이 작품은 의학 내부 자금의 매사 추세츠 종합 병원과 (JMT, MKM, MLC, JMV), 바이오 메디컬 이미징 국립 연구소 생물 부여 T32EB006348 (CEC), 매사 추세츠 종합 병원의 전산과 통합 생물학 발전 기금을위한 센터 및 AI062773 (지원했습니다 RJH), 보조금 AI062773, DK83756, 그리고 DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), 미 국립 보건원의 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV ). 우리는 기술 지원을하는 데 도움이 토론을 위해 니콜라스 C. 요더 감사하고, 찰스​​ 펠츠 (RPI 주식 회사).

1. 광학 트래핑에 대한 병원균의 문화 조건 <ol><li> 3 일간 30 SBD (Sabouraud 덱스 트로 오스)이있는 세미 솔리드 한천 미디어 ° C에서 A. fumigatus (B-5233/RGD12-8)을 성장. </li><li> C. 그로 30 흔드는 인큐베이터에 하루 100 μg / ML 암피실린를 포함하는 YPD에 albicans (SC5314) (효모 - 펩톤 덱스 트로 오스) 액체 문화 ° C. </li></ol> 2. 형광 라벨에 대한 병원균의 준비 <ol><li> 수확은 병원균의 양을 원하는과 1.5 ML 반응 관에 전송할 수 있습니다. </li><li> 인산염의 추가 300 μL 반응 관에 호수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 30 초 동안 혼합 Sonicate. </li><li> 1 분 4,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 펠렛은 그대로두고, 뜨는을 대기음. </li><li> 반복 (2.4)과 (2.5) 두 번 더. </li><li> PBS의 500μL에 Resuspend. </li></ol> 3. 형광 염색과 병원균의 라벨링 <ol><li> 100 μL dimethylformamide (DMF) (10 MG / ML의 농도)에 대한 관심의 색소 (예 : 알렉사 플루어 488 알렉사 플루어 647) 1 MG를 디졸브. </li><li> 세탁 병원체를 포함하는 반응 튜브에 색소 혼합 3 μL를 추가합니다. </li><li> ° C 1 시간을 회전 또는 37 샘플을 흔들. </li><li> 1 분 4,000 rpm으로 centrifuging하여 PBS 배와 샘플을 씻으십시오. </li><li> PBS 300 μL에 Resuspend. </li></ol> 4. 전체 혈액에서 T - 세포를 수확 <ol><li> 전체 혈액을 (신선한) 구합니다. </li><li> 따뜻한 피, PBS + 2% 태아 소 혈청 (FBS) 및 실온에 histopaque. </li><li> 전체 혈액의 50 μL / ML에서 RosetteSep 인간의 CD4 + T 세포 농축 칵테일을 추가합니다. </li><li> 샘플을 회전하고 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> PBS + 2퍼센트 FBS의 동일한 볼륨 샘플을 희석하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 레이어 혼합 최소화 histopaque 위에 샘플을 희석 </li><li> 브레이크 해제와 함께 실온에서 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. </li><li> 강화 세포를 제거합니다. </li><li> PBS + 2퍼센트 FBS 솔루션으로 2 배 강화 세포를 씻으십시오. </li><li> 적혈구 세포 lysing 버퍼 2 분 동안 적혈구를 Lyse </li><li> 5 분 PBS + 2퍼센트 FBS와 1,500 rpm으로 원심 분리기 lysed 적혈구 10 ML 추가 </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록주의, 뜨는 기음 </li><li> 10% 태아 소 혈청을 포함 IMDM 미디어에 Resuspend </li></ol> 5. 챔버 슬라이드로 RAW 264.7 macrophages의 준비 <ol><li> DMEM (Dulbecco의 수정 이글의 매체) 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신,, 1 % L - 글루타민을 포함 준비. </li><li> 따뜻한 목욕에서 37로 따뜻한 미디어, 트립신, 그리고 PBS ° C. </li><li> PBS로 플레이트 2X 와시 </li><li> 각 씻어 사이의 PBS를 대기음. </li><li> (10cm 조직 문화 접시) 표면을 커버하기 위해 판 5 ML의 트립신을 추가합니다. </li><li> 37 5 분 품어 ° C. </li><li> 천천히 강판 표면의 세포를 분리하기 위해 접시의 측면을 노크. 접시 이외의 트립신을 시작하지 않도록주의하십시오. </li><li> 5 ML 또는 트립신 미디어의 상당 금액을 추가합니다. </li><li> 반응 관에 혼합 대기음. </li><li> 3 분 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 기음 미디어, 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 미디어 10 ML에 Resuspend. </li><li> 챔버 슬라이드의 각 회의소 미디어 400 μL를 추가합니다. </li><li> 각 챔버에 세포 현탁액의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 37 인큐베이터에서 하룻밤 성장 ° C 5% CO 2. </li></ol> 6. 샘플로 병원균의 추가 <ol><li> 관심 분류 병원균의 Pipet 5-10 μL (단계 1-3에서) 챔버로. </li><li> 준수 macrophages 방해하는 챔버의 바닥을 만지​​지 않도록 조심하고 아래로 pipeting에 의해 철저히 섞는다. </li></ol> 7. 디스크 공촛점 현미경을 회전에 샘플을로드하면 (비디오, 구성 요소를 통해 스캔) <ol><li> 디스크 공촛점 현미경을 회전하기 위해 모든 구성 요소를 켭니다. </li><li> DIC 이미징에 대한 현미경을 맞춥니다. </li><li> 인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 전문 단계로 챔버 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 챔버 슬라이드 위로 (DIC 이미징에 필요한)를 제거합니다. </li></ol> 8. 