이 절차의 전반적인 목적은 환경 포식자 아메바에 의해 병원성 곰팡이 종 Cryptococcus neoformans의 phagocytosis를 연구하는 도구로 현미경 을 사용하는 것입니다. 이 비디오는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 및 전송 전자 현미경 검사를 사용하여 연구할 크립토 코칼 세포 및 아메배의 공동 배양을 준비하기위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이러한 기술을 사용하여 얻은 정보는 감염 중에 내면화 될 때 암호 세포의 행동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
YPD 천 접시에 테스트 곰팡이 균주를 줄입니다. 섭씨 30도에서 48시간 동안 접시를 배양합니다. 48 시간 된 접시에서 세포의 루프를 긁어 4 %의 포도당으로 보충되는 YNB 국물의 100 밀리리터를 포함하는 250 밀리리터 원추형 플라스크로 접종하십시오.
플라스크를 섭씨 30도에서 24시간 동안 로터리 셰이커로 배양합니다. 24시간 잠복기 후, 혈류계를 사용하여 곰팡이 세포를 계산하고 생리적 완충액을 사용하여 밀리리터당 100만 개의 세포로 세포 수를 조절한다. 펩톤 효모 추출물 포도당 국물에 아메바 세포를 재배하여 섭씨 30도에서 일주일 동안 재배합니다.
혈전계를 사용하여 아메바 세포를 계산하고 신선한 멸균 ATCC 배지 712로 밀리리터당 세포 수를 1,000만 세포로 조절한다. 이에 따라 트라이판 블루 얼룩을 사용하여 생존 가능성 분석기를 수행합니다. 적어도 80%의 생존력을 보이는 세포와 함께 일하는 것이 좋습니다.
표준화된 아메바 세포의 200마이크로리터 서스펜션을 부착 슬라이드의 챔버로 분배합니다. 세포가 섭씨 30도에서 표면에 부착되도록 2시간 동안 지나갑니다. 아메바 세포가 정착하는 동안, 형광균 이소티오야네이트와 표준화 된 크립토 코칼 세포를 얼룩.
실온과 어둠 속에서 2 시간 동안 곰팡이 세포를 부드럽게 교반하십시오. 이미 아메바 세포를 포함하는 적절한 챔버에 세척 한 후 스테인드 크립토 코칼 세포의 200 마이크로 리터 현탁액을 분배합니다. 준비된 공동 문화를 섭씨 30도에서 추가로 2시간 동안 배양합니다.
코인큐베이션 기간이 끝나면 PBS로 챔버를 두 번 세척하여 비내화 된 크립토 코칼 세포를 포함한 모든 무바운드 아메바 세포를 제거하십시오. 세포를 고치는 데 사용된 글루타랄데히드를 흡인하고 PBS로 챔버를 두 번 세척합니다. 챔버 슬라이드를 분해합니다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 공동 배양 된 세포를 볼 수 있습니다. 상기 분석서를 보완하기 위해, 식품 바쿠올 내부에 갇힌 세포의 판독을 선택적으로 허용하는 pHrodo 염료로 크립토코칼 세포를 얼룩지게 한다. 이미 종자 아메바 세포를 포함하는 검은 부착 마이크로티터 플레이트의 우물에 이 스테인드 세포를 분배합니다.
로그산스믹 신호를 상대형광 단위로 변환할 수 있는 마이크로 플레이트 판독기에서 형광을 측정합니다. 표준화된 아메바 세포의 5밀리리터를 이미 포함하는 동일한 원심분리기 튜브에 표준화된 크립토코칼 세포의 5밀리리터를 추가합니다. 튜브가 섭씨 30도에서 2시간 동안 방치되도록 허용하십시오.
원심 분리 후 상퍼를 흡인. pH 7에서 3시간 동안 3%글루타랄데히드에서 3%글루타랄데히드화나트륨의 1개의 어금니로 공동 배양된 세포를 나타내는 펠릿을 수정한다. 인산나트륨 완충제로 공동 배양 된 세포를 한 번 씻으라.
마찬가지로 버퍼링 된 1 % 오스뮴 테트란화물에 1 1 1/2 시간 동안 다시 수정한 다음 세척합니다. 30%50%70%95%와 100%의 등급아톤 계열에서 공동 배양된 세포라고도 하는 TEM 물질을 각각 15분 동안 탈수한다. 여기서 두 가지 변경 사항에서 최종 탈수 단계를 반복합니다.
