본 연구는 N 602699 (DIREKT) ​​° 부여 계약에 따라 스웨덴 연구 협의회 (90293501, A0290401, A0290402), 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다, NovoNordisk 재단, Gurli 에드워드 Brunnberg 재단, 치료, Vleugel 줄기 재단과 아케 WIBERG 재단.

참고 : 혈액 웁살라 윤리 심의위원회 (허가 번호 264분의 2,008)와 승인의 개방형 시스템 정맥 천자에 의한 건강한 사람에서 도출되었다. 1. 시드 세포 <ol><li> T75 플라스크 중 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 차 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 PBS (pH 7.4) 중 1 % 젤라틴으로 코팅. </li><li> T75의 HUVEC을 포함하는 플라스크 (또는 기본 인간의 내피 세포의 다른 유형)에서 배지를 제거하고 PBS의 pH를 7.4에서 2.1 mM의 EDTA로 세포를 씻으십시오. 37 ° C에서 3 분 - 1 ml의 0.25 % 트립신 EDTA를 추가하고 2 배양하여 세포를 분리합니다. </li><li> PBS pH를 7.4에서 9 ml의 10 % FBS로 플라스크를 세척하여 세포를 수집하고 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. 5 분 동안 735 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 상등액을 제거하고 내피 세포 성장 배지 미세 혈관 (EC GMMV) 신중 세포 펠렛을 재현 탁하고 Bürker 챔버에서 세포를 카운트. 21,000 C 종자ELL 학생 / 1 웰 세포 배양 슬라이드에 cm 2, 37 ° C에서 품어. 문화 2 일 - HUVEC은 1 일 이후에 컨 플루 언트됩니다. 가벼운 현미경으로 세포 형태와 컨 플루 매일을 모니터링합니다. </li></ol> 전혈 2. 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 고정 된 헤파린 (CHS)의 더블 레이어 혈액과 접촉하는 모든 인공 표면을 준비합니다. 먼지로부터 보호 CHS 코팅 재료는 기능의 손실없이 최대 6 개월 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 혈액 내피 챔버 실험을 시작하기 전에 곧 건강한 기증자 (&lt;30 분)에서 혈액을 채취하는 개방형 시스템 정맥 천자를 사용합니다. 조심스럽게 CHS 코팅 된 50 ㎖ 튜브에 혈액을 수집하기 전에 : (2mm 내경) 커플은 피하 주사 바늘 CHS 코팅 실리콘 튜브로 (18 G는 50mm를 X). 미분 획 헤파린 보충 혈액 0.75 IU / ml의 최종 농도에 도달한다. INVE에 의해 부드럽게 혈액을 혼합3 회 - 튜브 2를 rting. </li></ol> 3. 혈액 내피 상공 회의소 모델 <ol><li> PMMA 슬라이드 (25 X 75mm)에 붙어 두 개의 실린더 (높이 8mm 및 반경 9mm)로 구성된 아크릴 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA)에서, 혈액 챔버 (상위 뷰 그림 1A)를 제작합니다. 배양 된 내피 세포 (도 1b)를 가진 유리 슬라이드에 대해 혈액 챔버를 밀봉하기 위해 고무 O 링이 위쪽으로 향하도록 실린더의 가장자리를 장착한다. 