광학 트래핑을위한 준비 (비디오, 구성 요소를 통해 스캔 방법은 현미경으로 통합) <ol><li> 광학 함정에 셔터를 켭니다. </li><li> IR 레이저를 켜십시오. </li><li> 광학 트랩을 열고 셔터 (레이저에서). </li><li> IR 레이저 앞에서 셔터를 확인은 IR 카드를 선택하여 닫힙니다. </li></ol> 9. 광학 트랩과 함께 선택과 병원균의 조작 <ol><li> 준수 슬라이드에 macrophages에 중점을두고 있습니다. </li><li> macrophages에 인접한 용액에 자유롭게 변동 병원체를 찾습니다. </li><li> 병원체는 트랩의 주변에 그러한 단계로 이동합니다. </li><li> 셔터를 열고 함정을 갖습니다. </li><li> 정지 함정과 접촉에 macrophages을 제공할 샘플을 이동페드 병원체. </li><li> DIC, 형광, 또는 두 가지 모두의 조합하거나, 디스크 공촛점 현미경을 회전과 이미지. 일반적으로, 트래핑은 DIC에 완료하고, 실시간 영상은 형광하여 이루어집니다. </li></ol> 10. 대표 결과 : 생체내의 및 체외 환경에서 병원균과 구슬의 전체 공간과 시간적 컨트롤을 발휘하기 위해, 우리는 회전하는 디스크 공촛점 현미경 (개략도는 그림에 표시됩니다. 1)에 통합되어 사용자 정의 - 기본 트래핑 장치를 설계. 풀 가동, 레이저 전원이 350 MW를 제공하고 광학 트랩 장치의 다양한 광학 구성 요소로 빛을 결합 후, 같은 전력 측정기로 측정 TIRF 목표에 전력 ~ 80 MW는, 트랩을 형성하는 데 사용된 챔버 인치 트래핑 레이저로 고정 갇힌 개체를 누른 상태에서 개체에 갇힌 상대 챔버에서 개체를 위치하기 위해서는, 무대가 이동되었습니다. 무대는 갇힌 입자에 드래그 힘이 최대 트래핑 포스를 초과하지 않았 있도록, 속도가 느린 정도 판매율에서 이동되었습니다. C. albicans 별도의 인구 (전형적인 크기 - ~ 5 μm의)는 여러 형광 채널 영상을 보여주는 세 가지 색상 각각 (AF488, AF568, 그리고 AF647, 초록, 파랑, 대응 및 그림 빨강, 각각)와 라벨이 붙지만 동시에 광학 병원체를 막고있는 동안. 하나의 C. 회색 화살표로 표시로 albicans는에도 붐비는 환경에서 운영자가 선택한 하나의 병원체의 특정 위치 (그림 2A)을 캡처하여 조작할 수있는 능력을 보여주는, 다른 효모의 클러스터를 통해 사각형 패턴에 갇혀 및 이동되었습니다 . 추가 병원성 미생물에 의해 전시 여러 가지 형상 morphologies 함정이 시스템의 유연성을 설명하기 위해 광학 트위터도 C를 유지하고 ...을 놓다 수있었습니다 pseudohyphae로 albicans 입자. C. 흰색 화살표로 명시된 및 형광 GFP - LC3 - RAW 세포 (그림 2B) 옆에 위치로 AF647 (적색)으로 표시 albicans는 궤도를 따라 이동했다. C.의 효모 부분 pseudohyphae 같이 붙여으로 albicans가 덫에 걸렸다. 우리는 또한이 특정 세포 라인과 병원균 (그림 3A)와 phagocytosis의 절대 시간 프레임을 분석하기 위해 RAW 마우스 대식 세포 세포 옆에 Aspergillus fumigatus에 위치. 일단 병원균이 세포와 접촉하게, 트랩이 해제되어, 시간 - 저속 영상은 (그림 3B) 이후 세포 사건을 관찰하는 고용됩니다. 광학 트랩도 혈액에서 분리 구슬 (그림 4) 면역 버렸네를 형성하는 T - 세포 위해서는 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 항체로 코팅 구슬에 인접한 이동 기본 T - 세포를 캡처하는 데 사용되었다, 추가를 보여 다용도 직접 트랩 및 면역 세포를 조작합니다. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 결합 광학 트랩 및 방적 디스크 공촛점 현미경 설정의 개요 및 개략도. 트래핑 빔 (보라색), 브라이트 영상 (오렌지), 형광 여기 빔 (적색), 형광 방출 (녹색), 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를위한 조명 경로 전자 - 곱하여 요금 결합 장치를 보여주는 악기 레이아웃 (EM - CCD) 카메라, 이색성 거울 (D1 및 D2), 거울 (M1과 M2) 및 렌즈 (L1, L2, L3, L4). 트랩 - 공촛점 현미경 시스템의 다른 모든 구성 요소는 그림에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. (A)의 형광 이미지 갇혀 C를 조작 albicans. 다른 찬란 - 분류 C.의 분야에 갇힌 찬란 - 라벨 (알렉사 플루어 488 (AF488), 청색) 유기체 albicans (AF568, AF647 초록, 빨간색). 무대는 같은 회색 화살표로 표시 갇혀, 파란색 CA 입자 주위에 이동됩니다. C.의 (B) 빠진 의사 hyphal 형태 GFP - LC3 RAW 셀 옆에 albicans. CA의 찬란 분류 psuedohyphal 양식 (빨강, AF647) 광학 갇혀 GFP - LC3에 인접한 이동은 RAW macrophages을 표명했다. 흰색 화살표로 CA의 유기체가 궤도를 따라 이동합니다. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 트래핑과 A.의 위치 phagocytic RAW 셀 옆에 fumigatus. 갇혀 A.의 (A) 브라이트 이미지 fumigatus,처럼 빨간색 화살표로 표시된 경로를 따라 이동과 위치, 흰색 화살표로 표시. 갇혀있는 병원체는 초점 약간 약간 초점 평면 위의 유기체를 밀어 트랩에 의한 것입니다. 답변 그것이 원하는 RAW 세포에 인접한 위치까지 fumigatus가 이동합니다. (B) 독감A.의 phagocytosis의 orescence 이미징 RAW 세포에 의해 fumigatus. 함정 병원체가 RAW 세포 옆에 배치되면 phagocytosis 프로세스가 활성화됩니다. 30 S에서 RAW 세포의 막이 입자 주위 한잔을 변경하고 형성하기 시작합니다. 60 S에서는 컵 완전히 형성된다. 90 년대부터 150s, A.로 fumigatus가 가득 채우고 있으며, 180 S에 의해 입자가 완전히 internalized입니다 <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어있는 구슬 항체 코팅 옆에 위치로 광학 트랩 감동 T - 세포 기본의 기본 T - 세포 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 구슬로 버렸네를 형성합니다. DIC 이미지 트래핑. 세포 그런 다음 이미지에 쉽게 분별 수없는 면역 버렸네를 형성한다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

