여기에 설명 된 호흡기 병원체 분석에 작품은 코넬 동물 건강 진단 센터 내부 개발 기금에 의해 지원되었다. 나노 PCR 워크 플로우 및 관련 품질 보증 시스템의 개발은 부분적으로 (FOA PA-13-244) 투자와 보조금 제 1U18FD005144-에서 식품의 약국 (FDA)의 수의학 연구소 조사 및 대응 네트워크 (FDA 수의사 LIRN)와 공동으로 수행 하였다 01. 발행 수수료 VWR과 콴타 바이오 사이언스가 후원했다. 우리는 쓰고 프로토콜을 검토 그들의 도움 가브리엘 Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina 카모, XiuLin 장, Jinzhi 유, Weihua 왕, 그리고 카트리나 워커 감사합니다. 우리는 저자 인터뷰 촬영을 위해 마이크 캐롤 감사합니다. 우리는 마침내 자신의 도움이 의견 에디터 세 익명의 피어 리뷰 감사합니다.

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	<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform.">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).</li><li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform.">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li><li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+screening+for+blood-borne+viral,+bacterial,+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform.">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li><li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR.">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li><li>Dreier, J., St&#246;rmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays.">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li><li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy.">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li><li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomics+of+emerging+pathogens.">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li><li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis.">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li><li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory,+a+Model+for+the+One+Health+Initiative.">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li><li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+of+Ticks:+The+Rule+Rather+Than+the+Exception.">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).</li></ol>

마샤 슬레이터와 엘렌 Ortenberg이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 써모 피셔 사이언 티픽 Inc.의 직원입니다.