그 후 수직 위치 (그림 1C)에서 내피 세포와 배양 슬라이드에 연결된 혈액 챔버를 회전합니다. </li><li> 혈액을 활성화하지 챔버 돌보는 코팅 각 CHS에 1.5 ml의 혈액을 전송하는 CHS 코팅 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> MK에게 μL 0.34 3 30 EDTA를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브로 이동 1 ml의 혈액을 사용하여 초기 혈장 단백질 농도 측정을 위해 10 mM의 K 3 EDTA의 최종 농도에 도달효소 면역 분석법 (ELISA)를 연결. 조심스럽게 피를 혼합하고 얼음에 튜브를 유지. </li><li> PBS pH를 7.4에서 세포를 씻어 신중 제조업체의 지시에 따라 세포 배양 유리 슬라이드의 플라스틱 벽을 제거하고. 이후 슬라이드에서 가능한 한 많은 액체를 제거해야합니다. 세포가 건조하게하지 마십시오. </li><li> 혈액에 직면 세포, 혈액 챔버의 상단에 슬라이드를 놓습니다. 혈액 내피 세포 챔버 주위에 클램프를 배치하여 슬라이드를 고정. 클램프를 배치 할 때 세포 배양 유리 슬라이드의 파손을 방지하기위한 추가 지원 플라스틱 슬라이드를 사용한다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 회전 바퀴에 혈액 내피 세포 챔버를 수정 (40 직경 CM) 장소. 30 분 동안 0.5 XG에서 바퀴의 각 실을 돌립니다. </li><li> 배양 후, 혈액 내피 세포 챔버 해체. F PBS의 pH를 7.4에서 세포 배양 슬라이드를 세척하고 (PFA)를 얼음 차가운 1 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정또는 10 분. μL 0.34 MK 3 EDTA를 (30)를 포함하는 마이크로 원심 튜브에 각각의 챔버에서 전송 1 ml의 혈액을 10 mM의 K 3 EDTA의 최종 농도에 도달하고 부드럽게 튜브를 혼합합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 4,560 XG에서 튜브를 원심 분리기. 추가 분석 할 때까지 -70 ℃에서 새로운 마이크로 원심 튜브 및 저장소에 혈장을 전송합니다. </li></ol> 혈액 내피 세포의 상호 작용 4. 분석 <ol><li> 보조 염소 항 - 마우스 알렉사 488과 팔로이 딘 - TexasRed 다음 마우스 항 - 인간 CD16과 면역 형광 염색을 수행합니다. 실온에서 1 시간 동안 각 염색 공정을 수행하고, 각 단계 사이에 PBS pH를 7.4에서 슬라이드를 세척 하였다. 실온에서 10 분 동안 DAPI로 핵 Counterstain과. 이미지 분석은 CellProfiler 같은 적당한 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 조합하여 형광 현미경으로 혈관 내피 세포에 결합 된 혈액 성분을 분석한다. </li><li> 정량화회계 연도 혈장의 제조 업체의 지침에 따라 트롬빈 - 안티 트롬빈 (TAT) ELISA와 혈액 구획의 반응. </li><li> 적절한 통계 도구, 예를 사용한다., 짝 t 테스트를, 데이터를 분석. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> 혈액 및 혈관 벽 사이의 다중의 상호 작용은 일반적 의한 내피 세포의 비 - 접착 성 및 항 혈전 특성으로 정지 상태로 유지된다. (7) 염증과 관련된 병리 적 상태 동안, 내피 세포 부착 수용체 발현 8에서 얻어진 증가 활성화되고 감소 된 능력을 억제하는 지혈. 차례의 혈액에서 캐스케이드 시스템 (9) 활성화가 더 혈전증 및 백혈구 모집의 원인이되는 혈관 내피 세포의 혈전을 증폭시킨다. (10) 내피 세포 및 전체 혈액 사이의 미묘한 상호 작용에 대한 이해를 얻으려면, 우리가 배양 된 내피 세포는 전체 혈액과 접촉에 배치됩니다 체외 방법에 소설을 개발했다. 