이 작품은 부분적으로 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 (HL105114, HL088391, NS066652 및 YEC에 HL068878), 미국 심장 협회 (JZ에 국가 과학자 개발 0835237N). YEC는 재정적 미시간 의료 센터의 대학 (UMMC)에서 심장 혈관 의학 부여 프레드릭 Huetwell 교수로 지원됩니다. 이 작품은 번역 상 과학 및 UMMC에서 치료학 (CAMTraST)의 고급 모델에 대한 센터에서 지원하는 핵심 서비스를 이용했다.

모든 동물의 유지 보수, 관리 및 사용 절차는 미시간 대학의 동물의 사용 및 관리에 대한 검토 및 대학위원회에 의해 승인되었다. 1. ZFN 디자인하고 <ol><li> 제조 업체에 관심의 유전자 (예를 들어 토끼 ApoCIII)의 게놈 서열 정보를 제공합니다. ZFN 점수에 따라 실험을 위해 ZFN 세트 (들)을 선택합니다. </li></ol> 2. 토끼 배아 컬렉션 <ol><li> Superovulate 성적 (6-18개월) 성숙 뉴질랜드 화이트 (NZW) 처음 두 주사, 다음 두 주사 6 밀리그램 5 밀리그램 3 밀리그램의 복용량과 난포 자극 호르몬 (FSH)의 피하 (SC) 주사 회 / 일까지 여성 토끼 지난 주사에 대한. </li><li> 배란을 유도하는 최초의 난포 자극 호르몬 주사 후 72 시간에서 200 IU hCG의 단일 정맥 주사 (IV) 주사를 관리. 바로 hCG의 주입 후 남성 토끼 교배 여성 메이트. </li><li> Euthani&#39;제 펜 토바 비탈 나트륨과 교배 기증자 토끼 (150 ㎎ / kg, IV) 16 ~ 18 시간 포스트 인공 수정 (PSI)에. </li><li> 조심스럽게 전체 난관과 난소 구조를 수집하여 난관 ampullae을 복구 할 수 있습니다. </li><li> HEPES 10 ㎖ 조작 배지로 각각 수란관 플​​러시 TCM 199 수란관의 자궁 단부로부터 매체를 주입하여, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 버퍼링. 페트리 접시에 난관의 난소 엔드 오프닝에서 플러시 매체를 수집합니다. </li><li> 관찰하고, 플러시 매체에 복구 된 배아를 식별하는 조작 매체에 배아를 세 번 씻어, 공기 38.5 ° C에서 조작 매체에 보관하고, 수정의 발생에 대한 실체 현미경을 관찰합니다. 전핵 단계의 배아에 미세 주입을위한 준비 19 ~ 21 시간 PSI </li></ol> 3. ZFN의 mRNA의 준비 <ol><li> RNase가없는 0.1X TE (1 mM 트리스로-C1 pH의 재 부상하기 전에 생성 된 mRNA의 정화8.0, 0.1 mM의 EDTA). 농도를 측정하고 사용할 때까지 -80 ° C에서의 mRNA를 저장합니다. </li><li> 10 ㎕의 작은 유리 병에 ZFN 쌍 (산도 7.5에서 1 mMTris로-C1, 0.1 mM의 EDTA에 4-10 NG / μL), 나누어지는 인코딩의 mRNA를 준비합니다. 사용 준비가 될 때까지 -80 º C에서 보관하십시오. 미세 주입하기 전에 RNA 유리 병 (들)을 해동하고, 얼음에 보관. </li></ol> 4. 배아 미세 주입 <ol><li> 제거 미디어 챔버가 1 잘 챔버 슬라이드 조작 매체의 5 μL 드롭을 배치하여 미세 주입 플랫폼을 준비합니다. 가열 현미경 단계에 미네랄 오일과 장소와 매체 드롭을 커버. </li><li> 미세 조작기의 홀더 팔에 들고 피펫 (120 μm의 직경)를 배치하고 조작 매체의 드롭에 위치. </li><li> 마이크로 피펫 끌어 당기는 장치에 붕규산 유리 모세관 튜브를 가열 당겨 주입 마이크로 피펫을 제작합니다. 주입 피펫으로 주입되는 mRNA를 넣습니다. </li><li>microinjector에 연결되어있는 압축 공기 공급 장치의 전원을 켭니다. </li><li> 조작 매체의 드롭에 미세 조작기와 위치를에 넣어 주입 홀더에 주입 피펫을 놓습니다. </li><li> 설치 다음과 같은 제안 매개 변수를 사용하여 microinjector : holdP = 2 PSI, InjP = 20 PSI, ClearP = 60 PSI, 1-5 (PL)의 주입 부피가 발생합니다 Injtime = 1 초. </li><li> 부드럽게 고정 용 피펫에 대해 그것을 감청하여 주입 피펫의 팁을 엽니 다. </li><li> 플랫폼의 미세 조작 드롭에 배아 (30 ~ 50)를 전송합니다. 배아를 캡처하고 주사 바늘, 배아 및 x-축을 따라 홀딩 피펫을 정렬하는 홀딩 피펫을 사용한다. </li><li> 400 배 배율에서 배아를 주입 피펫을 진행. 핵 않도록주의하십시오. 세포막을 관통되면, 눌러 발 페달을 주입한다. 주사 후, 바늘을 철회 배아를 놓습니다. 