저자 그렉 스미스, 리사 Pomeranz, 매트 라이먼, Marlies 엘드리지, Halina Staniszewska Goraczniak하고, 조정이 프로토콜의 엔키 스트 연구실의 구성원의 기여에 감사드립니다.

1. 첫날 : 바이러스성 감염 및 버퍼의 작성 <ol><li> 감염에 대한 조직 배양 세포의 50-10 요리 (15cm 직경)를 준비, pseudorabies 바이러스 (PRV) 또는 헤르페스에 대한 베로 세포에 대한 예 : PK - 15 세포 (HSV) 바이러스를 단순. </li><li> 세포가 95 때 - 100 % 합류의 (뫄) 50-10에 그들을 감염. 이렇게하려면 강판 당 4 ML의 총 볼륨에서 바이러스 주식을 사용하여 각 접시를 예방하고 37에서 1 시간 동안 접시를 품어 ° C. 록 번호판 부드럽게 매 15 분 셀 monolayer은 바이러스에 의해 완전히 inoculum 코팅 유지할 수 있습니다. 한편, 다음 단계에 대한 매체를 따뜻하게. </li><li> 감염 한 시간 후, 접시에서 바이러스 inoculum을 대기음 따뜻한 중간 15 ML을 추가하고, 37 품어 ° C를 humidified 인큐베이터에 12~20시간하십시오. </li><li> LCM 버퍼 (표 1 참조)과 ° C 철저하게 믹싱을위한 4 박 바위를 준비합니다. (표 2 참조) 바이러스의 DNA resuspension에 대한 TNE를 준비합니다. </li></ol> 2. 둘째 날, 1 단계 : 세포 용해와 Ultracentrifugation <ol><li> 시각 그 세포의 감염이 균일한 cytopathic 효과 (CPE)를 발생했습니다 확인합니다. 모든 세포가 반올림지만, 접시에서 해제하지 않은까지 감염이 진행하도록 허용합니다. </li><li> 매체에 감염된 세포를 긁어, 50 ML 원뿔 튜브에 세포와 매체를 결합. .이 단계에 필요한 원뿔 튜브의 개수가 위의 단계 1.2 감염에 사용되는 요리의 개수에 따라 달라집니다, 예를 들어 한 50 ML 원뿔 튜브는 각 옵션 15 ML 매체 3 요리의 최대 펠렛하는 데 사용할 수 있습니다 린스 10 ML PBS와 번호판과 세포와 매체와 결합. </li><li> 원심 분리기 세포와 실온에서 2,000 상대 centifugal 힘 (RCF)에서 10 분 동안 매체는 다음 뜨는 기음과 PBS의 10 ML 각 펠렛을 resuspend. 한 바이러스 감염의 펠렛이 단계 2.2의 여러 원뿔 튜브에 퍼져 있었다면, 다음이 단계에 하나의 원뿔 관에 recombined 수 있습니다. 원심 분리와 열망을 반복 옵션 :.이 펠렛은 -20 ° C에서 보관 및 프로토콜은 나중에 계속있을 수 있습니다. </li></ol> 3. 둘째 날, 2 단계 : Ultracentrifugation 다음 단계 동안 세포 펠릿 가능한 얼음 LCM 버퍼 때마다 보관하십시오. <ol><li> 0 % 글리세롤로 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가 - LCM 버퍼. 그것을 설정하여 초원 심 분리기 (아래 단계 3.9)을 냉각 시작 4 ° C와 진공 켜기. </li><li> 그것이 더 이상 clumpy 없을때까지 버퍼 LCM - 0 % 글리세롤 5 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend. 튜브 어떤 소화 되 다만 세포 펠렛을 해산시키기 위해 필요할 경우, 소용돌이. </li><li> 1.5 ML의 프레온 (1,1,2 - trichloro - 1 ,2,2 - trifluoroethane)을 추가하고 적극적으로 vortexing하여 압축을 풉니다. 즉시 4 ° C.의 온도에서 2000 RCF 10 분 원심 분리기 넓은 구멍 피펫 팁 (인터페이스를 피하)와 상위 레이어를 수집하고 새로운 튜브를 선택하기 위해 전송 :. 펠렛은 젤라틴 고체 경우, 신속하게 새로운 튜브로 가기 레이어를 부어 수 있습니다. </li><li> 프레온 추출을 반복하고 다시 원심 분리기. </li><li> 상단 레이어 (~ 5 ML)를 수집하고 새로운 polyallomer의 초원 심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. LCM 버퍼 - 남은 두 글리세롤로 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다. </li><li> LCM (중간 층), 그리고 45 % 글리세롤 2.5 ML로 다시 underlaying - - LCM (아래 층) 5 % 글리세롤 3 ML과 프레온 추출물 (상단 레이어)를 underlaying하여 polyallomer의 원심 관에 그라디언트를 준비합니다. 튜브 내용의 오버플로우를 방지하기 위해 얇은 피펫을 사용합니다. </li><li> 필요한 경우, LCM 버퍼의 동일한 비율을 사용하여 동등한 균형 튜브를 준비합니다. </li><li> 초원 심 분리기의 버킷으로 튜브를 전송합니다. 상단 레이어 (한 번에 ~ 50-100 μl)로 LCM 버퍼 - 부드럽게 추가 0 % 글리세롤을 추가하여, 서로의 0.1 g 이내에 양동이를 균형. </li><li> 수평 또는 스윙 버킷 회전자와 감기 초원 심 분리기를 사용하여 4 ° C.