우리가 알기로는, 우리의 설치는 더 이상 기간에 대한 아니오 전체 인간의 혈액 또는 약간의 항응고제로 배양 내피 세포를 보여 처음이다. NT &quot;&gt;이 시스템의 감도는 혈액과 접촉에 배치 모든 표면에 고정화 된 헤파린의 보호 층과 함께 개방형 시스템 정맥 천자로 사용할 수 있습니다. 혈액 조달 동안 개방형 시스템의 사용은 정맥 천자시 캐스케이드 시스템의 활성화를 감소 항응고제의 자기 결정된 양의 사용을 허용하는 동안. 시판 진공 혈액 튜브 그러나, 연구의 의도 끝점에 따라 사용될 수있다. 대부분의 시판 폐쇄계 튜브에 첨가 항응고제의 최종 농도가 민감 억제 할 수 , 그렇지 않으면 하드 설정에서, 상호 작용을 연구합니다. (6) 보호 헤파린 표면이 더 내피 세포 이외의 다른 표면으로 표면 접촉을 통해 혈액의 활성화를 제거한다. (5) 실제로, 미분 획 헤파린의 소량 첨가 된 전체 혈액의 배양을 CHS의 보호없이 챔버는 혈전 형성의 결과. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 챔버 내부의 공기 거품 내피 세포 배양시 혈액의 혼합을 가능하게한다. 기포 크기의 영향을 평가하기 위해, 우리는 두 가지 혈액량을 사용했다. 이 모델에서는 HUVEC 배양 챔버에 관계없이 기포의 크기 TAT 비슷한 수준을 측정 하였다. TAT는하지만, 완전히 CHS에 작은 기포 크기가 증가 챔버 처리했다. 이것은, 전술 내피 세포의 특성 (11)에 따라, 불활성 CHS 챔버에서 결여되어 내피 세포에 의해 제공 응고의 증가 된 활성화시 조절 효과를 나타낸다. 시스템의 공기 방울은 챔버의 회전에 따라 흐름을 만듭니다. 거품의 크기는이 회전 시스템 내에서 힘에 영향을 미칠 것입니다. 이것은 작은 기포가 혈액 예에 따라 감소 된 힘을 나타내는 높은 TAT 값을 생성 그림 2D에서 우리의 결과에 의해했다 표시됩니다, 혈액 이동챔버는 낮고 캐스케이드 시스템의 활성화함으로써 높은 정도로 발생 내에. 그것은이 시스템에서 우리는 벽과 중앙에서 가장 낮은 함께 최고 속도로 챔버에서 속도 다를 수 있습니다 회전 흐름을 만드는 것을 언급해야한다. 이것은 분명히 내피 세포에 대한 흐름과 관련하여 전단 응력을 가진 최적의 환경 아니지만, 여전히 우리는 안정적이고 반복 가능한 결과를 생성하는 시스템을 갖는다. 더 최적의 조건은 난류의 부재 층류 순환 포함한다. 이 여기에 표현 된 모델에서, 그러나 불가능하며 우리의 지식에 이러한 시스템은 날짜에 사용할 수 없습니다. 시스템에 추가 항응고제없이 또는 낮은 수준으로 전체 혈액과 결합 할 수없는 몇 가지 미세 유체 시스템을 시판이 있지만함으로써 혈액과 혈관 내피 세포에 존재하는 모든 구성 요소 사이의 상호 작용의 적절한 민감한 평가를 가능하게 실패. 또한 TNFα는 독립적 혈액량의 TAT의 배 형성과 조합 HUVEC 활성화쪽으로 혈액 세포의 모집 2 배 증가 하였다. 이 모델 시스템의 안정성을 확인하고 또한 전혈과 함께 활성화 된 내피 세포를 사용할 수있는 가능성을 보여준다. 혈액 내피 세포 챔버는 다양한 조건 하에서 활성화의 단계에서 발현 세포 마커의 종류에 의해 활성화 된 내피 세포쪽으로 혈액 세포 모집을 조사하는데 사용될 수에 미래. 더욱이, 모델은 염증 상태에 대한 영향을 평가하기 위하여 약리학 적 제제와 조합하여 사용할 수있다. 요약하면, 우리는 혈관 질환 관련 조사를 수행하는 시험 관내 시스템에서의 완전한 인간을 만드는 사람의 혈액 및 혈관 세포 챔버 모델을 조합하는 큰 이점을 나타낸다.