나머지 그들에 대한 과정을 반복합니다bryos. </li><li> 비 필수 아미노산 (NEAA), 필수 아미노산 (EAA), 1 ㎜의 L-글루타민, 0.4 mM의 피루브산 나트륨, 10 %로 보충 얼의 균형 소금 용액 (EBSS)로 구성 배아 배양액에 주입 배아 세 번 씻으 FBS. </li><li> 그들은 수술 동기화 된받는 여성 NZW 토끼 (단계 5.1 참조)의 난관에 전송하기 전에 1 ~ 2 시간 동안 공기 중 5 % CO 2에서 38.5 ° C에서 배아를 품어. 그들은 체외 유효성 검사 또는 분석에 사용되기 전에 다른 방법으로, 문화 배아들은 배반포 단계에 도달 할 때까지. </li></ol> 5. 배아 전송 <ol><li> 약 무게 건강에 5~12개월 된 여성 NZW 토끼를 선택합니다. 받는 사람 동물로 4.0-5.0 kg. 생식샘 자극 (단계 2.2 참조) 공여체 동물 발 행 hCG의 주입의 것과 동일한 시점에서 수신자에게 호르몬 (GnRH에) 주입 근육 내 (IM, 50의 mcg / ㎖, 0.3 ㎖ / 동물)을 떼면 관리. </리&gt; <li> 미세 주입을 완료 한 후, 배아 전송 (성선 자극 호르몬 방출 호르몬 주사 후 일반적으로 16 ~ 24 시간)에 대한받는 사람 토끼를 준비합니다. 10 ~ 40 ㎎ / kg 케타민 (IM)과 토끼를 마취 및 / 또는 증발 이소 플루 란 (2-4 %) 흡입에 의한. 멸균 안과 연고의 응용 프로그램에서 과도한 건조 토끼의 눈을 보호합니다. 그것은 즉, 완전히 의식이 될 때까지 동물을 관찰한다. 발 패드는 적절한 마취의 표시입니다 페달 반사의 부족을 확인하는 데 사용됩니다 압박, 페달 반사에 응답하지 않습니다. </li><li> 토끼의 복부를 면도, 소독액 다음, 살균 스크럽, 세척 및 멸균 거즈 스폰지와 면도 영역을 닦습니다. </li><li> 무균 조건 하에서 수술을 시행, 수술 전반에 걸쳐받는 사람 토끼마다 약 15 분의 생체 신호를 기록한다. </li><li> 배아의 사용 가능한 수에 따라받는 사람의 동물에 10-25 배아를 전송합니다. </li><li> 끝에수술 절차는 코팅 흡수성 봉합사와 근육층을 닫는다. 흡수성 봉합사를 사용하여 봉합 subcuticular 하나 또는 nonabsorable 봉합 (예를 들어, 모노 필라멘트 나일론 또는 유사)를 사용하여 간단한 중단 피부 봉합사로 피부를 봉합. </li><li> 동물을 따뜻하게 유지 및 흉골 드러 누움이 달성 될 때까지 모니터링합니다. </li><li> 매일 동물을 모니터링합니다. 동물 돌보는 수의사의 지시를 따릅니다. 통증을 완화 및 / 또는 수의사에 의해 필요한 결정하면 발열 매일 게시 작업을 줄이기 위해 멜 록시 캄 (SC 1.0 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 대략 10-14 일 게시 작업에 nonabsorable 피부 봉합사를 제거합니다. </li></ol> 6. ZFN 유도 유전자 중단의 검출 <ol><li> 체외 검증의 경우, 체외 배양 된 배아에 유전자형을 수행합니다. 5 μL의 NP40 용액 (1 % NP40 + 1 UG에 morula / 배반포 단계로 개발 / ㎖의 Taq 버퍼에 테 K를 Lyse 개별 배아) 55 ° C에서 0.5 시간, 95 ℃에서 10 분 동안 </li><li> 자손의 유전자형를 들어, 신생아 키트에서 귀 피부 샘플을 수집 게놈 DNA를 추출하고 PCR 시퀀싱을위한 템플릿으로 사용합니다. 출혈을 멈추게과 불편을 줄이기 위해 수집 한 후 샘플링 영역에 KWIK 스톱을 적용합니다. </li><li> LA-DNA 형성 촉매 및 ZFN 대상 사이트의 상류에 위치 (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;)와 (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3 하류&#39;)하는 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을위한 템플릿으로 단계 6.2 또는 6.3에서 용해를 사용 . </li><li> PCR 제품을 정화하고 시퀀싱 프라이머 (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;)로 시퀀스. </li><li> 타겟팅 사이트 주위의 시퀀스 다이어그램에서 두 곡선을 찾아 돌연변이 샘플을 확인합니다. &quot;긍정적&quot;으로 두 배 곡선에 그들 레이블을 지정합니다. </li><li> , TA 클로닝 벡터에 &quot;긍정적 인&quot;PCR 제품을 복제 10-20 클론, 순서 삽입을 선택하고, T 주위에 돌연변이를 확인argeting 사이트. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

