이 방법은 간부 감염 및 간 질환 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 간 상주 세포 인구의 기여등, 바이러스 병인, 세로 감염 운동학, 바이러스 복제 메커니즘, 면역 침입, 생리 모델 시스템 및 약물 검사 연구. 이 기술의 주요 장점은 간 미세 환경을 재구성하는 기능입니다.
이는 오랜 기간 동안 유지 될 수 있으며 생리적 관련 수준에서 B 형 간염 감염에 자연적으로 취약합니다. 이것은 이전에 B형 간염 필드에 있는 근본적인 제약이었습니다. 약물 검사 연구는 연장된 기간 동안 생리적 플랫폼에서 수행될 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 HBV 감염의 치료 또는 진단으로 확장됩니다.
이를 통해 기존 및 신규 치료 전략의 효능을 분석하는 결과순차적 약물 치료의 평가를 할 수 있습니다. 이 방법은 B형 간염에 대한 이해를 제공할 수 있으며, 다른 간편감염, 간 질환 또는 약물 대사 연구를 포함한 질병의 다른 연구에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 투쟁 할 것 이다, 그것은 오랜 기간 동안 간 조직의 성공적인 유지 보수를 허용 하기 위해 특정 세부 사항에 주의 필요 하기 때문에.
또한 특수 공구 및 장비에 익숙합니다. 이 메서드의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 플레이트의 조립뿐만 아니라 세포의 해동 및 파싱을 포함한다.
간 유래 세포의 장기 배양에 관여하는 단계는 새로운 배양 시스템을 사용할 때 도전적이기 때문에. 먼저, 간 칩 플랫폼과 관련된 압축기와 진공 펌프를 모두 켭니다. 유리 튜브 캐비닛으로 이동하여 접시를 조립하고 평형화합니다.
소염수 판을 무균 조립하기 위해 플레이트 베이스에 멸균 멤브레인을 배치합니다. 멸균 멤브레인이 베이스 플레이트의 두 핀에 원활하게 놓여 있는지 확인합니다. 그런 다음 잘 함유 된 상단 플레이트를 추가합니다.
멸균 플레이트 뚜껑을 추가합니다. 또한 33파운드로 설정된 자동 정밀 토크를 사용합니다. 나선형 조임 시퀀스를 사용하여 플레이트 베이스의 나사를 조입니다.
수동 토크를 사용하여 모든 나사를 35 파운드로 조여 있는지 확인하십시오. 다음으로, 프라이밍 전에 간세포 파종 중간을 섭씨 37도로 미리 데우습니다. 완전히 조립된 접시를 세탁도크에 놓습니다.
그리고 접시가 완전히 스냅 있는지 확인하십시오. 각 웰의 저수지 측에 간세포 파종 배지 400 마이크로리터를 추가하여 판을 프라임합니다. 그 후 초당 1마이크로리터에서 3.5분 동안 위쪽으로 흐름을 시작합니다.
플레이트 측면의 빨간색 표시기는 미세 유체 순환이 제대로 작동하는지 나타냅니다. 배지가 플레이트의 세포 성장 측에 펌핑되면 간세포 종자 배지의 1.2 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 37°C와 5%의 CO2에서 가습된 인큐베이터 내에 도킹 스테이션으로 조심스럽게 옮기면 됩니다.
16시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 시작합니다. 그 후 접시를 세탁도크로 옮기습니다. 거품을 제거하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫.
멸균 집게를 사용하여 각 웰에 멸균 원형 필터 용지를 추가합니다. 그런 다음 셀 부착 스캐폴드와 각 웰에 유지 링을 추가합니다. 멸균 플런저를 사용하여 각 우물을 밀어 내고 고정 링과 비계를 제자리에 고정하십시오.
다음으로 모든 매체를 흡인합니다. 그리고 스캐폴드 위에 미리 데워진 간세포 파종 배지 400마이크로리터를 부드럽게 추가합니다. 3 1/2 분 동안 초당 한 마이크로 리터에서 아래쪽 방향으로 흐름을 시작합니다.
플레이트의 저수지 측에서 펌핑된 모든 매체를 흡인합니다. 각 웰에 간세포 파종 배지의 1.4 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 도크에 반환하여 최대 1.6 밀리리터당 총 부피를 가져옵니다.
첫째, 간세포 해동 매체및 간세포 파종 중37도까지 미리 데워보겠습니다. 다음으로, 공급 업체의 지시에 따라 기본 인간 간세포의 한 유리병을 해동. 유리 튜브 캐비닛에서 간세포 파종 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
그런 다음 다시 중단된 세포를 얼음 위에 놓습니다. trypan blue를 사용하여 셀의 생존 가능성이 90% 이상이되도록 셀을 세어 완전히 조립된 플레이트를 세척 도크로 옮길 수 있습니다. 그리고 우물에서 모든 매체를 흡인.