이 절차 여섯 개월 (주 2 ~ 3 회)의 과정을 통해 우리의 실험실에서 호흡기 병원체의 일상적인 테스트를 위해 사용되어왔다. 또한 별도로 정의 접시 분변 시료 및 박테리아 균주의 장내 병원균 프로파일과 동일한 방법을 사용하여 성공이 있었다. 플레이트가 생성되면, 경험이 풍부한 직원은 하나의 표준 근무 시간 내에 2-7 단계를 완료 할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 프리 앰프 플레이트의 적절한 시일 (증발을 방지하기 위해 신속하게 수행되어야한다) 플레이트 사이 프리 앰프를 샘플들의 전송 및 증폭 판의 최종 덮고있다. 이 크게이 공정에 필요한 시간 및 서류의 양을 환산 결과 분석 (샘플 및 컨트롤 곡선을 확인)을위한 가이드로서 매크로 스프레드 시트의 사용은 중요 하였다. 제공되는 매크로 스프레드 시트는 예입니다; 서로 다른 구성으로 플레이트에 대한 수정 또는 재 작성 될 필요가있을 것이다. 이것은 쉽게 체육 될 수 있습니다기본 스프레드 시트 지식을 가진 사람이 rformed. 인해 증폭 판 (33 NL)에로드 시료의 미량으로 미리 증폭이 요구된다. 이 프로토콜 (미도시)의 최적화에서는 종래 증폭 마스터 믹스, 랜덤 프라이머의 첨가, 횟수, 소둔 시간, 희석 포함한 프리 앰프 파라미터의 개수를 비교 하였다. 각각의 목표는 자신의 최적의 조건을 가지고 있었고, 여기에 기술 된 우리의 패널에 대한 검색 전체의 최고 한도를 산출하는 사람들을 나타냅니다. 이 패널은 병원성 목표와 일상적인 의학적 진단 테스트에서 발생하는 샘플 종류의 넓은 범위를 커버하지만, 프리 앰프 절차에 대한 수정은 다른 패널 필요할 수 있습니다. 제조자 최적화 증폭 조건은 95 ° C에서 앤 변성이어서 95 ° C 효소 활성에서 10 분으로 표준 프로브 기반 실시간 PCR 프로토콜에 기초60 ° C에서 일링은 / 확장. 프라이머 및 프로브는 또한 미리 인쇄 제조업체 최적화 조건을 이용하여 적정하므로 필요하지 않은 판에있다. (상관없이 타겟의 종류) 모든 샘플에 대해 역전사 사전 증폭 단계를 결합함으로써 워크 플로우의 효율성을 유지하기 위해 필요했다. 모든 샘플은 전사 역 갖는 것은 또한 감도를 극대화하기위한 유용합니다. 또한 최소화 억제제에 최적화 된 프리 앰프를위한 마스터 믹스의 사용은 동일한 플레이트 상에 상이한 종류의 시료 조합에 다양성을 허용한다. 질병 통제 (CDC) 나노 리터 규모의 반응 여기 슈 등. (7)에 의해 기술 및 적응 인플루엔자 매트릭스 분석 센터는 범용 인플루엔자 인간과 반려 동물에서 테스트 샘플에 적합한 분석이다. 이것은 마이크로 리터 규모 REA을 사용하여 모든 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자의 범용 검출 설계된ctions. 그것은 CDC 인간 인플루엔자 바이러스 패널과 CDC 돼지 독감 패널의 일환으로 전 세계적으로 사용되어왔다. 여기에 적응 EHV-1 분석 8 낙태 및 신경 학적 질환 (Pusterla와 Hussey는 10 검토)를 일으킬 수 있습니다 말의 중요한 호흡기 병원체를 검출한다. 종 독립적 내부 제어와 높은 처리량 플랫폼 테스트를 적응의 의미는 그들이 OneHealth 감시 방법에 통합 될 수 있다는 것이다. 높은 처리량 테스트 플랫폼에서 이러한 분석을 모두 갖는 것은 임상 시설, 대피소 및 성능 이벤트에 대한 비상 대책을 촉진 할 것이다. 상기 결과는 분석 성능이 상당히 변화를 보였다 마이코 cynos 제외 가진 플레이트상의 모든 표적을 대표했다. 이는 이상적인 58-60 및되어야 프라이머 차선의 용융 온도 (T의 m)에 것 같았다# 176; C (이상적인 프로브 (Tm)가 68-70 °에 C)입니다. 이 플랫폼의 한계는 신속 시퀀스를 변경하는 능력을 제한 개별 프로브를 주문하는 것보다 판을 설계하고 제조하는 것이 더 오래 걸리는 점이다. 일반적으로 실시간 PCR의 다른 제한은 신규 한 또는 예기치 않은 병원체를 검출 할 수 없다는 것이다. 이것은 여러 종류의 서열과 일치 분석을 설계함으로써 어느 정도 극복 될 수 있지만, 편향 총 유전체 기반의 방법은 새로운 에이전트 발견 더 적합하다. 11,12 나노 실시간 PCR을위한 새로운 패러다임을 허용 증후군 기반의 높은 처리량 분자 진단 시약 및 노동 비용을 절감하는 데 유용 종 기반의 테스트보다는. 이 방법에 의하여 대형 패널 테스트는 던 및 Gurfield 13 Moutailler 외. (14)에 의해 기재된 것과 같은 OneHealth 감시 활동을 용이하게 할 수있다. 초기 면봉 샘플 수집,일반적으로 임상 발병 3 일 이내에, 호흡기 병원체의 존재를 확인하는 가장 좋은 기회를 제공합니다. 감염증 출현은 종종 예측 불가능하고, 시약의 변형 없이도 다른 종에 대해 수행 할 수있는 테스트가 준비 이상적이다. 이 기술의 미래 애플리케이션 pathotyping, 항생제 내성 프로파일 및 상기 신드롬 - 기반의 임상 진단 패널에있을 가능성이 높다. 나노 실시간 PCR 여러 샘플 병원체 유형의 신속한 고 처리량 스크리닝에 가장 유용하고 새로운 긴급 병원체를 식별하기위한 바이어스 또는 부분적으로 바이어스 시퀀싱 기반 접근법에 의해 보완 될 것이다.