본 연구에서는 다섯 ApoCIII KO 토끼는 ZFN 기술을 사용하여 생성되었다. 이전 GTT 토끼의 생산만을보고는 또한 ZFN 기술 (18)을 사용했다. 본 작품은 ZFN 효과적으로 토끼의 유전자를 대상으로 유용하다는 것을 확인했다. 본 연구에서, 토끼의 이전 ZFN 보고서 (30.8 %, 52분의 16) (18)에 필적하고, 그보고 형질 전환 속도 (긍정적 키트 / 총 출생) is23.8 % (5 / 21), 얼룩말 물고기 19, 쥐 20, 쥐 (21)와 돼지 (17) 등 다른 동물 종에 ZFN을 사용. 이 비율은 5-20 %의 범위에 빠질 많은 종래의 트랜스 제닉 토끼 생산 연구의 속도보다 더 높은 사실이다. 예를 들어, 기존의 DNA의 미세 주입을 통해 제품 ApoCIII 형질 전환 토끼하기위한 노력의 일환으로, 종소리 등. (5.6 %) 22 태어난 새끼 54 개 만점에 3 개 양의 설립자를 얻을. 이전의 연구 결과와 일치, 대상 사이트의 돌연변이 (다섯 KO 토끼에서 1-21까지) 기지의 다른 번호로 구성된 삭제 또는 삽입 등의 변수입니다. 설립자 동물의 특정 서열 정보를 바탕으로, 그것은 (Δ1, +1, +1, 또는 Δ20 돌연변이를 함유하는, 즉.) ApoCIII의 기능 손실이있을 것입니다 적어도 네 개의 예측된다. 이 돌연변이는 일곱 아미노산의 유일한 원인이 손실을 예측하지만, 독서 프레임 변화되지 않는 동물 R-16 Δ21와 함께, 기능 손실이 표시되지 않을 수 있습니다. 궁극적으로, 표현형 분석이 설립자 동물이 진정 ApoCIII 기능의 손실을 표시 여부를 확인하기 위해 필요합니다. 본 연구에서 생성 된 다섯 KO 토끼 중 어느 것도 biallelic 수정 사항을 포함하지 않습니다. 흥미롭게도,이 또한 이전 ZFN 토끼 보고서의 경우입니다. 대조적으로, ZFNs α1 ,3-갈 락토을 타겟팅은 돼지에 적용된세포, 23 어 내고 biallelic 한 단계를 만드는 돌연변이의 약 3 분의 1로, 7~46% 원거리 하나의 대립 유전자를 표적으로의 주파수. TALEN 돼지는 섬유 아세포에 도포 할 때와 일관되게, biallelic 변형은 전체 포지티브 클론 (14)의 약 15-40%에서 발견되었다. 또한, 본 연구에서 biallelic KO 토끼를 생성하는 오류가 표적 핵산 분해 효소 유전자를 기반으로 같은 용량의 종 차이 (즉, 토끼 대 돼지)를 나타낼 수있을 수 있습니다. 그것은,이 프로젝트에서 생성 KO 토끼의 수는 상대적으로 작기 때문에이 단순히이라고하지만, 가능성이 높습니다. 우리는 ZFN은 ZFN 기반 GTT 토끼 생산의 또 다른 잠재적 인 이점으로 간주되어야 토끼 bialleic 돌연변이를 생성 할 수 있다고 생각합니다. 추가 실험은 토끼 ZFN 같은 용량을 확인하기 위해 필요합니다. 결론적으로, 본 연구는 보여주는 Z접근을 대상으로 FN 기반의 유전자는 KO 토끼를 생산하는 효과가 있습니다. 특히, 우리는 23.8 %의 만족 형질 전환 속도와 다섯 ApoCIII KO 토끼를 생성합니다. 이 동물은 해당 마우스 모델보다 인간의 지질 대사에이 단백질의 역할에 대한보다 의미있는 정보를 제공 할 것으로 생각된다. 우리는 ZFN 기반 유전자 타겟팅뿐만 아니라, TALEN 및 RGEN 등의 핵산 분해 효소 기반의 기술을 예측, nonmurine 동물에 상당히 다양한 인간의 질병을 연구하는 새로운 동물 모델의 개발을 촉진 할 것이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. ZFN 기술을 사용하여 녹아웃 토끼의 생산 흐름도. ZFN 기술을 사용하여 KO 토끼의 생산은 그 유전자의 선택과 함께 시작합니다. 시퀀스 정보는 ZFN 세트 설계되어 제공되고, 피사체된다ected 효모 자체 유효성 검사를 기반으로. 체크 포인트 (CP) 1 (CP-1)에서 자체 검증 (내부 양성 대조군의 50 % 이상)을 통과 세트 만이 선택을 사용자에게 제공됩니다. 제공된 세트 CP-1을 통과하지 않으면, 추가적인 시퀀스 효과적인 ZFN 세트를 설계를 위해 필요할 수도있다. 체외 배아 검증 선택한 ZFN 세트가 선택한 사이트 (CP-2)에서 돌연변이를 유도 할 수 있도록하기 위해옵니다. 이 (시험관 배아&gt; = 10 %의 돌연변이 비율) CP-2를 통과하면 ZFN 세트 (들) 만 사용됩니다. CP-2의 실패는 ZFN 세트의 재 설계가 필요합니다. 배아 기증자 준비하고 전핵 단계의 배아는 검증 ZFN 세트 미세 주입됩니다. 이러한 미세 주입 배아는 동기화 배아받는 사람에게 전송됩니다. 한 달 임신 기간 후에, 신생아 (CP-3) 유전자형됩니다. 신생아 중에 긍정적 없으면 추가적인 미세 주입이 수행 될 것이다. 그것은 N 가정, CP-2 프로젝트의 시작부터 2-3개월 소요과정에서 입출력 오류가 발생했습니다. 이 CP-3 CP-2에서 추가 2~3개월 걸립니다. 그러므로 ZFN 기술을 사용하여 4 ~ 6 개월의 시간 프레임에서 녹아웃 토끼를 생성 할 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. ZFN 디자인. 세 ZFN 세트 (2 세트 1, 3)은 엑손 1 또는 토끼 ApoCIII (A)의 엑손 2에 다른 시퀀스를 대상으로 설계되었습니다. 세 세트 ZFN 활동을 결정하는 효모 MEL-1 리포터 분석법을 행 하였다. 제조의 프로토콜에 따르면, 제조의 내부 양성 대조군의&gt; 50 %를 보여 ZFNs 활동은 시험 관내 및 생체 게놈 편집 실험에 유용한 것으로 간주된다.ZFN 활동 따라서 (1) 본 연구에서 선택한 설정, 설정 1 224.2 %, 세트 2 196.9 % 및 3 종 세트 (B)에 대한 177.8 %였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> ZFN의 그림 3. 시험관 배아 검증. 세트 1의 mRNA의 (5 ㎍ / ㎖)을 35 전핵 단계 토끼 배아 (A)의 세포질에 미세 주입 하였다. 마이크로 인젝션 처리 (N = 31)없이 플러시 배아는 대조군으로 사용 하였다. BL 개발 속도가 대조군에서 77.4 %였다. 미세 주입 군에서는 BL 비율은 51.4 %였다. PCR 시퀀싱을 실시 16 BLS의, 8 (50 %)가 긍정적으로 확인하고, 설정 1을 나타내는 것은 타지에서 돌연변이를 유도 할 수있는 효과적인 ZFN 세트입니다팅 사이트 (B, apoc3wt.seq, 블랙 박스) 토끼 ApoCIII의. 돌연변이를 함유 BLS는 BL # 1 에이 팍-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 그리고 17의 (B, 붉은 밑줄). 나머지 BLS는 (# 1 에이 팍-2, 6, 9, 10, 12, 14, 16)는 표적 사이트에 돌연변이가 없습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> 그림 4. ApoCIII KO 토끼의 제조. ZFN 세트 1의 mRNA와 미세 주입 한 백 사십 오 배아는 7 의사 임신받는 사람 토끼 (A)에 전달했다. ZFN의 미세 주입하지 않고 갓 플러시 배아 (N = 75)가 수신자에게 전송 된 (N = 6) 대조군으로. 실험 그룹의 총 기간 키트 / 전체 배아로 계산 기간의 비율은 14입니다0.5 % (145분의 21), 속도가 대조군 (75분의 22) 29.3 % 인 ​​반면, (A). 미세 주입 군, 오 (R1, R9, R11, R12 및 R16)에서 태어나 21 키트 중 PCR 시퀀싱 (B) 후 긍정적 KO 키트를 확인 하였다. 타겟팅 사이트에서 삽입이나 삭제는 두 개의 삽입 (R9 및 R11 모두 +1)와 세 개의 삭제 (각각 Δ1, Δ (20), R1, R12와 R16에 대한 Δ 21) 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

