이 방법은 HPV DNA 통합에 영향을 미치는 세포 또는 바이러스성 요인을 찾는 것과 같은 B형 간염 바이러스학의 주요 질문에 대답하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 기술에는 여러 가지 장점이 있습니다. 비교적 저렴하고 수행하기 쉽고 결과 분석은 간단하며 단일 복사본까지 매우 민감합니다.
이 방법은 HBV 통합에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수 있지만, HIV, HTLV-1 또는 HPV와 같은 숙주 세포 게놈에 통합되는 다른 바이러스에도 사용될 수 있습니다. 세포를 감염시키기 위하여는, D-mem의 1 밀리리터와 더불어 12 개의 우물 접시에 있는 밀리리터 당 200, 000 세포를 종자. 다음 날, HEP-AD 38으로부터 헤파린 컬럼을 세포당 1, 000 VGE에서 감염시키기 위해 접종한 것으로, 배양 배지의 500 마이크로리터를 사용한다.
그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 그런 다음, 다음 날에, 멸균 1 회 PBS의 1 밀리리터로 세포를 두 번 씻는다. 그런 다음, 수확 될 때까지, 매 2 일마다 배양 매체를 교체합니다.
3일째 감염 후, 5 마이크로몰라 테노포비르 디소프록실과 10 마이크로몰러 라미부딘으로 세포를 치료하여 역PCR에 의해 증폭되는 HBV 복제 중급제의 생산을 제한한다. 5일째, 감염 후, 트립신 EDTA의 200 마이크로리터로 일부 세포를 트립시화하고 5 마이크로몰라 테노포비르 디소프록실과 10 마이크로몰러 라미부딘을 포함하는 D-mem의 2 밀리리터에서 다시 중단합니다. 이어서, 세포 현탁액을 6개의 웰 플레이트로 이송하여 1라운드의 미토시스를 유도한다.
7일째 감염 후, 트립신 EDTA의 400 마이크로리터에서 확장된 세포를 시험하고 D-mem의 1밀리터에서 혼합물을 중단한다. 이어서, 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 이송한다. 5 분 동안 500 회 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
그리고 포부로 수당 나딘을 제거하십시오. 제조업체의 지시에 따라 DNA 추출 키트를 사용하여 세포 펠릿에서 DNA를 추출합니다. DNA 반전의 경우 총 DNA 추출물의 1.5~2.5마이크로그램을 200 마이크로리터 PCR 튜브에 할당합니다.
다음으로, 적절한 양의 제한 효소 마스터 믹스를 추가하여 40 마이크로리터의 반응 부피를 초래하고, 1회 소화 반응 버퍼및 10단위 NCO-1HF를 함유한다. 최적의 소화 효율을 위해 PCR 기계에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 제한 효소 반응을 배양합니다. 그런 다음, 20 분 동안 섭씨 80도를 배양하여 제한 효소를 비활성화합니다.
전체 제한 효소 반응을 1.5 밀리리터 튜브로 전달합니다. 이어서, T4 DNA 리개세 완충제 의 1회 T4 DNA 리구아제 완충제의 400 마이크로리터와 500단위의 T4 DNA 리개세를 추가하고 철저히 섞는다. 대반응량은 소화된 DNA 단편의 분자 내 결찰을 장려합니다.
완전한 결찰을 보장하기 위해 실온에서 2시간 동안 결찰 반응을 배양합니다. 2 시간 후, 20 분 동안 섭씨 70도에서 T4 DNA 리그아제 비활성화. 그런 다음, T4 리구가스의 완전한 비활성화를 보장하기 위해 10 나트륨 도데딜 황산염의 10 마이크로 리터를 추가합니다.
염화나트륨을 100 밀리몰러의 최종 농도에 추가하고, Dextran은 밀리리터당 90 마이크로그램의 최종 농도를 유지합니다. 펄스 소용돌이에 의해 혼합하고 반응 믹스를 잠시 회전시합니다. 다음으로, 100 에탄올의 900 마이크로 리터를 추가하고 반전으로 섞습니다.
하룻밤 사이에 마이너스 섭씨 20도에서 DNA를 침전시합니다. 그리고 15 분 동안 14000 배 G에서 원심 분리에 의해 침전 된 DNA를 펠릿. 그 후, 포부로 수-당 나-식사를 제거합니다.
70 에탄올의 500 마이크로 리터로 펠릿을 씻으십시오. 그리고 15 분 동안 14000 배 G에서 원심 분리. 그런 다음, 에탄올을 흡인으로 제거하고 실온에서 DNA 펠릿을 20분 동안 공기 건조시한다.
20 마이크로리터의 물에 펠릿을 녹이고 효소 마스터 믹스 20마이크로리터를 추가하여 40마이크로리터 반응 부피, 1회 소화 반응 버퍼, 5단위 BSIHK-1, SPH-1HF 5대를 함유하고 있다. 둥지는, 1 시간 동안 섭씨 37도에서 열 블록에서 제한 효소 반응을 배양한다. 반응 혼합물을 잠시 스핀 다운하고, 1 시간 동안 65섭씨에서 열 블록에서 제한 효소 반응을 배양합니다.
