Name: a syngeneic mouse b-cell lymphoma model for pre-clinical evaluation of cd19 car t cells
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells at JoVE.com

우리는이 연구 (그랜트 13031)와 CRUK 맨체스터 생물 자원 단위, 이미징 및 cytometry 및 분자 생물학 핵심 시설이이 작업을 지원 하기 위한 자금에 대 한 Bloodwise를 감사 하 고 싶습니다.

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데이비드 Gilham 차 T 세포의 생산에서 포함 되는 Celyad에 대 한 작동 합니다. 작가의 나머지가 없다 공개 수 있습니다.

Syngeneic 마우스 모델 그대로 면역 시스템을 유지 하면서 질병 진행 및 치료의 테스트 수 있습니다. 이것은 파라마운트 immunotherapeutic 에이전트에 대 한 특히에서 면역 체계와 상호 작용 하는 치료에 관해서입니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 작업 흐름, 첫 번째 자동차를 표현 하기 위해 마우스 T 셀을 수정 하 고 유전자. 이 변환의 유효성 검사 개시 7 일 필요합니다. 자동차 T 세포의 생산을 수 반하는 생쥐에서 조직의 림프의 설립이 이다. 자동차 T 세포 생산 실패 하거나 품질 되 고 부족, 거기 아니다 일반적으로 충분 한 시간 전에 마우스 대체 전지를 생산 하는 림프 종에 굴복 해야 합니다. 따라서 연구팀은 정확 하 게이 모델을 사용 하 여 성공적으로 치료 관리에 대 한 자동차 T 세포의 생산을 시간 순서 종양 투약 하 고 질병 진행 연구를 수행 하는 중요 한 이다.
낮은 T-셀 변환 효율에 대 한 일반적인 이유는 프로듀서 셀, 일반적으로 불 쌍 한 플라스 미드 순도 또는 transfection 미디어의 pH의 부정확 한 결정으로 인 한 가난한 transfection 효율 포함 되어 있습니다. 가난한 transfection T-셀 변환 효율 제한으로 전체 프로토콜 함께 진행 하기 전에 프로듀서 셀 transfection 효율을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나 재조합 인간 fibronectin 조각 수집 될 수 있으며 다시 사용 하는,-20 ° C에, 감소 된 변환 효율성에 여러 동결 해빙 결과 저장. 마우스 spleens 후 컬렉션은 또한 높은 얻는 것이 중요의 신속한 처리 가능한 T 세포의 생성 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜 A20 셀 luciferase 표현 활용을 주목 한다. 이것은 선호 생물 발광 영상으로 조직의 종양 부담을 측정 하는 능력을 제공 합니다. 그러나, 기능적인 면역 체계의 존재 luciferase 응답 결과 왜곡 수 있습니다. 이전 마커 transgenes17에 쥐를 살아 나 기의 면역 반응을 테스트 했습니다. 그것은 이러한 면역 세포에 의해 종양 퇴치에 중요 한 역할을 재생 하지 않는 유효성을 A20 셀 transgenes의 무료를 사용 하 여 주요 실험을 복제 열쇠입니다.
임상 에이전트 사용 vivo에서 면역 결핍 생쥐에서 하실 수 있습니다, 하는 동안 마우스 암 세포에 대 한 마우스 자동차 T 세포를 사용 하 여 우리가 치료 효능 또는 질병 진행에 면역 체계의 기여를 평가 수 있습니다. 이 프로토콜 B-세포 림프 종 또는 IL-12 여기에 설명 된 대로의 분 비 등 추가 수정와 다른 자동차를 대상으로 하는 자동차의 전 임상 평가 위해 활용 될 수 있습니다. 그것은 그 면역 세포 사이 상호 작용 syngeneic 마우스 모델에서 평가 될 수 있습니다, 하지만 그들은 수 있습니다 하지 정확 하 게 정리 vivo에서인간 상호 작용을 언급 해야 합니다. 특히의, 인간 및 마우스 자동차 구조는 다운스트림 결과;에 달라 집니다. T 세포의 성장 위한 최적 활성화 및 셀 문화 조건에 다른20, 대상 항 식의 조직 분포 인간과 쥐 사이 다를 수 있습니다 및 경험 있는 독성 근본적으로 다를 수 있습니다. 그러므로 전 비보 및 결과 승산이 xenogeneic 모델 활용 필수적 이다.
요약 하자면, syngeneic lymphodepleted 및 lymphoreplete 모델의 림프 종 환자와 이전 항 암 치료/방사선 치료 없이 정리. 이 다양 한 새로운 면역 치료 대리인의 오는 파도와 중요 한 치료 전략의 테스트 수 있도록 임상 설정을 모방 하는 모델 시스템을 제공 합니다.
사전 컨디셔닝의 사용, 그것은 모든 마우스는 일반적으로 림프 종 선택을 취소 표시 됩니다. 와 최대 90% 완료 응답 속도 인간에서는, 이것은 대표입니다. 그러나 CD19 차 T-세포 치료에 대 한 도전을 relapses 관찰의 높은 주파수를 방지에 경첩 것입니다, 그는 종종 CD19. Relapses 하지 관찰 되었습니다이 모델에서, 그리고 종종 100 일 넘어. 병원에서 본 relapses 모방 수정 CD19 차 T-세포 치료의 미래 과제 도울 수 있었다.