하나의 질병에 대한 테스트중인 샘플의 많은 사용하지 않는 인간과 동물에 대한 임상 적 진단에 여러 에이전트의 신속하고 포괄적 인 검출을위한 수요, 병원균 검출을위한 단일 생물 분자 진단 방법은 부담이다. 수의학 맥락에서 높은 처리량 진단 방법으로 인해 종의 다양한 병원체를 덮는 추가의 필요에 특히 중요하다. 세균의 수를 포함하는 테스트 요구의 예는 OneHealth 식중독 질환의 관리 및 신흥 병원체 감시 접근 바이러스 (DNA 또는 RNA가 기준), 기생충, 진균. 테스트 효율을 향상시키기 위해 함께 여러 분석 (다중화)에 대한 시험을 조합하는 과제는 감도의 가능한 손실 최적화 분석법 검증 큰 부담이다. 나노 리터 규모 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 바꾼다 인많은 별도의 반응이 동일한 샘플 (1)에서 동시에 실행할 수있는 다중의 연습 네이티브. OpenArray 플랫폼은이 원리 (2)의 응용 프로그램입니다; 이는 실시간 PCR과 마이크로 어레이 기술을 결합한다. 공간 다중화의 개념에 기초하여, 모든 샘플은 관통 구멍에 분리 대상의 다수를 위해 테스트된다. 이 플랫폼은 초기에 시아닌 기반의 이중 가닥 DNA 결합 화학 2와 함께 사용과 어두운 담금질 프로브 (3)를 사용하여 프로브 기반 화학에 대해 사용할 수 있습니다했다. 이 플랫폼은 주로 인간과 동물 사 (5)에 유전 적 프로파일을 위해 사용되어왔다. 이는 최근 Grigorenko 동부 등에 의해 혈액 유래 DNA 및 RNA 병원체를 검출하도록 하였다. (6) 두 단계 역전사 / 프리 앰프 (프리 앰프) 절차를 사용. 우리는 호흡기 병원체 초에서 두 종류의 검출 여기 원스텝 프리 앰프 기반 절차를 설명retions 및 표준 근무 전적으로 수행 될 수있는 다른 종류의 시료 다양한. 한 단계의 프리 앰프가 완료되면, 샘플이 나노 PCR 플랫폼과 함께 제공되는 자동화 된 액체 처리 시스템에서 허용하는 형식입니다 384 웰 플레이트로 전송됩니다. 이 시스템은 한 번에 최대 4 판 (192 샘플 및 제어)의 표면에 걸쳐 마스터 믹스 및 샘플을 그린다. 이로드 프로세스에 따라, 우리는 샘플을 증폭 한 인쇄 된 페이지에 맞는 테이블에 각 샘플 / 대상 조합에 대한 3 기술 복제의 평균을 요약하는 매크로 스프레드 시트를 사용하여 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 이 플랫폼을 사용하여 시료에서 추출한 DNA 및 / 또는 RNA를 분석하는 균일 한 방법이 설립되었다. 샘플의 다양한 추출 역전사 및 오류의 가능성을 최소화하는 96 웰 형식으로는 예비 증폭 하였다. 테스트 호흡 샘플은 비강 면봉, 깊은 인두 면봉을 포함,트랜스 기관 세척, 기관지 세척 및 폐 조직. 또한 말초 혈액 또는 배설물에 존재할 수있는 테스트 에이전트의 일부 있기 때문에, 우리는 절차에 샘플의 그 유형을 통합. 이 간소화 된 워크 플로우는 개별 테스트 대신에 패널 기반의 병원체 및 독소 유전자 검출을 통해 효율적인 테스트를 가능하게함으로써 여러 판에서 실험을 실행에 비해 시간과 자원을 절약 할 수 있습니다. 여기에 입증 호흡 패널 (18) 분석은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 구멍을 통해 세중 인쇄했다. 검출 된 말 병원균 말 아데노 바이러스 1 및 2, 말 동맥염 바이러스, 말 비염 바이러스 A 및 B, 말 헤르페스 바이러스 (EHV) 유형 1 (4), 스트렙토 동등 포함. 송곳니 병원체는 개 호흡기 코로나 바이러스 (betacoronavirus), 개 디스템퍼 바이러스, 개 아데노 바이러스, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 보르 데 텔라 브론 키셉 및 마이코 플라즈마 cynos 포함되어 있습니다. 에이범용 인플루엔자는 분석과 내부 통제 (MS2의 RNA 파지)도 포함되었다.