의 온도에서 77,000 RCF (SW41Ti의 로터 예 : 25,000 RPM)에서 1 시간 동안 균형 샘플을 스핀 </li><li> ultracentrifugation 동안 에탄올 침전 단계 (아래 4.6)에서 부동의 DNA를 캡처하는 유리 후크합니다. 유리 파스퇴르 pipet의 양쪽 끝을 잡고 불꽃을 통해 중간 부분을 일시 중지합니다. 유리의 섹션이 거의 용융되면, 유리 스트레칭 부드럽게 당겨 단단히 직각 갈고리 (&lt;90도)을 만들 수 부드럽게 구부하고 끝 봉쇄하기 위해 급격하게 당기십시오. 유리 후크의 일각이 열려 있으면 유리 그것을 가까운 정도로 녹아 있도록 불꽃 위에 팁을시오. </li><li> ultracentrifugation 후, 당신은 한 가운데에있는 어두운 장소와 얇은 불투명 펠렛 나타납니다. 조심스럽게 측면을 따라 drippings 등 관에서 액체를 대기음하지만 튜브 하단의 펠렛을 피하고. </li><li> 상온에서 0.5 ML의 TNE를 추가합니다. </li><li> 펠렛은 펠렛의 수화를 허용하도록 적어도 10 분 동안 앉아 보자. Optional : 4 보관하면 펠렛도 밤새 TNE에 resuspend 수 있습니다 ° C. </li></ol> 4. 제 일 : &quot;유령&quot;의 DNA 강수량 <ol><li> 작은 구멍 피펫 팁 (예 : p200 피펫 팁)로 pipetting하여 펠렛을 휴식. 바이러스 DNA가 아직도이 시점에서 capsids에 포함되어 있기 때문에,이 단계에서 전단 걱정하지 마십시오. capsids을 파괴하기 위해 상온에서 바이러스 펠렛을 포함한 튜브 다음 시약을 추가합니다 : <ul><li> 4.25 ML TNE </li><li> 0.25 ML 10% SDS </li><li> 이 MG Proteinase K </li></ul> 부드럽게 이러한 시약을 혼합하는 바위. 점성이 약간 증가가있을 것입니다. </li></ol> 에 여기에서 전단주의, 예를 들어 큰 구멍 pipettes를 사용하여 바이러스 물질에게 소용돌이하지 <ol start="2"><li> 페놀 - 클로로포름 5 ML를 추가하여 바이러스 단백질을 추출하고 즉시 유제를 유지하는 반전이나 vortexing 시작합니다. 10 초 동안 혼합 후, 실온에서 2000 RCF에서 5 분 동안 감광 유제를 원심 분리기. , 넓은 구멍 피펫 팁로 가기 레이어를 수집 인터페이스를 피하기 위해, 새로운 튜브로 전송 옵션 :.이 단계에서 사용 위상 잠금 젤 (PLG) 튜브 인터페이스에서 오염을 피할 수 있습니다. </li><li> 페놀 - 클로로포름 추출을 반복하고 다시 원심 분리기. </li><li> 두 번째 페놀 - 클로로포름 추출 후 30 ML 유리 Corex 튜브로 가기 레이어를 수집하고 10~15분위한 -20 ° C에서 튜브를 진정, 그것이 정지하지 않는주의한다. </li><li> 얼음처럼 차가운 에탄올 10 ML 추가 튜브 (맨 위에 Parafilm M의 부분을 스트레칭하여 예) 커버하고, 즉시 섞어 반전. 얇은 끈적끈적하는의 석출물로 구성되어 나타나는 DNA &#39;유령&#39;에 대해보세요. 부드럽게 더 섞어 쓰는 DNA 함께 클러스터 precipitates 원인 튜브를 반전. </li><li> DNA의 유령 (들)을 캡처하는 유리 후크를 사용합니다. 조심스럽게 초과 액체를 제거하기 위해 DNA를 얼룩 후, 1.5 ML 튜브에 후크를 (아래 팁) 장소 및 건조 수 있습니다. 0.25 추가 - TE 0.5 ML를 DNA의 유령을 해산합니다. 적어도 한 시간 동안 진행하는 DNA의 resuspension을 허용합니다. 4 스토어 DNA ° C. 옵션 : 1.5 ML 튜브에 유리 후크를 끊다, DNA의 수율을 최대화하려면, 유리 파편 떨어져 있도록 resuspension 시간이 지남에 계속할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 뫄 충분히 높은 통해 세포는 야생 형 PRV의 변종에 대한 ~ 18 시간 이후 감염 (hpi) 내에서 전체 CPE를 달성해야하고, 야생 형 HSV - 1 계통 (그림 1) ~ 24 hpi. 일단 감염된 세포 펠렛을 수확이고, 나머지 프로토콜 단계를 하나의 긴 하루 만에 완벽하게 하루나 이틀 (그림 2)을 통해 수행하실 수 있습니다. DNA의 귀신을 캡처하는 유리 후크를 준비하면 나중에 그것이 1.5 ML 튜브의 기초 (그림 3)에 맞게 수 있도록 후크 각도가 90도 미만이어야 수 있도록하는 것이 중요합니다. 이 후크의 팁을 밀폐하면 pipet 내부 DNA 손실을 방지할 수 있습니다. DNA의 유령은 침전 단계 중에 양식과 흰색, 끈적끈적하는 쓰레드 (그림 4)로 표시됩니다. 서로 및 / 또는 DNA를 캡처하는 데 사용되는 유리 후크 이러한 집계 및 막대기. 