공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 CD19 치료에 놀라운 임상 성공을 보이고 있다+ 재발된 급성 림프 구성 백혈병1 과 axicabtagene tisagenlecleucel의 승인에 지도 하는 악성 종양 진보적인 큰 B-세포 비 Hodgkin 림프 종2 2017에 대 한 ciloleucel.
암과 질병의 진행 및 치료 메커니즘 모두에서 면역 체계 사이 상호 작용의 중요성은 점점 더 인식된3,4,되 고5. 예, 그것은 잘 종양 microenvironment (TME) 면역 세포6,,78의 이펙터 기능을 억제할 수 있는 요인으로 맞이 하 게 됩니다 문서화. 또는 생 면역 세포와 epitope 확산 못쓰게 종양 퇴치 및 장기 저항 종양 도전9,10키 수 있습니다. 이러한 현상의 둘 다 면역 체계가 부족 xenogeneic 모델에서 평가할 수 없습니다. 마찬가지로, 유전자 변형 단백질을 이용 하 여 시스템 epitope11,12확산에 필요한 면역 관용을 깨는 도전을 정확 하 게 반영 하지 않습니다. 따라서, 완전 한 기능 면역 체계와 syngeneic 모델은 암 질병 진행 및 면역 치료제의 이러한 중요 한 측면을 모델링을 위한 파라마운트.
자동차 T-세포 치료의 중요 한 경고 lymphodepleting 사전 조절 치료 성공13,14필요 하다는 것 이다. 이것은 일반적으로 자동차 T 세포15,16의 주입 전에 화학요법을 투여 하 여 환자에 달성 된다. 표준 방법으로 환자의 설정에서 사용 하는 lymphodepletion를 모방 하기 위해 우리 관리 5 Gy 총 몸 방사선 조사 (TBI) 마우스 베어링 조직의 A20 B-세포 림프 종 치료 차 T 세포의 이전 lymphodepletion를 달성 하기 위해.
Lymphodepleting 사전 컨디셔닝 대부분의 환자에 대 한 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 화학요법 에이전트와 함께 제공 되는 독성의 낮은 성능 상태 환자 차 T-세포 치료 받을 수 있습니다 의미 합니다. Lymphodepletion에 대 한 부적격 환자를 나타내는 테스트 시스템을 만들려면, 우리는 우리가 자동차 T-세포 림프 종 치료 모델 lymphoreplete syngeneic 마우스 모델 설립. 이 모델에서 차 T 세포 내에서 IL-12의 분 비의 성공률와 함께 설립된 림프의 박멸 이어질 수 살펴보았습니다 ~ 2517. 또한, 우리는 내 생 면역 세포 암 퇴치에 참여 했다 보였다.
여기 우리가 자세히 설명 마우스 자동차 T 세포의 생산을 위한 프로토콜 syngeneic 쥐 및 또는 lymphodepleting 사전 컨디셔닝의 사용 없이 차 T 세포 림프 종 치료에 림프 종 설립. 이 다른 transgenes 차 T 세포를 테스트 하는 다른 에이전트와 자동차 T 세포의 조합 연구 또는 림프 종에 대 한 다른 입양 세포 치료 또는 immunotherapy 전략의 사용에 대 한 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Appleton Woods</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Appleton Woods</td><td>FC122</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml pestle and microtube</td><td>VWR</td><td>431-0098</td><td></td></tr><tr><td>100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>&lt;em&gt;31350&lt;/em&gt;-&lt;em&gt;010&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S hydrochloride</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Top Filter (0.2 &amp;micro;m)</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>FIL8192</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100759</td><td>1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100552</td><td>1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting beads &amp;ndash; CountBright absolute counting beads</td><td>Molecular Probes</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100&amp;mu;m</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophosphamide Monohydrate</td><td>Merck</td><td>239785-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-03</td><td>Sold by Sigma- Aldrich</td></tr><tr><td>Flow cytometer - LSR Fortessa x20</td><td>BD Biosciences</td><td>658222R1</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Haemacytometer</td><td>Appleton Woods</td><td>HC001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H0887&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>88-7121-76</td><td></td></tr><tr><td>IL2, Proleukin</td><td>Novartis</td><td>PL 00101/0936</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; bioluminescence imaging system &amp;ndash; in vivo xtreme II imaging system</td><td>Bruker</td><td>T149094</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Calcium Salt</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423114</td><td>1 in 100 staining dilution</td></tr><tr><td>Luminometer - Lumistart Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-301</td><td></td></tr><tr><td>Murine IFN-&amp;gamma; ELISA kit</td><td>Diaclone</td><td>861.050.010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP229540</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;P8139&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Platinum E cell line</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td>(RRID:CVCL_B488)</td></tr><tr><td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td>Clone &amp;nbsp;37.51</td></tr><tr><td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3&amp;epsilon;</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td>Clone &amp;nbsp;145-2C11&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent</td><td>TaKaRa</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free)</td><td>BioLegend</td><td>577806</td><td></td></tr><tr><td>Red cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>004-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin - EDTA solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T3924&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