<table><tbody><tr><td>Zap-OGlobin II lytic reagent</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Optional reagent for preparing blood samples.</td></tr><tr><td>Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.</td></tr><tr><td>2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific primer pool</td><td>IDT</td><td>custom order</td><td>Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.</td></tr><tr><td>Random primer mix</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Standard 96-well plate</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.</td></tr><tr><td>Amplification master mix (OpenArray master mix)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Clear adhesive seal</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Foil seal</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>384-well plate</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Accessories kit</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.</td></tr><tr><td>AccuFill tips</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>This is purchased with the amplification machine.</td></tr><tr><td>Primer design software (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>See manufacturer&#039;s instructions for detailed primer and probe specifications.</td></tr><tr><td>Image analysis program (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Spreadsheet program (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Tissue disruptor (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Conventional thermal cycler (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.</td></tr><tr><td>PCR plate spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0</td></tr></tbody></table>

high-throughput detection of respiratory pathogens in animal specimens by nanoscale pcr

나노 리터 규모의 실시간 PCR 분석은 여러 서로 반응을 조합의 전형적인 결점없이 단판에 병렬로 실행할 수 있도록하기 위해 공간 다중화를 사용한다. 우리가 고안 빠르게 급성 호흡기 질환 개와 말 일반적인 질병 인자의 존재를 식별하기 위해 본 원리에 기초 패널을 평가 하였다. 이 원고는 마이크로 리터 규모의 반응과 다른 절차에 초점을 맞추고, 샘플 준비, 증폭, 및 목표 병원체 서열 분석을위한 나노 진단 PCR 워크 플로우를 설명합니다. 제시된 호흡 패널에서 18 분석법은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 세중 년에 설립되었다. 범용 추출 사전 증폭 플로 여러 매트릭스 및 DNA 및 RNA 기반 병원균을 수용하도록 높은 처리량 샘플 제제에 대해 최적화되었다. 대표적인 데이터는 하나의 RNA 대상 (인플루엔자 A 행렬)와 하나의 DNA 대상 (말 헤르페스 바이러스에 대해 제시1). 신속하고 정확하게 병원균의 포괄적 증후군 기반 그룹을 테스트 할 수있는 능력은 효율성과 진단 테스트의 능률을 향상 급성 호흡기 질환의 진단과 관리를위한 유용한 도구입니다.

