이 방법은 마우스에 있는 초기 죽상 동맥 경화증의 병리생리학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 알도스테론이 성인 성장에서 죽상 경화증 플라크의 발달을 유도하는 효율성, 급속성입니다. 텍스트 지시만으로는 일부 기술 단계를 학습하기 어렵기 때문에 이 메서드의 시각적 데모는 매우 중요합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 직원 과학자 인 Caterina Mammi가 될 것입니다. 수술 용 장갑을 착용하고 미니 펌프 충전 튜브를 1 밀리리터 주사기에 부착하고 알도스테론 또는 차량 용액의 125 마이크로 리터로 튜브를적재합니다. 충전 튜브를 미니 펌프 상단의 구멍을 통해 삽입하여 더 이상 진행하지 않고 알도스테론 용액으로 펌프를 천천히 채울 수 있습니다.
펌프 체내에서 유체 비드가 솟아나면 펌프 충전을 중단하고 충전 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 미니 펌프의 본체에 흐름 레귤레이터를 삽입하여 레귤레이터가 펌프 본체에 단단히 시드되고 멸균 식염수 용액이 37도에서 최대 24 시간 동안 충전 된 펌프를 프라임하는 것을 주의하십시오. 펌프를 이식하려면 면도기를 사용하여 수술 부위에서 머리카락을 제거하고 노출된 피부를 70% 이소프로필 알코올에 담근 비짠 패드 소재로 소독합니다.
다음으로, 피부를 통해 0.8 ~ 1 센티미터 절개를하지만 기본 조직은 아니며 집게를 사용하여 절개를 엽니다. 반면트로카를 사용하여, 피부를 확산시켜 개각을 향해 절개에서 펌프용 포켓을 만들고, 마우스 앞쪽을 향하는 레귤레이터의 머리와 함께 펌프를 절개에 삽입하여 펌프를 주머니안으로 부드럽게 밀어 넣어 장력이나 스트레칭 없이 상처를 닫을 수 있는 충분한 피부가 있습니다. 펌프가 삽입되면 수술 와이어로 절개를 봉합하고 깨끗한 면봉을 사용하여 국소, 10 %의 포비도요오드 연고를 적용하십시오.
그런 다음 마우스가 전체 재조정까지 모니터링하여 온난화 단계에서 복구할 수 있도록 합니다. 적절한 실험 적 종점에서, 얼음 차가운 DPBS의 10 ~ 15 밀리리터와 중력 관류를 사용하여 왼쪽 심실을 통해 마우스를 perfuse, 중립 완충 액트의 10 %의 40 ~ 50 밀리리터 다음. 10-20분 후, 마우스를 스테레오 현미경 아래에 놓고 집게와 가위를 사용하여 과도한 periortic 및 심근 지방 조직을 제거합니다.
고정된 심장을 집게로 잡고 대동맥 아치의 접근에 수직으로 잘라, 가능한 한 밀접하게 심장에, 손상을 일으키지 않고. 심장이 대오르타에서 분리되면 메스를 사용하여 직선을 따라 횡적으로 자르고 오른쪽 및 왼쪽 아트리움의 하부 점에 합류하고 열린 심장의 상부를 최적의 절삭 온도 화합물로 채웁니다. 대동맥축이 있는 극저온 단면 플라스틱 몰드가 있는 절제된 조직을 직사각형 몰드의 기저부에 수직으로 배치하고 새로운 10월로 조직을 덮습니다.
조직이 제대로 지향되도록 금형을 백라이트한 다음, 10월이 흰색으로 변할 때 영하 80도 의 은호일로 전체 금형을 조심스럽게 포장하여 드라이 아이스의 금속 판에 금형을 배치합니다. 극저온 능력치가 섭씨 영하 20도에 도달하면 냉동 심장 블록을 표본 홀더에 장착하고 심실을 바깥쪽으로 향하게 하고 시편 홀더를 시편 지향 헤드에 삽입합니다. 표본 홀더의 방향을 블레이드에 수직으로 대동맥 뿌리로 블록을 절제하고 대동맥 뿌리에 도달할 때까지 블록을 잘라냅니다.
유리 슬라이드에 직렬 섹션을 수집하여 해부학 대동맥 뿌리 프로파일을 모니터링하여 세 개의 대동맥 밸브가 모두 나타날 때까지 모니터링합니다. 그런 다음 6~8마이크로미터 두께의 섹션을 수집하거나 세 개의 밸브 중 하나가 사라지거나 더 이상 손상되지 않습니다. 오일 레드 O 중립 지방 염색의 경우, 5 분 동안 37 %의 포름알데히드의 70 밀리리터로 섹션을 수정한 다음 수돗물로 철저히 세척하십시오.
2~3분 후, 물에 접근하여 10분 동안 0.3%의 오일 레드 O70 밀리리터로 섹션을 얼룩지게 합니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 10분 동안 세척하고, 마이어의 헤마톡시린 70밀리리터에서 1분 동안 세포를 염색하고, 1분간 의 수분 세척과 0.5%의 탄산리튬 70밀리리터에 1분 에머션을 더합니다. 그런 다음 1 분 동안 물에 세포를 씻고 가벼운 현미경으로 이미징을위한 수성 장착 매체로 섹션을 장착하십시오.
4주 간의 치료 후, 아폴리포단백질-E 녹아웃 마우스는 대조군 야생동물에 비해 지질 함량이 현저한 증가를 보였다. 더욱이, 알도스테론 치료는 맥-3 염색에 의해 입증된 바와 같이 녹아웃 동물의 대식세포 함량을 증가시키고, 차량 처리마우스에 비해 이들 동물에서 더 염증이 있는 죽상 경화성 플라크를 나타낸다. 그러나, 알도스테론 치료는 죽상 경화성 플라크의 콜라겐 함량을 변경하지 않습니다.
이 절차를 시도하는 동안,이 방법은 동맥 경화증을 개발하는 경향이 아포이포단백질 마우스에 대해서만 입증된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 다른 동물 모델에적용할 수 없습니다. 이 절차에 따라, 적외선 염색과 같은 다른 방법은 다른 대동맥 부위의 동맥 경화증을 특성화하고 죽상 경화성 부담의 총을 정량화하기 위해 수행 될 수있다.
개발 후, 이 기술은 동맥 경화증 의 필드에 있는 연구원을 위한 통로를 포장했습니다 동맥 경화증의 초기 기계장치를 탐구하는, 염증 과 내피 기능 기능 과 같은. 이소판과 포르말린과 같은 휘발성 화합물과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 안전 실험실 페이스 마스크를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