따라서 동일한 유리 후크는 강수량 솔루션 내에서 DNA의 여러 스레드를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 원하는 볼륨에 따라 열을 선택 : </td><td> 10 ML </td><td> 15 ML </td><td> 20 ML </td><td> 40 ML </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1.3 ML </td><td> 1.9 ML </td><td> 2.5 ML </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 1M 트리스 (산도 7.4) </td><td> 300 μl </td><td> 450 μl </td><td> 600 μl </td><td> 1.2 ML </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> 0.5 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 10 μl </td><td> 15 μl </td><td> 20 μl </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 (사용하기 전에 바로 추가) </td><td> 4.3 μl </td><td> 6.5 μl </td><td> 8.6 μl </td><td> 17.2 μl </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> 원하는 퍼센트 글리세롤 (0, 5, 또는 45 %)에 대한 비율을 사용 </td></tr><tr><td> 0 % 글리세롤 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 8.3 ML </td><td> 12.5 ML </td><td> 16.7 ML </td><td> 33.4 ML </td></tr><tr><td> 5 % 글리세롤 </td><td> 0.5 ML </td><td> 0.8 ML </td><td> 1.0 ML </td><td> 2.0 ML </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 7.8 ML </td><td> 11.7 ML </td><td> 15.7 ML </td><td> 31.4 ML </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4.5 ML </td><td> 6.8 ML </td><td> 9.0 ML </td><td> 18.0 ML </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 3.8 ML </td><td> 5.7 ML </td><td> 7.7 ML </td><td> 15.4 ML </td></tr></tbody></table> 표 1. LCM 버퍼의 준비를위한 조리법 <table border="1"><tbody><tr><td> 50 ML 량 </td></tr><tr><td> 5 ML 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 ML 1M 트리스, 산도 7.5 </td></tr><tr><td> 1 ML 0.5 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> 41.5 ML H 2 O </td></tr></tbody></table> 표 2. TNE (; 50 MM 트리스, 산도 7.5, 10 MM 0.1 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) NaCl)의 준비 <table border="1"><tbody><tr><td> 1 L 부피에 대한 </td></tr><tr><td> 0.2 g KCl </td></tr><tr><td> 0.2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8g NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g 나 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1L로 H 2 O </td></tr></tbody></table> 표 3. PBS (; 1.5 MM KH 2 PO 4; 137 MM NaCl, 8.1 MM 2 HPO 4 나, 산도 7.0 2.7 MM KCl)의 준비 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" /> 그림 1. PK15 세포 감염 (A) 이전, 감염의 높은 다중성 후 (B) 미드웨이 감염을 통해, 그리고 (C) cytopathic 효과 (CPE)에서. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" /> 그림 2. 프로토콜의 개요. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" /> 그림 3. 유리 세 대표 사례는 바이러스 DNA의 유령을 수집하는 데 사용 후크. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" /> 그림 4. 잘 구성된 풍부한 DNA &quot;귀신&quot;의 대표적인 예라고 할 수 있습니다.