결과는 양성 대조군 및 일상적인 진단 시험에 제출 된 임상 샘플의 조합으로 대표 RNA 분석 (인플루엔자 매트릭스) 및 DNA 분석 (EHV-1)에 대한도 1 및도 2에 나타내었다. 이 일반적인 반응에 걸쳐 방출 된 형광 신호는 사이클 당 원료 형광 값을 나타내는도 1에 도시된다. 모든 상대 사이클 역치 (CT)의 값을 자동 증폭 시스템 소프트웨어에 의해 생성되었다. 배경 형광이 코네티컷 값을 계산하기 전에 형광 측정으로 통합보다는 적재 품질 평가를위한 별도의 측정을 사용한다. 각 대상에 대한 탐지의 분석 한계 (LOD)를 계산 컨트롤 풀에있는 코네티컷의 95 % 검출 레벨의 값을 더한 2 표준 편차의 전체 평균에 기반모든 대상. 복제의 적어도 95 %는 대표적인 분석법 양성인 최고 희석액 50 복제본이었다; 5 사본의 검출은 복제의 50 %에 성공했다. 어느 분석은 아래의 사본에서 검출되었다. RNA의 및 DNA 분석을위한 LOD를은 21.92과 20.05의 코네티컷의 값으로 계산 하였다. 이러한 값은 용의자 대 포지티브 (잠재적되지 반복)을보고 값에 대한 컷오프로 간주 하였다. 타겟의 분석 성능의 다른 측면은 세 가지 일 (도 2)에서 실행 풀링 양성 대조군의 희석액을 사용하여 평가 하였다. 대표 RNA 및 DNA 분석의 평균 효율은 101.1 %와 106.6 %였다; 모든 대상에 대한 전체 평균 효율은 101.3 %였다. 분석법도 좋은 선형성 (&gt; 0.98 R 2)를 가지고 있었다. 복제 내에서 변화는 관통 구멍 일반적으로 모두 임상 샘플 0.2의 표준 편차 내에하던D 제어합니다. 타겟 중간에 교차 반응은 관찰되지 않았다. 보조 파일의 최종 결과 워크 시트 (10) 임상 진단 샘플과 4 컨트롤의 대표 양적 결과를 보여줍니다. 임상 샘플은 샘플의 종류의 서브 세트는 통상적으로 비강 / 인두 면봉, 폐 조직, 분변 시료를 포함한 시험된다. 이 세트의 한 (말) 분변 샘플은 샘플 억제제의 존재를 나타내는 실패 MS2 내부 통제를 보여줍니다. 이것은 일반적으로 용출 샘플 및 / 또는 재 추출의 희석에 의해 관리됩니다. 여기의 경우와 같이, 음의 증폭 제어를 모든 타겟 제외해야하며, 음의 추출 제어는 내부 제어를 포함한다. 임상 설정에서, 샘플 betacoronavirus, 보르 데 텔라 브론 키셉, 개 디스템퍼 바이러스 A, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 인플루엔자에 대한 코네티컷 값을 생성에이. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> 도 1 증폭 플롯. 형광 표시는 RNA 분석 (A) 및 DNA 분석 (B)에 대한 증폭 사이클에 대해 도시된다. 삼각형이 코네티컷 값을 나타내는 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> 그림 2. 표준 곡선. 세 가지 다른 일 테스트에서 RNA 및 DNA 분석에서 표준 곡선은 긍정적 인 컨트롤을 사용하여 증폭의 선형성과 범위를 설명하기 위해 그려진다. 사이클 임계 값 (CT) 값 RNA (A) 또는 DNA의 카피 수의 로그 (10) (에 대해 플롯 <strong&gt; B) 표준입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> 증폭 플레이트와 타겟 위치 표 1. 회로도.이 플랫폼 나노 실시간 PCR 시험에 사용되는 판은 현미경 슬라이드 크기 및 관통 구멍 3,072 개의 관통 구멍 (64)의 48 개의 서브 어레이로 배열되고 개별 반응합니다. 한 부분 배열은 세중의 18 목표로, 여기에 표시됩니다. 각 샘플은 액체 핸들러에 의해 하나의 부분 배열에 추가됩니다. 플레이트 표면 장력을 통해 관통 구멍의 시약을 보유하는 친수성 및 소수성 화합물로 코팅된다. 스테인레스 칩 &quot;은 포토 리소그래피 패터닝되고 3072 마이크로 머신, 320 μm의 diamete의 직선 어레이를 형성하기 위해 습식 에칭. 다음과 같이 연구 대상 33 NL 각각 &quot;2 약어의 구멍은 : BCOR, 송곳니 호흡기 코로나 (betacoronavirus) BORD, 보르 데 텔라 브론 키셉 CAV, 개 아데노 바이러스를, CPIV, 개 파라 인플루엔자 바이러스, CPNV, 개 pneumovirus, DISTA / B, 송곳니 디스템퍼 바이러스 A와 B, EADV1 / 2, 말 아데노 바이러스 2, EAV, 말 동맥염 바이러스, EHV1 / 4, 말 헤르페스 바이러스 유형 1/4, ERVA / B, 말 비염 바이러스 A / B, IVM, 인플루엔자 매트릭스; MCYNOS, 마이코 플라즈마 cynos, MS2, 내부 통제 (MS2의 RNA 파지) SEQU, 연쇄상 구균 동등. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> 표 2 플레이트 전사지도. 384 웰 플레이트의 96 웰 플레이트에서 프리 앰프에 전송하는 고정 8- 채널 피펫을 사용하는 컬러 코딩 된 전사 플레이트 맵이 도시되어있다. 대안으로, 조정 가능한 피펫이 사용될 수있다. 동일한 절차가 시간에 관계없이 매번 수행<html> 유동 많은 샘플 플레이트에 있습니다. <img alt="추가 파일" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> 추가 파일. 요약 테이블에 서식 결과 두 매크로가 포함 된 매크로 사용 스프레드 시트 파일 (프로토콜에 설명 된대로) 제공됩니다. 매크로에 의해 생성되는 전형적인 결과 테이블 (최종 결과 아래) 파일에 포함된다. 두 매크로는 샘플 이름을 첫 번째 열의 (48 샘플까지)과 긍정적 인 결과에 그들을위한 각 대상에 대한 세 가지 코네티컷 값의 평균을 작성합니다; 증폭하지 않았다 대상이 테이블에 빈 표시 있습니다. 이것은 쉽게 종이 한 장에 인쇄하고 효율적 원시 데이터를 확인하기위한 기준으로 사용될 수있다. 최종 결과 탭에서 10 임상 샘플 및 4 컨트롤에 대한 대표적인 결과가 표시됩니다. 분석 이름에 대한 요약은 표 1의 전설에 나열되어 있습니다.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K 조회수.  Cornell University Animal Health Diagnostic Center.  나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다. 