아포 지단백 (아포) C-III (ApoCIII)은 간과 소장에서 주로 합성되는 작은 O-당화 분비 단백질이다. 그것은, 플라즈마 카이로 미크론 (CM)의 표면에 초 저밀도 지단백질 (VLDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)을 상주. ApoCIII 심혈관 질환 1의 위험 인자로 인식되고있다. ApoCIII의 유전 적 결함을 가진 환자는 낮은 혈장 중성 지방 (TG) 수치 감소 무증상 관상 동맥 죽상 경화증 2,3있다. 상승 된 혈장 ApoCIII 레벨은, 반면에, 종종 인슐린 내성, 비만, 고 중성 지방 혈증 및 (HTG) 4,5과 상관. 유전자 녹아웃 (KO)는 유전자의 기능을 연구 할 수있는 강력한 수단이다. 인간의 돌연변이 집단의 관찰과 일치, 생쥐의 ApoCIII 유전자의 녹아웃은 플라즈마 TG의 감소와 식후 HTG 6으로부터 보호되었다. ApoCIII의 이러한 긍정적 인 역할 등장아포과 ApoCIII 모두의 결핍 생쥐도 식후 고지혈증 7에서 보호 될 때, 아포 지질 단백질 E (아포) 독립적이어야합니다. 이러한 ApoCIII KO 마우스 모델은 인간의 ApoCIII의 가능한 기능에 대한 귀중한 정보를 제공하고 있지만, 그것은 쥐의 지방 단백질의 신진 대사가 여러 측면에서 인간의 그것과 다르다는 것을 알 수있다. 예를 들어, 마우스 혈장 콜레 스테 릴 에스테르 전달 단백질 (CETP), VLDL, LDL의 수송에 관련된 주요 효소 및 HDL 8 부족하다. 따라서, 상기 생체 ApoCIII의 생리적 역할을 이해하기 위하여 적절한 동물 모델을 개발하는 것이 필요하다. 토끼는 클래식 모델 동물 종 9-11입니다. 그것은 짧은 임신 기간 (30-31일), 대형 쓰레기의 크기 (4-12/litter)가 실내 시설에서 편리하게 수납 할 수 있습니다. 마우스에 비해, 토끼 인간 10 계통 발생 학적으로 더 가깝다. 중요한 것은, 같은 HU남자는하지만, 마우스와 달리, 토끼는 LDL이 풍부한 포유류 및 CETP (10, 12)의 상당한 수준을 가지고. 게다가, 그들은 인간 아테롬 13에서 본 것과 유사한 병변 콜레스테롤이 풍부한식이 유도 아테롬에 민감하다. 이러한 이유로, 우리는 ApoCIII KO 토끼는 인간의 지질 대사 및 동맥 경화에 ApoCIIIplay의 역할을 조사하기 위해 자신의 마우스에 비해 더 나은 모델이 될 수 있다는 가설을 세웠다. 유전자의 생산 (GTT) 토끼가 도전을했습니다 유전자를 대상으로. 이는 배아 줄기 세포 (ESC)를 전송하는 생식 세포의 부족, 그리고 토끼의 체세포 핵 이식 (SCNT)의 매우 낮은 효율에 주로 기인한다. 및 SCNT가 성공적으로 돼지, 양, 소,하지만 토끼 등의 생식 전송 줄이고 ESCs를, 부족한 종에 KO 동물을 생성하기 위해 적용된 반면 ESC는 GTT 마우스를 생성하는 기본 도구입니다. 최근 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN), 트란scription 활성제 - 드 이펙터 클레아 제 (TALEN) (14), 및 RNA 유도 효소 (RGEN) (15)는 게놈 편집을위한 강력한 수단을 나왔다. 그래서 &quot;분자 가위&quot;라는이 클레아는 ​​대상 유전자의 기능 KO로 이어질 나있는 게놈의 특정 현장에서 DNA 시퀀스를 통합 할 수있는 게놈에있는 이중 가닥 휴식 (DSB)를 생성하는 효율적인 종 (16)의 수. 2011 년, ZFN 기술을 적응 첫번째의 사이에서, 우리는 SCNT 17 일이 세포를 사용한 후이 방법을 성공적으로 생성 된 PPARγ KO 돼지를 통해 페 록시 솜 증식 자 활성화 수용체 감마 (PPARγ) KO의 돼지 세포를 생성합니다. 같은 해, 효율적인 면역 글로불린 유전자의 중단도 ZFN을 사용하여 토끼를 대상으로 교체가 18보고되었다. (그림 1 참조 ZFN 세트를 사용하여, PCR 시퀀싱에 의해 확인 된 본 연구에서는 다섯 ApoCIII KO 토끼는 생성 된 </strong&gt;. 플로우 차트 그림). 이 동물은 지질 대사에 ApoCIII의 역할을 연구하는 새로운 자원입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

