기내의 많은 프리시냅스의 형성을 효율적으로 분석할 수 있도록 배양에서 축축을 유지하기 위해 특별한 장치를 사용하지 않는다.
대학원생호나미와 함께 이 과정을 시연하는 것은 내 실험실에서 학부생인 리 이시이(Rie Ishii)가 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 안락사로 이 절차를 시작합니다. 복부를 해부하여 E16 배아를 얻습니다.
미세 한 양포의 도움으로 배아에서 뇌를 조심스럽게 제거하고 HEPES 완충 염 용액 또는 HBSS의 4 밀리리터를 포함하는 60 mm 세포 배양 요리로 옮기. 수막을 제거하고 후각 전구를 잘라. 스테레오 현미경의 밑에 집게의 미세한 끝을 사용하여 각 대뇌 반구에서 각 코르티스를 분리하고 신선한 HBSS를 포함하는 또 다른 60 밀리미터 접시로 전송합니다.
각 별도의 뉴런 볼 배양에 대해 적어도 3~5개의 배아를 사용하십시오. 라미나르 플로우 세포 배양 후드에 미세 한 초세 스프링 가위를 가진 작은 조각으로 코르티코를 잘라. 이제 다진 코르티체를 15밀리리터 튜브로 옮기게 합니다.
섭씨 37도의 수조에서 4.5분 동안 HBSS에서 0.125%의 트립신4밀리리터로 다진 코르티스를 트립시비티. 멸균 전달 파이펫에 의해 HBSS의 10 밀리리터를 포함하는 새로운 15 밀리리터 튜브로 세포 응집체를 전송합니다. 이 단계를 한 번 더 반복하기 전에 섭씨 37도에서 5분간 배양하십시오.
그런 다음 NGB 배지 2밀리리터, 0.01%DNase I 및 10%의 말 혈청을 포함하는 새로운 15밀리리터 튜브로 셀 응집체를 전송합니다. 시험화 된 코르티체를 반복적으로 피펫으로 세팅하여 불을 닦은 미세 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 3 ~ 5 번 피펫을 피우십시오. 뉴런 볼을 준비하기 위해, NGB 배지를 사용하여 밀리리터 당 백만 세포로 세포 현탁액의 세포 밀도를 조정합니다.
문화 요리의 하단 부분에 PBS의 일곱 밀리리터를 추가합니다. 10센티미터 배양 접시의 상부 뚜껑 안쪽에 10, 000 세포를 포함하는 10 마이크로리터 매달려 방울로 피질 뉴런을 배양합니다. 뉴런 볼 형성을 허용하기 위해 가습 된 조건에서 5 %의 CO2와 3 7섭씨 37도에서 3 일 동안 인큐베이터에 요리를 보관하십시오.
폴리-L-리신 또는 PLL을 파라핀 구슬 유리 커버에 60mm 접시에 코팅하여 산염 버퍼에서 밀리리터 PLL 용액당 15마이크로그램을 사용합니다. 섭씨 37도에서 CO2 인큐베이터에서 최소 한 시간 동안 보관하십시오. PBS로 4회 세척한 후, PLL 코팅 커버 슬립을 NGB 배지 350마이크로리터가 들어 있는 4웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 3개의 마이크로몰러 AraC를 장착합니다.
아라C는 분할 세포를 죽일 미디어에 추가됩니다. CO2 인큐베이터에서 PLL 코팅 커버 슬립을 포함하는 4웰 플레이트를 적어도 20분 동안 배양하여 중간 크기의 온도가 섭씨 37도에 도달하도록 한 후 뉴런 볼을 이송합니다. DIV 3에서는 뉴런 볼이 잘 형성되면 PLL 코팅 커버 슬립으로 옮긴다.
4웰 플레이트 안에는 웰당 5개의 뉴런 볼을 추가합니다. DIV 11에서 20 마이크로리터를 스트렙타비딘 코팅 자기 입자의 현탁액에서 마이크로센트심리후지 튜브로 이송한다. 비드를 네오디뮴 영구 자석으로 부착한 수제 장치에 고정하고 1.5밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브에 PBS-MCBC 100마이크로리터로 세 번 세척한다.
구슬에서 PBS-MCBC를 완전히 제거한 후, 세척된 구슬에 미리 정해진 볼륨의 LRRTM2 스톡을 추가합니다. 1 ~2 시간 동안 섭씨 4도에서 회전기를 사용하여 혼합물을 배양합니다. 인큐베이션에 이어 PBS-MCBC의 100마이크로리터로 구슬을 두 번 씻으실 수 있습니다.