a syngeneic mouse b-cell lymphoma model for pre-clinical evaluation of cd19 car t cells

CD19 공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 놀라운 임상 성공 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) andnon-Hodgkin 림프 종 (NHL)에 대 한 두 번째 세대 공상 항 원 수용 체 (자동차)의 승인을 주도하 고 있다. 필드의 초점은 이제 덜 인상적 완전 한 응답 속도 관찰 된다 다른 혈액 악성 종양에서 이러한 성공을 모방에 있습니다. 자동차 T 세포 또는 다른 치료 modalities의 공동 관리의 엔지니어링 추가 다른 암 설정에서 성공적인 치료에 장애물 극복 성공적으로 수 있습니다.
우리는 따라서 다른 CD19 자동차 T 세포의 전 임상 테스트 수행할 수 있는 모델을 제시. 이 테스트 B-세포 림프 종 모델 결과 일반적으로 유익한 자동차 T-세포 치료 될 것.
이 프로토콜을 사용 마우스의 재현 생산 MP71 retroviral 구조와 pCL 에코 포장 플라스 미드 retroviral 입자 분 비의 컬렉션 뒤 같은 E 프로듀서 셀 칼슘 인산 염 transfection 통해 자동차 T 세포와 재조합 인간 fibronectin 조각 및 원심 분리를 사용 하 여 변환입니다. Retroviral 변환의 유효성 검사 및 확인 대상 림프 종 세포 vivo ex, cytometry, luminometry 및 효소 연결 된 immunosorbent 사용 죽 차 T 세포 수의 시험 (ELISA), 또한 설명.
프로토콜 테스트 차 T 세포 vivo에서 lymphoreplete에 고 lymphodepleted syngeneic 마우스, 베어링 설립, 조직 림프 종 같습니다. 안티-암 활동 vivo에서 생물 발광 및 질병 진행에 의해 모니터링 됩니다. 우리 때 1세인트 또는 lymphodepleting 사전 및 자동차 T를 활용 하 여 장기 remissions 달성 하는 쥐의 소수와 함께 2차 세대 자동차 설립된 B-세포 림프 종의 근절의 전형적인 결과 보여 셀 lymphoreplete 쥐에 IL-12를 표현입니다.
이러한 프로토콜은 다른 추가 수정, 차 T 세포의 조합 및 다른 치료제와 CD19 차 T 세포를 평가 하는 데 사용 하거나 다른 대상 항 원에 대 한 자동차 T 세포의 사용을 위해 적응 수 있습니다.