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

생체공학

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

유전학

High-Performance Graphene-Modified Sensing Chip for SARS-CoV-2 Detection

This sensing prototype model involves the development of a reusable, twofold graphene oxide (GrO)-glazed double inter-digitated capacitive (DIDC) detecting chip for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 virus (SARS-CoV-2) specifically and rapidly. The fabricated DIDC comprises a Ti/Pt-containing glass substrate glazed with graphene oxide (GrO), which is further chemically modified with EDC-NHS to immobilize antibodies (Abs) hostile to SARS-CoV-2 based on the spike (S1) protein of the virus. The results of insightful investigations showed that GrO gave an ideal engineered surface for Ab immobilization and enhanced the capacitance to allow higher sensitivity and low sensing limits. These tunable elements helped accomplish a wide sensing range (1.0 mg/mL to 1.0 fg/mL), a minimum sensing limit of 1 fg/mL, high responsiveness and good linearity of 18.56 nF/g, and a fast reaction time of 3 s. Besides, in terms of developing financially viable point-of-care (POC) testing frameworks, the reusability of the GrO-DIDC biochip in this study is good. Significantly, the biochip is specific against blood-borne antigens and is stable for up to 10 days at 5 &#176;C. Due to its compactness, this scaled-down biosensor has the potential for POC diagnostics of COVID-19 infection. This system can also detect other severe viral diseases, although an approval step utilizing other virus examples is under development.

<meta charset="utf8"></head><body>SARS-CoV-2 검출을 위한 고성능 그래핀 수정 감지 칩

The present protocol describes the fabrication of low-cost biosensing prototypes based on useful nanosystems for accurately detecting viral proteins (at the Fg level). Such a tiny sensor platform allows for point-of-care applications that can be integrated with the Internet of Medical Things (IoMT) to meet telemedicine objectives.

SARS-CoV-2 검출을 위한 고성능 그래핀 수정 감지 칩

This sensing prototype model involves the development of a reusable, twofold graphene oxide (GrO)-glazed double inter-digitated capacitive (DIDC) ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

등온 증폭을 이용한 인간 호흡기 세균 감염 진단

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

저자 스포트라이트: Advancing Rapid detection of respiratory Pathogens Using Microfluidic Chip(미세유체 칩을 사용한 호흡기 병원체의 신속한 검출 발전) 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of A. baumannii is crucial for prompt treatment, effective infection control, and curbing antibiotic resistance. However, there is no suitable method for rapid and easy on-site detection of A. baumannii. The DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system offers a rapid, precise, and sensitive approach to A. baumannii detection by integrating the target-specific recognition capabilities of Cas12a with the isothermal amplification efficiency of Recombinase Polymerase Amplification (RPA). This protocol details the detection of A. baumannii using RPA combined with LbaCas12a endonuclease. The following steps are described in this article: extraction of DNA, selection of a specific DNA sequence, design of primer and CRISPR RNA (crRNA), construction of positive recombinant plasmid, setup of Cas12a-RPA assay, optimization of the RPA amplification system, visualization of the RPA-CRISPR/Cas12a assay using a fluorescence detection tool such as a real-time PCR instrument, and evaluation of sensitivity and specificity evaluation.

To facilitate the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii, we present a protocol that employs Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in conjunction with LbaCas12a endonuclease for identifying A. baumannii infections.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a 기반 시스템을 사용한 Acinetobacter Baumannii 감염의 빠르고 특이적 검출

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

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인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

SARS-CoV-2 검출을 위한 고성능 그래핀 수정 감지 칩

SARS-CoV-2 검출을 위한 고성능 그래핀 수정 감지 칩

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a 기반 시스템을 사용한 Acinetobacter Baumannii 감염의 빠르고 특이적 검출