5 μm의 -이 작품에서 우리는 3 μm의 사이의 크기와 병원균을 캡처하는 광학 트랩을 사용합니다. 저희 연구실에 관심이 병원균은 일반적으로 이러한 차원을 가지고 있지만, 여기에 설명된 광​​학 트위터 시스템은 크기의 큰 범위를 함정에 융통성이 있습니다. 사실 광학 트랩은 단일 원자의 직경 약 10 μm의 세포에 이르기까지 입자를 캡처하는 데 사용되었습니다. 원형, 타원형, 그리고 생물 학적 ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> 알비노 변형, B-5​​233/RGD12-8, KJ 권 - 정, NIH에서 선물 </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50 - B 돌연변이, 엘레 프 테 리오스 Mylonakis, MGH에서 선물, SC5314 변형, 제랄드 핑크의 선물, 화이트 헤드 연구소 </td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimethylformamide </td><td> 시그마 </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> 신선한 혈액 </td><td></td><td></td><td> RJW 히스, MGH, HMS의 선물 </td></tr><tr><td> 니콘 거꾸로 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 모델 티 - E </td></tr><tr><td> 트래핑 레이저, ChromaLase </td><td> 블루 스카이 연구 </td><td> 클라스 - 106 - STF02 - 02 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 여기 레이저 </td><td> 응집 성의 </td><td></td><td> 모델 이노바 70C </td></tr><tr><td> 트래핑 구성 요소에 대한 Breadboards </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> 광학 공기 테이블 </td><td> 기술 매뉴펙쳐링 코퍼레이션 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페달 제어 전자 셔터 </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> 빈센트 어소, 로체스터, NY에서 구입한 </td></tr><tr><td> Singlemode 광섬유 </td><td> 오즈 광학 </td><td> PMJ - 3S3S - 1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 포지셔너 </td><td> Thorlabs </td><td> PAF - X - 5 - C </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 콜리 메 이터 </td><td> 오즈 광학 </td><td> HPUCO - 23-1064 - P - 25AC </td><td></td></tr><tr><td> 망원경에 대한 렌즈 </td><td> Thorlabs </td><td> AC254 - 150 - B </td><td> 150mm의 초점 거리 </td></tr><tr><td> 번역 단계 (X, Y, Z) </td><td> 뉴 포트 </td><td> M - 461 - XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR 이색성 거울 </td><td> 채도 </td><td> ET750 - SP - 2p8 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 렌즈 (100X) </td><td> 니콘 </td><td></td><td> NA = 1.49, 기름 침지, TIRF 목표 </td></tr><tr><td> 공촛점 머리 </td><td> 요코 </td><td> CSU - XI </td><td></td></tr><tr><td> 편광판 </td><td> 니콘 </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> 월라스튼 프리즘 </td><td> 니콘 </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM - CCD 카메라 </td><td> 하마 마츠 </td><td> C9100 - 13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD 카메라 (오르카 ER) </td><td> 하마 마츠 </td><td> C4742 - 80 - 12AG </td><td></td></tr><tr><td> 필터 휠 </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 휠 </td><td> 서터 </td><td> LB10 - NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered coverglass </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111 - 51D </td><td> 안티 인 경우에는 3 번 CD와 코팅 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10,313 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