T 세포의 고효율 변환에 대 한 신선한 retroviral 입자를 얻을 필요가 있다. PMP71 레트로 바이러스 플라스 미드 pCL 에코 프로듀서 플라스 미드와 같은 E 셀 라인의 transfection retroviral 입자의 분 비 세포 표면에 뜨는에 상승을 제공합니다. MCherry, 같은 형광 표식 유전자는 레트로 바이러스에서 인코딩된 때 성공적인 transfection 형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 확인할 수 있습니다. Transfected 같은 E 셀에서 상쾌한 바이러스를 포함 하는 T 세포를 통해 2 라운드 스핀 fection fibronectin 조각 코팅 접시에 transduce 데 사용 됩니다. 4 일 게시 cytometry 통해 변환 변환의 효율성을 확인할 수 있습니다. 성공적으로 불리고 셀 레트로 바이러스 (그림 2)에서 인코딩 표식 유전자를 표현 한다. 변환 효율성 범위에서 ~ 50-90% 효율을 1 세대 수용 체와 ~ 차 10-40% 가까이 retroviral 포장 용량 구성. 마커 유전자 발현 성공적인 retroviral 변환 보여줍니다, 그것은 그들의 표면에 그 표현 대상 항 원 세포와 매력적인 시 자동차 T 세포의 기능을 보여 최고. 대상 셀 라인 표현 luciferase 수정 직접 차 T 세포 (그림 3A)에 의해 셀 죽 일 정도의 테스트 luciferase 분석 실험에 사용할 수 있습니다. 대상 셀, ELISA, 정한 공동 문화 시 자동차 T 세포에서 이펙터 cytokines의 방출 자동차 T 세포 세포 독성 (그림 3B 와 3c)의 간접 측정으로도 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 생산 하는 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종 (주입 정 맥), 1 일 5 x 105 A20 셀 (그림 4)의 IV 주입 전에 cyclophosphamide의 100mg/kg 복용량을 설정 하 여 lymphoreplete 마우스에 평가할 수 있습니다. 소 및 이미지 캡처 vivo에서 생물 발광 영상을 사용 하 여 IP 주입 종양 부담 (그림 5A-C)에 걸쳐 지속적인 투자 수익 및 노출 시간을 사용 하 여 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 자동차 T 세포 표현 IL-12 수정 lymphodepleting 사전 마우스 (그림 5D)의 약 25%에서 질병-무료 생존을 주는 조건으로 조직의 림프를 근절 할 수 있다. Lymphodepleting 늘어진, 5 달성 Gy TBI 자동차 T 세포의 4 행정에 앞서 1 일 크게 향상 engraftment (그림 6). 이 모델에서는 1 세대 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종, 일반적으로 유도 하는 쥐 (그림 7)의 100%의 질병-무료 생존을 근절 할 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> 그림 1입니다. 같은 E 셀의 성공적인 transfection 확인. 같은 E 셀 retroviral 자동차 구조 및 pMP71와 pcl 에코 포장 벡터 플라스 미드 DNA 페. 성공적인 transfection mCherry 형광 표식 유전자의 표현에 의해 표시 됩니다. A) 밝은 분야 현미경 검사 법, B) 형광 현미경 검사 법 및 C) 병합 된 이미지 표시 됩니다. 확대 = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> 그림 2입니다. Cytometry에 의해 변환 효율 결정. Cytometry 하루 4 게시물 변환, 좀비 UV 라이브/죽은, mCherry, BV711를 사용 하 여 마우스 T 셀의 변환 효율을 결정 하는 데 사용은 하 고 라이브의 검출에 대 한 BV785, 자동차 건설, c d 4와 CD8 세포, 각각. 대표적인 결과 A) 비 불리고, B) mCherry.αmCD19.mCD3z와 C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 1의 게이팅 함께 표시 됩니다) Singlets 2) 라이브 셀 3) CD4, CD8 4)와 5) 자동차를 표현 하는 mCherry 긍정적인 세포의 평가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> 그림 3입니다. 