이 절차에서는 DNA 분해 용액을 사용하여 재사용 가능한 실리콘 매트 씰에서 잠재적 인 앰플리턴을 제거하십시오. DNA가 없는 물로 매트를 철저히 헹구고 실온에서 공기를 건조시다. 다음으로, 0.5 마이크로몰러의 농도로 외부 전방 및 역 프라이머를 포함하는 1회 PCR 믹스의 1밀리터를 준비한다.
1회 PCR이 A-1과 E-1에 혼합되면 96개의 잘 PCR 플레이트에 170마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 1회 PCR 믹스의 120마이크로리터를 우물 B-1 및 H-1에 추가합니다. 그 후, A-1과 E-1을 우물에 반전된 DNA의 10 마이크로리터를 추가합니다.
100 마이크로리터로 설정된 P-1000을 사용하여 각각 약 10회 부드럽게 파이펫팅하여 각 우물에서 반응을 혼합합니다. 각 단계에서 60 마이크로리터를 전송하여 1:3의 비율로 우물 A-1에서 D-1로 샘플을 연속적으로 희석시. 100 마이크로리터로 설정된 P-1000을 사용하여 약 10회 부드럽게 파이프를 사용하여 각 단계에서 우물을 섞습니다.
거품을 형성하지 마십시오, 잘 E-1에 대한 절차를 반복, 잘 H-1로 희석. 그 후, 반응 혼합물의 10 마이크로리터를 웰스 A-1, H-1, 우물 A-2, H2, A-3, H-3 및 So-on에 사용하여 96 웰 플레이트의 우물 A-12, H-12에 도달할 때까지 반응 혼합물의 10 마이크로리터를 할당한다. PCR 플레이트를 마른 실리콘 매트로 덮고 단단히 누릅니다.
그런 다음 플레이트를 PCR 기계에 넣고 플레이트를 실온으로 옮기기 전에 표시된 프로그램을 실행합니다. 그 후, 96 핀 복제기의 핀을 분젠 버너로 적색 으로 가열한 다음 실온에서 최소 5분 동안 식힙니다. 두 번째 PCR 플레이트의 웰을 10 마이크로리터의 10 마이크로리터PCR 믹스로 채우고 젤 로드 준비 버퍼를 포함하고, 내부 전방 및 0.5 마이크로몰러로 역전한다.
1라운드 PCR에서 96웰 플레이트의 PCR 플레이트에서 실리콘 매트를 조심스럽게 제거하고 우물 간 교차 오염을 피하십시오. 냉각 된 복제기를 사용하여 1 라운드 PCR에서 새로 할당 된 96 웰 플레이트로 96 웰 플레이트의 PCR 제품을 전송하십시오. 표시된 대로 조건을 사용하여 중첩된 PCR을 수행합니다.
PCR 제품을 분리하려면 1.3 아가로즈 젤로 96웰 플레이트를 사용하여 젤 전기전구로 분석합니다. 100 밀리리터 아가로즈 젤의 경우 200볼트에서 10~15분 간 드시면 됩니다. 그 후, 일회용 마시는 빨대를 사용하여 아가로즈 젤에서 DNA 밴드를 소비합니다.
각 PCR 제품에 대해, 1.5 밀리리터 튜브에 빨대와 아가로즈 젤 플러그를 놓고 가위로 짚크기를 다듬습니다. 그 후, 아가로즈 플러그를 각 튜브에 꺼내밀 조각의 끝을 압박합니다. 그런 다음 젤 추출 버퍼 300 마이크로리터와 각 튜브에 젤 추출 유리 구슬 5 마이크로리터를 추가합니다.
젤 추출 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 PCR 제품을 추출하고 30 마이크로 리터의 물로 구슬에서 DNA를 희석시하십시오. Sanger 시퀀싱을 위해 정제된 DNA를 제출하고, 2라운드 중첩 PCR에 사용되는 전방 프라이머를 제출한다. PCR 제품 격리 전후의 성공적인 역 PCR의 아가로즈 젤 전기전도가 여기에 나와 있다.
M은 DNA 마커 후자를 나타내며, 12의 각 행은 PCR 플레이트의 단일 희석에서 기술적 복제를 나타낸다. 이 경우 단일 PCR 제품은 각 샘플의 두 번째 또는 세 번째 1:3 희석에 의해 달성되어야 합니다. 이러한 희석에서, 제품의 대략 50%는 진정한 바이러스 세포 DNA 접합을 나타낼 것입니다.
나머지 절반은 HBV DNA 중급물의 증폭을 나타내지만. 이 기술은 연구원이 고도로 통제된 체외 감염 시스템에 있는 HPV DNA 통합을 탐구하는 것을 허용했습니다. 생물학 분석과 같은 추가 방법은 추가 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다.
예를 들어, HPV DNA 통합이 세포 게놈의 특정 영역에서 발생하는 경우. 감염 B형 간염 바이러스와 함께 일하는 것은 바이오 안전 캐비닛 및 사전 예방 접종과 같은 위험하고 적절한 감염 통제가 항상 이러한 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