아포지 단백질 (아포) C-III (ApoCIII)는 플라즈마 카이로 미크론 (CM)의 표면에 초 저밀도 지단백질 (VLDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)을 상주. 그것은 인식 된 심장 혈관 질환에 대한 플라즈마 ApoCIII의 constitutea 위험 인자 (CVD)의 높은 수준. 상승 된 혈장 ApoCIII 레벨은 종종 인슐린 내성, 비만, 고 중성 지방 혈증 및과 상관. 그러나,이 마우스에서 지방 단백질의 대사는 많은 측면에서 인간의 다른 지적되고 ApoCIIIin 지질 대사와 CVD의 역할에 대한 귀중한 지식 ApoCIII 녹아웃 (KO) 마우스 등의 유전자 변형 마우스 모델에서 얻은되었습니다. 그것은 지금 상승 플라즈마 ApoCIII 직접 동맥 경화 여부까지 알 수 없습니다. 우리는 토끼는 인간의 지질 대사 및 동맥 경화증을 공부 reasonablemodelfor 역할을 할 수있는 가설에 기초하여 본 연구에서 ApoCIII KO 토끼를 개발했다. 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN) 세트 대상 토끼 AP 통신oCIIIgene 전에 배아 미세 주입에 체외 검증을 실시 하였다. mRNA의 35 토끼 전핵 단계의 배아의 세포질에 주입하고, 배반포 상태의 변이 속도를 평가 하였다. 분석 하였다 십육 배반포, 표적 부위에서 만족 50 % 돌연변이율 (8 / 16)가 생체 내 실험을위한 한 세트의 이용을 지원하고, 달성 하였다. 다음으로, 우리는 세트 1의 mRNA 145 배아를 미세 주입하고, 7받는 사람 토끼 이러한 배아를 전송. 30 일 임신 후 21 키트는 다섯이 PCR 염기 서열 분석 후 ApoCIII KO 토끼로 확인되었다 밖으로있는, 태어났다. KO 동물 속도는 (# KO 키트 / 전체 출생) 23.8 %였다. 전체적인 생산 효율 (5 kits/145 배아 전사) 6.8 %이다. 본 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다. 이 ApoCIII KO 토끼는 지질 대사에 ApoCIII의 역할을 연구하는 새로운 자원입니다.