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	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜의 일부는 원래 BSL4 조건에서 바이러스성 DNA의 격리를 위해 개발하지만, 그것은 비 - BSL 조건에 동등하게 잘 적응했다. 4 우리는 일반적으로 DNA의 genomes를 가지고있는 알파 - herpesviruses PRV과 HSV - 1에서 DNA를 분리하려면이 프로토콜을 사용 capsid와 지질 봉투에 둘러싸인 proteinaceous로 묶여. 7,8 그러나 포함 베타 및 감마 - herpesviruses과 adenoviruses, 가능성이 다른 큰 DNA 바이러?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 프레온 (1,1,2 - trichloro - 1 ,2,2 - trifluoroethane) </td><td> 어부 </td><td> T178 - 4 </td><td> 의 적절한 폐기에 대한 지침 프레온 함유 폐기물에 대한 기관에 확인하거나, 멘데즈 외를 참조하십시오. 잠재 프레온 대안. 9 </td></tr><tr><td> 위상 잠금 겔 튜브, 헤비 15ml 용량 </td><td> 5 PRIME </td><td> 2,302,850 </td><td> 옵션 </td></tr><tr><td> Polyallomer의 초원 심 분리기 튜브 </td><td> 베크맨 * </td><td> 331,372 * </td><td> 자신의 초원 심 분리기에 적합 * 선택 튜브는, 이들은 한 예로 포함됩니다 </td></tr><tr><td> NP - 40 / IGEPAL </td><td> 시그마 </td><td> I - 3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK - 15 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL - 33 </td><td></td></tr><tr><td> 베로 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL - 81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

바이러스는 세포 의무 기생충이며, 따라서 그들의 DNA의 연구는 거리 숙주 세포 오염 물질과 DNA에서 바이러스 물질을 격리가 필요합니다. 여러 다운 스트림 응용 프로그램이 프로토콜에 의해 제공됩니다 순수 바이러스 DNA의 다량을 필요로합니다. 이러한 응용 프로그램은 바이러스성 게놈 호스트 DNA의 제거 바이러스는 시퀀스에 대한 데이터 출력을 최적화하는 데있어 매우 중요합니다 시퀀싱, 그리고 새로운 바이러스 재조합 종자의 생산, 플라스미드 및 선형 바이러스 DNA가 재조합을 용이하게 정화의 공동 transfection. 1,2를 포함 3 이 절차는 extractions와 감염된 세포에서 선형 herpesvirus nucleocapsid DNA를 정제 분리 밀도 기반 원심 분리의 조합을 활용합니다. 4,5 초기 정화 단계 extractions 및 원심 분리 단계 동안 바이러스 DNA를 포함하고 보호하는, 정화 바이러스 capsids을 분리하는 것을 목표로 세포 단백질과 DNA를 제거하는 것이. nucleocapsids의 용해 다음 바이러스 DNA를 출시, 두 최종 페놀 - 클로로포름 단계는 남아있는 단백질을 제거합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 1.90의 평균 OD 280분의 260과 고농도 순수합니다. 사용 감염된 세포, 150-800 μg 이상에서 바이러스성 DNA 범위의 수율의 수량에 따라 다릅니다. 이 DNA의 순도는 4C에서 장기 보관 동안 안정합니다. 이 DNA는 따라서 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응 및 transfections에 적합합니다. 이전 프로토콜을 처음으로, 그것은 요리 당 세포 (예 합류 15cm 접시에 8 X 10 6 PK - 15 세포의 평균) 및 바이러스 주식의 titer를 사용하는 (의 평균 숫자를 아는 것이 중요합니다 ML 당 예 : 1 X 10 8 플라크 형성 단위 -). 이들은 프로토콜에 대한 감염의 적절한 다중성을 (뫄) 계산이 필요합니다. 예를 들어 6, 뫄 5시 위 바이러스 주식과 PK - 15 세포 중 하나 15cm 접시를 감염시킬, 당신은 400 μl를 사용하는 것입니다 매체의 3.6 ML (한 15cm 플레이트 4 ML 총 접종 볼륨)로 바이러스 주식을 희석. 여러 바이러스성 DNA의 준비가 동시에 준비하실 수 있습니다. 동시 준비의 개수는 초원 심 분리기의 회전자에 의해 개최 튜브의 숫자로 제한됩니다 (바이러스 당 하나, 아래 단계 3.9 참조). 여기 한 바이러스에 완료되는 것처럼 절차를 설명합니다.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.8K 조회수.  Princeton University. 우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...