자동차 T-세포 활동의 유효성 검사. ΑmCD19 차 T 세포 표현 luciferase 수정 A20 림프 종 세포와 공동 경작 했다 (1 x 104: 1 x 104) 16 h U-하단 96 잘 접시에 대 한. 후 공동 문화, 셀 했다 수송과, 그리고 상쾌한 수집. A) 셀 다시 PBS에 중단 되었고 luminometry 대상 셀의 가능성을 평가 하는 데 사용 되었다. 공동 문화에서 상쾌한 IFNγ (B) 및 IL-12 (C)의 존재에 대 한 평가 했다. 대상 셀에 자동차 T 세포의 비율 및 공동 문화 기간을 최적화 해야 합니다 각 자동차에 대 한 생성 하 고 대상 셀 라인. PMA와 ionomycin 치료 T 세포와 그들의 능력 세포 응답의 품질을 확인 하는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. p < 0.001)입니다. 이 그림은17에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> 그림 4입니다. A20 림프 종 lymphodepletion 없이 설정. Cyclophosphamide는 lymphodepletion를 일으키는 원인이 되기 없이 림프 종 유도의 효율성을 높일 수 있습니다. A) cyclophosphamide의 100 mg/kg의 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트. 오차 막대 표시 SD B) 4 배달 cyclophosphamide의 날-1 염 분 100 mg/kg의 하루는 루미 노를 사용 하 여 측정 하는 0에서 5 x 105 A20 셀 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 림프 종 부담. 쥐의 C) 생존 B). 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 2-웨이 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. * * p < 0.01, * * * p < 0.001). 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> 그림 5입니다. 림프 종 및 생존 모니터링. A20 림프 luciferase 표현 베어링 마우스 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사를 받을 고는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있었다. A) 마우스 복 부 측에 1 분 동안 노출 되었고 즉시 이미지 시체 (B)의 양쪽에 대 한 종양 중 선택 등을 성을 상실. C) lymphodepletion 없이 다양 한 αmCD19 자동차 T 세포를 받는 BALB/c 마우스의 림프 종의 대표적인 결과. 오차 막대 표시 SEM. D) 같은 쥐의 생존 율. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> 그림 6입니다. Lymphodepletion의 효과입니다. A) 0.02 Gy/분;의 복용량 비율 5 Gy TBI를 받은 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트 오차 막대 표시 양방향 ANOVA sd. 통계 분석. p < 0.05 * * p < 0.01, * * * p < 0.001. B) CD4의 모니터링+ 와 CD8 cytometry mCherry 마커 유전자 7 일 게시물 관리에 대 한에 의해 쥐의 말 초 혈액에서+ 차 T 세포. 오차 막대 표시 sd. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> 그림 7입니다. Lymphodepleting 사전 조화 차 T 세포 활동. 일반적인 결과 전날 차 T-셀 관리 5 Gy TBI의 영향을 보여주는. A) 는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사 후 쥐의 이미징의 이미징 및 (B) 그래픽 표시. 오차 막대 표시 SEM. C) 같은 쥐의 생존. 이 그림은 수정 된 fromKueberuwa 그 외 여러분 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