ZFN 쌍의 체외 검증에 열 여섯 ZFN 쌍은 초기 설계되었습니다. 세트 1의 표적으로 중단 시퀀스는 토끼 ApoCIII의 엑손 2 (그림 2A) 부근에 자리 잡고 있습니다. 세 쌍 (세트 1, 2, 3,도 2a)이 선택과 ZFN 활동 (도 2B)를 결정하기 위하여 효모 MEL-1 리포터 분석법을 행 하였다. 1 세트 2 (196.9 %)와 3 세트 (177.8 %)보다 높고 선택의 임계 값 (내부 양성 대조군의 예 : 50 %)보다 훨씬 높은 224.2 %의 ZFN 점수를 가지고 설정합니다. 따라서 세트 1은 체외 검증 실험을 위해 선정되었다. 특히 세트는 내부 검증 기준에 따라 체외 배아 유효성 검사를 통과하는 10 % 이상의 배아에 긍정적 인 요금 발생합니다. 세트 1의 mRNA의 (5 ㎍ / ㎖)을 35 전핵 단계 토끼 배아 (그림 3A &lt;의 세포질에 미세 주입 하였다/ strong&gt;을). 마이크로 인젝션 처리 (N = 31)없이 플러시 배아는 대조군으로 사용 하였다. 미세 주입 군의 여덟 배아 십육 시퀀싱 된 건, D5에 BL 단계로 발전하고, 팔은 (BL # 1 에이 팍-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17,도 3b, 적색 밑줄) 표시 변이 타겟팅 사이트 (블랙 박스, 그림 2B, 윗줄, apoC3wt.seq)의 순서. 미세 주입 군 (51.4 %)의 BL 속도는 미세 주입 배아의 발달이 약간 저하 능력을 나타내는 대조군 (77.4 %)보다 낮다. 미세 주입 배아 긍정적 돌연변이율이 선택 임계 값보다 훨씬 높은 50.0 % (8 / 16), (즉, 10 %)이다. 이러한 결과는 세트 1은 토끼 ApoCIII의 타겟팅 사이트에서 돌연변이를 유도 할 수있는 효과적인 ZFN 세트입니다 것으로 나타났습니다. 따라서 세트 1은 ApoCIII KO 토끼의 생체 내 생산을 위해 선택되었다. ApoCIII KO 토끼의 생산 mRNA의 오F ZFN 세트 1은 토끼 전핵 단계의 배아의 세포질에 미세 주입하고, 7 의사 임신받는 사람 토끼 (그림 4A)에 145 미세 주입 배아를 전송했다. ZFN의 미세 주입하지 않고 갓 플러시 배아 (N = 75)가 수신자에게 전송 된 (N = 6) 대조군으로. 임신 후 30 일 이후, 21 키트는 미세 주입 그룹에서 태어났다. PCR 연속 긍정적 KO 키트 (그림 4B)로 오 (apoC3-R1, R9, R11, R12 및 R16)을 확인했다. 속도가 대조군 (75분의 22) 29.3 % 인 반면 전체 용어 키트 / 전체 배아로서 산출 기간 비율은 14.5 % (145분의 21)이다. 총 KO 키트 / 총 기간으로 계산 KO 율은 23.8 % (5 / 21)입니다. 하나 KO 키트 (APOC-R16)는 5 일, 산후 (20.0 %, 2 / 10)를 사망했다. 타겟팅 사이트 indelsat 두 삽입과 세 개의 삭제를 포함, 그들은 토끼 각각 # R1, R9, R11, R12, 및 R16 (그림 4B)에 대해,, +1, +1, Δ20 및 Δ21을 areΔ1. 양성이전 17 설명한대로 oinformatics 분석, 1 순서를 설정하는 7 개 이하의 불일치와 오프 대상 가능성 ZFN을 식별하는 데 사용되었다. 하나만 14 번 염색체 상에 위치 가능한 오프 목표 부위를 예측은 7 일치 BPS로 확인되었다. PCR 분석은 창업자의 동물 중 하나에 오프 대상 이벤트를 감지하지 않습니다.