심혈관 질환에서 혈액 혈관의 상호 작용을 분석하는 방법은 일반적으로 동물 연구 실험을 포함한다. 실험 연구 동물 모델에서 생성 된 결과 그러나. 인간의 질병에 대한 거의 또는 전혀 의미가 이와 같이 1,2- 수 혈액 구획과 혈관 내피 세포 간의 세포 상호 작용을 조사하는 시험 관내 모델에서 좋은 신뢰성에 대한 요구가있다 인간과 같은 시스템. 따라서 우리는 혈액 내피 세포 챔버 모델을 설립했다. 이 생체 물질과 인간의 전체 혈액 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용 이전에 설명한 모델을 기반으로합니다. 일반적으로 정제 된 구성 요소의 수를 제한 다른 시험관 설정 3는 달리 즉, 혈소판은 백혈구 나 내피 세포가 사용할 수 있으며, 본 모델은 모든 통합 성분은 혈관에 제시한다. 혈액 내피 (c)의 설치엘 실 모델은 거의 또는 전혀 추가 항응고제 갓 그려진 인간의 혈액의 사용을 가능하도록 설계되었습니다. 긴 시간 기간 동안 저장된 혈액은 그래서 적혈구의 파괴가 혈액과 혈관 내피 세포 사이의 미묘한 상호 작용을 방해 할 수있는 저장 병변라고 획득을 누릅니다. 4 생체 전체 혈액의 취급시 혈전 형성을 방지하려면 항응고제의 혈액과 접촉하는 모든 물질이 비 활성화 할 필요가 다량으로 복용 중 하나가 필요합니다. 비 - 활성화 된 표면은 실험실 환경에서 드문 같이, 물질은 별도로 고정 된 헤파린의 보호 층을 구비 할 수있다. 고정화 헤파린의 보호 층을 피 접촉은 응고 캐스케이드의 활성화를 야기하지 않고 발생할 수있는 표면을 생성 대부분의 물질에 적용될 수있다 (이하 Corline 헤파린 표면 (CHS)이라 함). (5)을 따라서 함께 챔버 가구하여 CHS, 혈액 내피 CELL 챔버 모델은 혈액에 항응고제의 매우 낮은 농도의 사용을 가능하게한다. 혈액 내피 챔버 모델에서 항 응고 고농도의 첨가를 피하는 것은 달리 마스킹 될 수있는 혈관 내의 중요한 상호 작용을 검토하는 것이 가능하다. (6) 플라스틱 현미경 슬라이드에 :; (9mm 반경 8mm 높이) 혈액 내피 세포 챔버 모델은 플라스틱 실린더를 부착하여 형성된 2 개의 챔버로 구성되어 있습니다. 실린더에 위로 향 가장자리가 세포 배양 슬라이드에 챔버를 밀봉에 사용되는 고무 O 링이 장착되어 홈이 장착되어 있습니다. 챔버는 부분적으로 챔버는 이후 수직 위치 (그림 1)으로 회전 할 때 실에 남아있는 공기가 운동에 혈액을 유지 혈액으로 가득 차 있습니다. 모델의 기능을 평가하기 위해, 우리는 하나 완전히 CHS 코팅 실험을 수행챔버 또는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC). 두 개의 분리 된 혈액 볼륨 측정 하였다 트롬빈과 안티 트롬빈 (TAT) 복합체 (응고의 간접 마커)의 형성은 효소 면역 분석법 (ELISA)으로 측정 하였다. 그런 다음 혈액 볼륨 및 종양 괴사 인자 (TNFα) 화상 해석에 의해 백혈구 보충에 내피 세포를 자극하는 효과를 평가 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> 혈액 내피 세포 챔버 모델 1. 설정을 그림. (A) 위쪽 PMMA에서 만든 혈액 챔버의 개략도를 볼 수 있습니다. (B) 1 차 인간의 내피 세포가 1 웰 챔버 슬라이드에서 배양한다. 신선한 인간 전혈은 현미경 슬라이드에 두 챔버에 첨가된다. 혈액을 처리하는 데 사용 챔버 및 모든 자료는 보호 HS 코팅으로 처리됩니다. CE의 벽을 제거한 후에LL 배양 슬라이드, 세포는 혈액 대향 배치되고 시스템은 셧을 클램프한다. (C) 혈액 내피 세포 챔버는 37 ° C에서 회전하에 배양 하였다. 그 후, 혈액 구획 반응은 ELISA에 의해 분석 될 수 있으며, 내피 세포를 현미경으로 분석 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