정상 일관성의 에폭시를 계량하여 에폭시 수지를 준비합니다. 에폭시 수지에 물질을 포함. TEM 물질을 섭씨 70도에서 8시간 동안 중합합니다.
울트라톤에 유리 나이프가 장착된 16나노미터 섹션을 잘라냅니다. 어둠 속에서 10 분 동안 우라젤 아세테이트로 섹션을 얼룩지게하고 어둠 속에서도 10 분 동안 구연산염을 납으로 얼룩지게합니다. 전송 전자 현미경으로 섹션을 봅니다.
예시적인 목적을 위해, 비디오에서, 2개의 격리가 검토되고, 하나는 3-하이드록시 지방산을 생성하고 그렇지 않은 다른 하나. 3-하이드록시 지방산은 크립토코칼 세포의 성장에 역할을 하지 않는 이차 대사산물이다. 다음은 크립토코커스와 아메배 사이의 대화형 순간을 보여주는 스냅샷입니다.
점에, 내면화 전후의 크립토 코칼 셀을 관찰할 수 있다. 식세포증을 연구할 때, 라이브 이미징을 사용하는 것이 이상적입니다. 그러나, 연구원이 지속적으로 phagocytosis의 과정을 따르기 위하여 그 같은 현미경에 접근하는 것이 항상 가능하지는 않습니다.
이러한 한계를 보완하기 위한 가능한 해결책은 상대형광 단위의 판독을 통해 정량적 데이터로 이미지를 보완하는 것일 수 있다. 막대 그래프는 이미지를 보완하는 데 사용한 데이터의 예입니다. 중요한 것은 이미지 형태의 정성적 데이터와 정량적 데이터는 시간이 지남에 따라 서로 다른 시점에서 취할 수 있다는 것입니다.
모든 정보를 피킹함으로써, 하나는 phagocytosis의 과정에서 무슨 일이 일어나는지의 더 큰 이미지를 구성하기 시작할 수 있습니다. 정량적 데이터에서, 3-하이드록시 지방산을 가진 세포가 3-하이드록시 지방산을 생성하지 않는 세포에 비해 아메바 작용에 덜 민감하다는 것을 보는 것은 분명하다. TEM은 고해상도 전력으로 인해 음식 바쿠올의 루멘에 조류의 눈을 볼 수 있기 때문에 특히 강력한 도구이며, 이것은 라이브 이미징뿐만 아니라 스틸 이미지를 검사 할 때 종종 놓친 세부 사항의 종류입니다.
이 특정 TEM 현미경 에서, 크립토 코칼 세포의 표면에 protuberances 명확하게 볼 수 있습니다. 이전에는 이러한 세포 표면 구조가 3-하이드록시 지방산이 주변 환경으로 방출되는 채널이라는 이론이 있었습니다. 요점에, 이러한 채널은 내부 조건을 변경하기 위해 아메배의 식품 바쿠올의 루멘에 3 하이드록시 지방산을 전달하는 데 도움이 될 수 있으며, 따라서 세포 생존의 촉진.
pHrodo 또는 FITC 같이 음식 vacuole 안쪽같이 낮은 pH에서 단지 형광으로 사용하기 위하여 훨씬 더 나은 얼룩일 지도 모릅니다. 구체적으로 볼 때, pHrodo는 연구원이 내화된 세포에 관한 데이터를 얻을 수 있도록 허용합니다. 이를 위해, 세포는 염색하기 전에 인산염 완충액에서 중단되고 아메바 매체가 중성 pH인 것이 중요합니다.
전송 전자 현미경 연산자는 종종 결과가 왜곡되고 전자 폭격에 의해 손상된 현미경 그래프가 있는 지점이기 때문에 제대로 단면에 훈련되어야 합니다. 그것은 연구원이 제시된 프로토콜에서 충분한 정보를 취하고 그들의 자신의 연구 결과에서 그(것)들을 최적화할 수 있을 것이라는 점을 상상됩니다. 더욱이, 연구원은 또한 표적으로 한 대사산물에 대하여 항체를 개발하고 TEM 시험 도중 면역금표지를 포함하여 그들의 면역 형광 현미경 연구 결과 도중 그(것)들을 적용할 수 있습니다.