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Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

유전자 타겟팅 도구의 최근 발전은 녹아웃의 생산 (KO) 토끼가 가능하게한다. 본 연구에서는 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)를 사용하여 다섯 아포 지질 단백질 (아포) C-III KO 토끼를 생성합니다. 이 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다.

징크 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여 아포 지단백 C-III 녹아웃 토끼의 생산

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K 조회수.  University of Michigan Medical Center.  유전자 타겟팅 도구의 최근 발전은 녹아웃의 생산 (KO) 토끼가 가능하게한다. 본 연구에서는 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)를 사용하여 다섯 아포 지질 단백질 (아포) C-III KO 토끼를 생성합니다. 이 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다. 

비디오: Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

연구

의학

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. To date, there is evidence to support a role for circulating aldosterone as a risk factor for the development of cardiovascular disease. Transgenic mouse models have been generated to study cellular and molecular processes leading to atherosclerosis. In this manuscript, we describe a protocol that takes advantage of continuous infusion of aldosterone in ApoE-/- mice and generates atherosclerotic plaques in the aortic root after 4 weeks of treatment. We, therefore, illustrate a method for quantification and characterization of atherosclerotic lesions at the aortic root level. The added value of aldosterone infusion is represented by the generation of atherosclerotic lesions rich in lipid and inflammatory cells after 4 weeks of treatment. We describe in detail the staining procedures to quantify lipid and macrophage content within the plaque. Notably, in this protocol, we perform heart tissue-embedding in OCT in order to preserve the antigenicity of cardiac tissue and facilitate detectability of antigens of interest. Analysis of the plaque phenotype represents a valid approach to study the pathophysiology of atherosclerosis development and to identify novel pharmacological targets for the development of anti-atherogenic drugs.