알려진 모든 질병의 대부분은 심혈 관계 질환을 수반한다. 심장 혈관 병리 동안 활성화 된 상호 작용 경로의 복잡성에 대한 연구는, 그러나, 강력한 생리 학적으로 관련 방법의 부족에 의해 제한됩니다. 병적 혈관 사건을 모델링하기 위해, 우리는 내피 전혈 사이의 상호 작용을 연구하기위한 시험 관내 분석을 개발 하였다. 분석은 인간의 전체 혈액과 접촉에 배치됩니다 차 인간의 내피 세포로 구성되어 있습니다. 상기 방법은 혈관에 존재하는 분자 및 세포 성분 간의 미묘한 상호 작용 연구를 가능 거의 혹은 전혀 항응고제 네이티브 혈액을 이용한다. 우리 또는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 배양없이 다른 혈액 부피로 응고의 활성화를 비교함으로써 분석의 기능을 조사 하였다. 큰 혈액 부피에 기여하는 반면트롬빈 안티 트롬빈의 형성 증가 (TAT) 복합체, HUVEC의 존재는 응고 활성의 감소 결과. HUVEC는 종양 괴사 인자 (TNFα)로 자극과 혈액의 접촉 후 자극되지 않은 세포에 비하여 TNFα 세포 자극에 상당히 높은 것으로 CD16 + 세포의 존재를 발견에 더욱이, 우리는 백혈구의 부착 이미지 분석을 적용 하였다. 결론적으로, 분석은 내피 세포 및 혈액 구획 사이의 상호 작용을 교란되어 혈관 병리 현상을 연구하기 위해 적용될 수있다.