그런 다음, NGB 배지의 100 마이크로 리터로 구슬을 세척합니다. 뉴런 볼 배양에 적용하기 위해 NGB 배지 50마이크로리터로 LRRTM2 구슬을 재중단한다. 이제 스테레오 현미경 아래 면도날로 노란색 팁의 끝을 45도 각도로 잘라냅니다.
뉴런 볼의 세포 체부위에 노란 팁 끝을 넣고 흡입에 의해 세포 체를 제거한다. LRRTM2를 적용하고 뉴런 볼 배양에 구슬을 제어합니다. 그런 다음 페릿 자석을 사용하여 1 분 동안 뉴런 볼 배양의 플레이트의 바닥에 구슬을 잠급하여 시냅스 형성을 시작합니다.
이 절차를 통해 모든 구슬을 동시에 터치 다운할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 구슬을 가진 사전 시냅스 형성 후 뉴런 볼 배양에서 뉴런을 수정하고 얼룩지게 한다. 60X 오일 침지 렌즈를 사용하여 냉각된 CCD 카메라로 반전된 형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트 및 면역 형광 이미지를 캡처합니다.
축사내의 시냅스에서 면역형광 강도를 측정합니다. 구슬에 관심 영역의 면역 형광 강도를 사용합니다. 비드에서 20 미크론을 따라 축축 강도로 나누어 오프 구슬 영역 강도를 빼는.
배경 강도를 뺀 값입니다. 이 비율 강도는 단백질 축적 지수를 제공합니다. LRRTM2 구슬로 유도된 프리시냅스에서 특정 단백질의 축적 수준을 정량화하려면, 항상 세포 체체와 는 별개로 두 가지 시야 이상의 영역을 선택한다.
정확한 측정을 위해 커버슬립당 5개의 다른 축축필드를 선택하십시오. 여기에 비프 11뉴런 볼 배양에 LRRTM2 구슬의 적용이 뉴런 볼의 축록스의 사전 시냅스에서 문크18-1의 유도 축적이다. 뉴런 볼의 축하에 구슬은 위상 현미경 이미지에서 볼 수 있습니다.
그리고 전시냅스 단백질의 축적은 면역 형광 심상에 의해 관찰된다. 세포체를 제거한 축산에서도, 문크18-1의 축적은 구슬 아래에서 관찰되었으며, 이는 세포체를 가진 뉴런 볼의 축축과 유사하게. 축산 시트의 주변 영역이 높은 배율 목표 렌즈에 의해 분석되었을 때, vGlut1 및 Munc18-1은 세포 체의 유무에 관계없이 축축의 프리시냅스에서 명확하게 축적되었다.
시간 과정 실험은 프리시냅스에서 vGlut1의 축적이 30분에서 크게 증가했다는 것을 보여주었습니다. 한편, 문크18-1 누적은 2시간 만에 크게 증가하기 시작했고 4시간 만에 고원에 도달했다. 이러한 데이터는 시냅스 소포 단백질 vGlut1이 활성 영역 단백질 Munc18-1보다 일찍 프리시냅스에서 축적되었음을 나타낸다.
Fmr1-KO 뉴런의 사전 시냅스에서 문크18-1 축적은 야생 형보다 1.5 배 증가하여 문크18-1 축적에서 FMRP의 참여를 나타냅니다. 단백질 합성 억제제, 애니소마이신은 세포 체의 유방부에서 문크18-1 축적을 현저히 억제하였다. 이것은 축적이 단백질 합성에 의존한다는 것을 나타냅니다.
불을 연마한 미세 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 트립시화 된 코르티체를 피펫팅하는 것은 중요한 단계입니다. 실험자는 2~3개의 서로 다른 직경으로 불을 닦은 파이펫을 준비하고 적절한 직경의 파이펫을 선택했습니다. 이 절차를 사용하여 LRRTM2 구슬에 의해 유도된 프리시냅스에서 시냅스 방출을 라이브 이미징으로 측정합니다.
이 추가 방법은 축산기에서 단백질 합성시 냅 스 방출의 규칙에 관련 된 여부에 대답 할 것 이다. 이 방법을 사용하여, 연구원은 사전 시냅스 단백질이 조직된 방식으로 presynapses에서 어떻게 축적되는지, 뿐만 아니라 사전 시냅스 단백질의 근원의 위치를 검사합니다.