We describe a protocol to induce atherosclerosis in the aortic root of ApoE-/- mice fed with an atherogenic diet, through a continuous release of aldosterone. Methods to characterize plaque composition are also described.

Apolipoprotein E-불충분 한 쥐에 Mineralocorticoid 수용 체의 활성화를 통해 동맥 경 화성 플 라크의 유도

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

당뇨병 토끼에서의 뒷 사지의 전 임상 모델

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

토끼의 완전한 다크레오아데네절제술을 이용한 중증 안구건조증 모델 구축

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical characteristics, which is further complicated in the case of the newborn. Of the different methods of advanced airway management, endotracheal intubation is less aggressive than tracheostomy, and is more feasible than supraglottic management given the lack of supraglottic devices of such a small size. As direct glottis visualization is very difficult in animals this size, this blind intubation model is presented as an effective alternative, especially for experiments requiring prolonged anesthesia. Using this method, we performed blind intubations with a 90% success rate.

We describe a technique of endotracheal intubation in newborn rabbits after esophageal catheterization with a gastric tube.

신생아 토끼의 맹인 내트라큐어 삽관

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease and arrhythmias in people with epilepsy (i.e., epileptic heart.) Additionally, cardiac and autonomic disturbances have been reported surrounding seizures. 1:1,000 epilepsy patients/year die of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). The mechanisms for SUDEP remain incompletely understood. Electroencephalograms (EEG) and electrocardiograms (ECG) are two techniques routinely used in the clinical setting to detect and study the substrates/triggers for seizures and arrhythmias. While many studies and descriptions of this methodology are in rodents, their cardiac electrical activity differs significantly from humans. This article provides a description of a non-invasive method for recording simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography in conscious rabbits. As cardiac electrical function is similar in rabbits and humans, rabbits provide an excellent model of translational diagnostic and therapeutic studies. In addition to outlining the methodology for data acquisition, we discuss the analytical approaches for examining neuro-cardiac electrical function and pathology in rabbits. This includes arrhythmia detection, spectral analysis of EEG and a seizure scale developed for restrained rabbits.

Using simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography, we developed a methodology to evaluate the susceptibility of rabbit models to develop provoked arrhythmias and seizures. This novel recording system establishes a platform to test the efficacy and safety of therapeutics and can capture the complex cascade of multi-system events that culminate in sudden death.

의식 억제 토끼에서 발작, 부정맥 및 무호흡증의 식별을위한 다중 시스템 모니터링

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D motion tracking technology to measure the kinematic parameters of the joints of fingers during acupuncture manipulation (AM) and establish three technical indicators "amplitude, velocity and time". This method can reflect the operation characteristics of AM and provide quantitative parameters along three axes of multiple finger joints. The current evidence shows that the method has great potential for future applications such as the study of the dose-effect relationship of acupuncture, teaching, and learning of AM, and the measurement and preservation of famous acupuncturists' AM.

This experimental method describes a solution for the kinematic analysis of acupuncture manipulation with three-dimensional finger motion tracking technology.

니들링 중 3차원 손가락 동작 추적: 침술 조작의 운동 분석을 위한 솔루션

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury to the veins and arteries during the operation and hemodynamic changes can lead to intimal hyperplasia, leading to juxta-anastomotic stenosis. To reduce injury to the veins and arteries during the operation, this study proposes a new modified no-touch technique (MNTT) for AVF construction that can decrease the rate of juxta-anastomotic stenosis and improve the AVF patency. To unravel the hemodynamic changes and mechanisms of the MNTT, this study presented an AVF procedure using this technique. Although this procedure is technically challenging, 94.4% procedural success was achieved after adequate training. Ultimately, 13 out of 34 rabbits had a functional AVF 4 weeks after the surgery, leading to a 38.2% AVF patency rate. However, at 4 weeks, the survival rate was 86.1%. Ultrasonography showed active blood flow through AVF anastomosis. Furthermore, the spiral laminar flow was observed in the vein and artery near the anastomosis, suggesting that this technique may improve the hemodynamics of the AVF. On histological observation, significant venous intimal hyperplasia was observed at the AVF anastomosis, whereas no significant intimal hyperplasia was observed at the proximal external jugular vein (EJV) of the anastomosis. This technique will improve the understanding of the mechanisms underlying the use of MNTT for AVF construction and provide technical support for the further optimization of the surgical approach in AVF construction.

The present protocol proposes the creation of an arteriovenous fistula in rabbits using a modified no-touch technique. The technique involves the side-to-side anastomosis of the common carotid artery and external jugular vein without the dissection of the perivenous tissues or cutting off the artery.

토끼의 동정맥루 건설을위한 수정 된 기술

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...