얼음에서 세포를 검색하고, 간세포 파종 배지의 500 마이크로 리터 부피에서 각 우물에 600, 000 간구를 추가합니다. 초당 1마이크로리터의 유량으로 하향 방향으로 흐름을 시작합니다. 각 웰에 900 마이크로리터의 간세포 파종 배지를 추가하여 각 웰의 총 부피를 1.6 밀리리터로 가져옵니다.
플레이트를 37°C에서 가습된 인큐베이터 내에 5%의 CO2로 옮기는 경우. 8시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 하향 방향으로 흐름을 시작합니다. 그 후, 8시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 반전시다.
그런 다음 접시를 세면 선착장으로 옮기고 우물에서 모든 매체를 흡인합니다. 각 웰에 400 마이크로리터의 간세포 유지 보수 매체를 추가합니다. 그리고 3 1/2 분 동안 초당 하나의 마이크로 리터의 유량으로 하향 방향으로 흐름을 시작합니다.
다음으로, 저수지에서 모든 매체를 흡인하고 간세포 유지 보수 매체의 1.4 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 가습된 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션으로 옮기면 섭씨 37도, CO2 5%로 이동합니다. 48시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 시작합니다.
48 시간 후, 세척 도크에 전송하여 접시를 씻어. 우물에서 모든 매체를 흡인. 또한 유지 보수 매체의 400 마이크로 리터를 추가합니다.
그리고 3.5 분 동안 초당 한 마이크로 리터에서 아래쪽으로 흐름을 시작합니다. 그런 다음 우물의 저수지 측에 나타나는 모든 매체를 흡인합니다. 간세포 유지 보수 매체의 1.4 밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 가습 된 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 플레이트를 다시 옮기합니다. 48시간 동안 초당 1마이크로리터의 유량으로 위쪽으로 흐름을 시작합니다. 48시간마다 이 세척 및 교체 공정을 사용하여 매체를 교체하십시오.
1차 인간 간세포는 일반적으로 기존의 배양 시스템을 사용할 때 제한된 시간 동안만 안정됩니다. 그러나 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 장시간 기능적으로 유지 관리할 수 있습니다. 인간 알부민은 기능성 간세포에 의해 분비되며 간 기능을 평가하기위한 최고의 마커로 간주됩니다.
알부민은 적어도 날 40 포스트 시드까지 3D 문화에 의해 안정적으로 높게 표현되는 것으로 보입니다. 공동 배양의 경우, Kupffer 세포의 기능성과 생존능력은 특정 사이토카인의 분비를 측정하여 평가됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이, IL-6 및 TNF 알파의 측정된 수준은 세포가 기능적으로 유지되고 실행 가능하다는 것을 나타냅니다.
그들의 생리적인 세포 대사를 유지하는 것 이외에, 이 문화는 HBV 감염에 예외적으로 영향을 받기 쉽게 되었습니다. HBV DNA 및 그밖 바이러스성 마커는 감염 후 2일에서 쉽게 검출될 수 있습니다. 기존의 배양은 DMSO 와 PEG로 보충된 적어도 500HBV 게놈 등가물로 접종을 요구하지만, 이러한 3D 배양은 05만큼 적게 보충되지 않은 게놈 등가물로 감염됩니다.
바이러스 감염의 분비 마커 이외에, 간세포 함유 발판은 이 배양에서 회수됩니다. 면역 형광 현미경 검사는 이 비계가 바이러스성 항원이 포함되어 있다는 것을 밝힙니다. 이 절차를 시도하는 동안, 세포 죽음을 피하기 위해 시드하기 전에 간세포를 처리 할 때 부드러운 것을 기억하는 것이 중요합니다.
또한 플레이트가 올바르게 조립되고 모든 흐름 채널이 간구체를 시드하기 전에 올바른 미디어 순환을 허용하는 것이 필수적입니다. 이 절차에 따라, 면역 형광과 같은 그밖 방법은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다. 조직 내 감염된 세포의 위치 및 빈도를 포함한다.
간세포의 생리적 상태는 또한 단단한 접합 단백질 ZO-1을 포함하는 알부민 또는 간 구조물을 염색하여 평가될 수 있다. 이 발달 후에, 이 기술은 생리적인 3D 모형 시스템에서 B형 간염 감염 및 면역 반응을 탐구하는 바이러스학의 필드에 있는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다. B형 간염 바이러스와 함께 일하는 것은 위험할 수 있고, 이전 예방 접종, 적절한 PPE의 사용, 적절한 생물 안전 지침에 따라 일하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