CHS 코팅의 필요성 내피 세포에 의해 유발 된 것과 특정 전혈에서 반응을 측정하기 위해, 혈액 내피 세포 챔버에 사용되는 모든 재료는 사용 전에 CHS 코팅으로 제공되어야한다.도 2a는 (왼쪽)의 30 분 후, 코팅 챔버를 도시 명확하게 볼 혈전 현재와 혈액의 접촉. 반면에, CHS와 챔버 (도 2A, 오른쪽)을 처리하여 결과 내피 세포 - 혈액의 상호 작용에 기인하도록 보장 제어되지 않은 활성화로부터 혈액을 보호한다. 챔버 내의 혈액 볼륨의 효과 활성화 응고 인자 사이의 상호 작용의 확률이 증가함에 따라 응고의 활성화는 정체 혈중 쉽다. 혈액 내피 세포 챔버 모델에서 혈액 인하여 챔버 내부의 기포의 순환 운동에 유지된다. O를RDER 따라서 또한 기포 크기 혈액량의 변화의 효과를 결정하고, CHS 코팅 챔버는 1.5 ml를 30 분 동안 1.75 ml의 전혈 테스​​트 하였다 CHS 코팅 된 유리 슬라이드에 연결되었다. 혈액 1.75 ㎖의 혈액을 1.5 ㎖의 (도 2B)를 사용하는 경우에 비해, 챔버에 추가 될 때 기포에 의한 운동이없는 혈액의 부피가 2.5 배 더 크다. 측정 된 TAT-값은 증가 혈액 볼륨 (그림 2D)와 TAT-형성을 증가 제안했다. HUVEC (도 2C)가 전혈 1.5 중 1.75 ㎖를 함께 배양 하였을 때, 차이는 내피 세포가 응고의 활성화 (도 2D)를 조절할 수 있음을 시사한다, 두 그룹간에 유의하지 않았다. 혈액 세포 모집에 TNFα의 효과와 응고의 활성화 백혈구 모집에 TNFα의 효과를 연구하기 위해, HUVEC은 치료했다20 NG와 ED / ㎖ TNFα 4 시간 혈액에 접촉하기 전에. 혈액 접촉 - 중 1.5 ml의 또는 1.75 ml의 혈액와 함께 -, 문화 슬라이드 CD16 (그림 2 층)에 대한 염색 된 후 30 분 동안 계속 이미징 및 CD16 + 세포의 수를 정량화 하였다. CD16 + 세포의 모집은 1.5 ml의 혈액 100 ~ 256 CD16 + 세포 / mm 2 (P &lt;0.0001)에서 TNFα 치료 (그림 2E)으로 크게 증가, 172에서 1.75 ml의 혈액 378 (P &lt;0.0001)에. TAT 복합체의 형성은 어느 TNFα가 처리되거나 비 처리 된 세포 (도 2G)와 함께 배양 혈액 대응 혈장 샘플에서 측정 하였다. 비 처리 된 세포에 비하여 TNFα 자극 된 세포는 TAT 복합체의 대략 배가를 유도. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> 무화과URE 2 : 혈액 내피 세포 챔버 모델의 기능을 제공합니다. CHS 유무에 관계없이 (A) 챔버는 전체 혈액 배양 하였다. CHS없이 혈전을 30 분 후에 형성되었다. CHS없이 배양 혈액에서 트롬빈 - 안티 트롬빈 (TAT) 단지, 응고의 간접 마커의 측정&gt; 6,000 ㎍ / ㎖를했다. (B) 혈액의 볼륨은 다른 혈액 볼륨에 따라 달라집니다 회전 기포에 의해 움직이는 유지되지. 그것은 1.75 ㎖를 첨가하여 0.74 ml의 증가 반면 혈액 1.5 ㎖를 첨가하여이 부피는 0.3 ml의 것이다. 합류 단층의 위상차 현미경 쇼 전형적인 내피 세포 형태 앞서서와 (C) HUVEC 이미지화 다른 혈액 볼륨이 추가 될 때 혈액 접촉. (D) 완전히 CHS 코팅 챔버에 대한 TAT 값은 약간의 차이를 보여줍니다. 1.5 ml의 혈액의 첨가는 85 ml의 결과 1.75로 ± 11 ㎍ / ㎖ (N = 7)에 비하여 35 귀착77; 70 ㎍ / ml의 TAT (N = 8). HUVEC 동일한 혈액량 함께 배양 될 때 이러한 차이는 더 이상 존재하지 않는다; 1.5 ml의 66 ± 55 μg의은 / ㎖ (n = 5)으로 나누고, 66 ± 29 1.75 ㎖ (없음 7 =) 비자극 또는 TNFα 하나에서 CD16 + 세포의 수. (E) 부량 본이 후 HUVEC를 자극 용 ㎍ / ml의 혈액 접촉. 또는 1.75 ㎖ (기초 :; TNFα 중 하나를 1.5 ㎖ (256 ± 121 세포 / mm TNFα 100 ± 40 세포 / mm 기저) : 배양 세포를 자극하여 CD16 + 세포의 수는 크게 증가 172 ± 67 세포 / mm를; TNFα : 전체 혈액의 378 ± 185 세포 / mm) (F) HUVEC은 팔로이 딘 (적색 염색을 자극 비자극 및 TNFα의 대표 이미지), CD16 (녹색) 및 DAPI (파란색).. 스케일 바 = 250 μm의 혈액 (1.5 ㎖로 배양 처리하지 않은 세포에 비해 TAT 복합체의 형성은 약 TNFα에 의해 배가된다 (G) 세포를 자극 :. 2.1 ± 0.1 배 이상 TAT, N = 3; 1.75 ml의 1.7 ± 1.0 배의 TAT, N = 4). 모든 값은 평균 ± 표준 편차로 표시된다 P 값이 짝 t 테스트에 의해 계산 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

소설<em&gt; 시험관</em&gt; 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K 조회수.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

비디오: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

연구

면역학 및 감염병학

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

마우스의 재발 포진 성 각막염 Stromal, 인간 HSK 유학을위한 모델

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...