동적 라이브 셀 이미징은 면역 체계 1, 2 셀 사이의 실시간 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용하지만, phagocytic 세포와 미생물 사이의 공간 및 시간적 통제의 부족은 병원균에 호스트 응답의 초기 상호 작용에 관찰 초점을 맞추고 렌더링이 어려운. 역사적으로, 이러한 phagocytosis 3와 같은 세포 연락처 이벤트는 두 세포 유형을 혼합하여 몇 군데있다, 그리고 지속적으로 상호 작용의 적절한 단계에서 serendipitous 세포 연락처를 찾을 수있는 필드의 전망을 검사합니다. 이러한 이벤트의 확률적 특성은 지루한이 프로세스를 렌더링하고,이 접근법에 의해 세포 - 세포 접촉 초기 또는 덧없는 이벤트를 관찰하기가 어렵습니다. 이 방법은 접촉의 가장자리에있는 셀 쌍을 발견하고, 그들은 완전의 연락처까지 그들을 관찰 필요하거나하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 문화의 세포를 위치로 비침습, 비 - 파괴적인, 그러나 신속하고 효과적인 방법으로 광학 트래핑을 사용합니다. 광학 트랩, 혹은 광학 핀셋은 점점 삼차원 4 셀 및 기타 마이크론 크기의 입자를 캡처하고 육체적으로 조작하는 생물 학적 연구에 활용하고 있습니다. 방사선 압력 먼저 관찰 1970 년 5, 6의 광학 트위터 시스템에 적용하고, 첫번째 1987 7 생물 학적 표본을 제어하는 데 사용였습니다. 이후, 광학 핀셋은 생물학적인 현상 8-13 다양한 탐사하는 기술로 성숙했습니다. 우리는 진보로 결정 호스트 세포와 상호 작용을 촉진하는 생리적 환경에서 병원성 생물의 아름다운 공간과 시간적 제어를 제공하기 위해 온도 및 습도 제어 디스크 공촛점 현미경을 회전과 함께 광학 트랩을 통합하여 세포 이미징을 살고 방법 14 설명 연산자. 라이브, immunocompromised 개인 15, 16 (예 : AIDS, 화학 요법 및 장기 이식 환자)에서 잠재적으로 치명적인, 침략 감염을 일으킬 수 캔디다 albicans와 Aspergillus fumigatus, 같은 병원성 미생물은 광학에 인접한 비파괴 레이저 농도를 사용하여 갇혀 이동되었습니다 병원체를 phagocytose 수 macrophages. 고해상도는 빛과 형광 기반의 동영상을 전송 살아있는 세포의 phagocytosis의 초기 이벤트를 관찰할 수있는 능력을 만들었습니다. 면역학의 광범위한 적용을 설명하기 위해, 기본 T - 세포는 또한 갇혀 있단에 반대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 microspheres와 시냅스를 형성 조작 및 버렸네 형성의 시간 저속 영상도 얻은되었습니다. 면역 세포에 관하여 사는 병원균의 훌륭한 공간적 제어를 발휘하는 방법을 제공함으로써, 세포의 상호 작용은 세포에 최소한의 섭동과 형광 현미경에 의해 캡처 수 있으며, 타고난과 적응 면역 반응의 초기에 강력한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K 조회수.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. 방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.

비디오: Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

연구

면역학 및 감염병학

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...