여기, 우리가 현재 생산과 retroviral 변환 및 또는 lymphodepleting 없이 BALB/c 마우스에서 설립된 syngeneic A20 B-세포 림프 종에 대 한 치료로 활용 하 여 murine CD19 차 T 세포의 전 임상 시험에 대 한 프로토콜 미리 컨디셔닝.

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

이 방법은 CAR T 세포의 유전 적 변형 및 다른 면역 요법과의 조합과 같은 CAR T 세포 면역 요법 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 림프절과 림프절 설정 사이의 비교를 허용하는 것입니다. 이것은 우리가 질병 진행과 치료 CAR T 세포와의 상호 작용 모두에서 내인성 면역 세포의 역할을 볼 수 있습니다.이 모델에서 배운 교훈이 CEA와 같은 다른 표적과 사탕의 집으로 직접 번역 될 수 있기 때문에 고형 종양의 진단에 치료에 10이 기술의 의미. 이 절차를 시작합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 미디어와 셀을 준비합니다. 첫날에는 DMEM에서 15 평방 센티미터 문화 요리에 이르기까지. 이 요리에 750 만 백금 E 세포 씨앗과 37에서 하룻밤 배양

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

14.5K 조회수.  University of Manchester. 이 방법은 CAR T 세포의 유전 적 변형 및 다른 면역 요법과의 조합과 같은 CAR T 세포 면역 요법 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 림프절과 림프절 설정 사이의 비교를 허용하는 것입니다. 이것은 우리가 질병 진행과 치료 CAR T 세포와의 상호 작용 모두에서 내인성 면역 세포의 역할을 볼 수 있습니다.이 모델에서 배운 교훈이 CE...

비디오: A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

암 연구학

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells with chimeric antigen receptor (CAR) and expand their progeny ex vivo. We include assays to measure CAR expression as well as differentiation, proliferative capacity and cytolytic activity. We describe assays to measure effector cytokine production and inflammatory cytokine secretion in CAR T cells. Our approach provides a reliable and comprehensive method to culture CAR T cells for preclinical models of adoptive immunotherapy.

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

We describe an approach to reliably generate chimeric antigen receptor (CAR) T cells and test their differentiation and function in vitro and in vivo.

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to the recent FDA approval of several CD19-targeted CART (CART19) cell therapies. However, CART cell therapy is associated with a unique set of toxicities that carry their own morbidity and mortality. This includes cytokine release syndrome (CRS) and neuroinflammation (NI). The use of preclinical mouse models has been crucial in the research and development of CART technology for assessing both CART efficacy and CART toxicity. The available preclinical models to test this adoptive cellular immunotherapy include syngeneic, xenograft, transgenic, and humanized mouse models. There is no single model that seamlessly mirrors the human immune system, and each model has strengths and weaknesses. This methods paper aims to describe a patient-derived xenograft model using leukemic blasts from patients with acute lymphoblastic leukemia as a strategy to assess CART19-associated toxicities, CRS, and NI. This model has been shown to recapitulate CART19-associated toxicities as well as therapeutic efficacy as seen in the clinic.

Here, we describe a protocol in which an acute lymphoblastic leukemia patient-derived xenograft model is used as a strategy to assess and monitor CD19-targeted chimeric antigen receptor T cell-associated toxicities.

급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

C57BL / 6 마​​우스의 전신 홍 반성 루푸스의 BM12 유도 성 모델 (SLE)

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

의학

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Syngeneic 모델에서 마우스 CAR-T 세포 생성을 위한 간소화된 프로토콜

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological malignancies and are presently undergoing development for the treatment of diverse solid tumors. So far, the preliminary evaluation of novel CAR-T cell products has predominantly taken place in xenograft tumor models using immunodeficient mice. This approach is chosen to facilitate the successful engraftment of human CAR-T cells in the experimental setting. However, syngeneic mouse models, in which tumors and CAR-T cells are derived from the same mouse strain, allow evaluation of new CAR technologies in the context of a functional immune system and comprehensive tumor microenvironment (TME). The protocol described here aims to streamline the process of mouse CAR-T cell generation by presenting standardized methods for retroviral transduction and ex vivo T cell culture. The methods described in this protocol can be applied to other CAR constructs beyond the ones used in this study to enable routine evaluation of new CAR technologies in immune-competent systems.

저자 스포트라이트: Enhancing CAR-T Cell Function in Syngeneic Tumor Models(합성 유전자 종양 모델에서 CAR-T 세포 기능 향상) 

This protocol streamlines retroviral vector production and murine T cell transduction, facilitating the efficient generation of mouse CAR-T cells.

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

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