우리는 도움이 토론 패트릭 헤이든 (MatTek)을 감사하고, 로버트 스미스와 그 EM 기술에 대한 조지아 보건 과학 대학의 리비 페리 것입니다. 이 연구는 아빠 NIDCD 부여 DC010187에 의해 투자되었다

1. EpiAirway 조직에 대한 biosafety 캐비닛 준비 <ol><li> 다시 장갑 묶인 머리, 전용 실험 복을 입고, 층류를 시작합니다. 오분 후, 한쪽으로 캐비닛 (pipettors, 팁, 원심 분리기 튜브 등)에 도구를 이동, 스프레이 70 % 에탄올과 깨끗한 종이 타월로 닦아 아래와 biosafety 캐비닛 내부 및 창틀. 70 % 에탄올로 다시 청소 인테리어 스프레이 건조에 둡니다. 깨끗한쪽으로 도구를 이동하고 에탄올 절차를 반복하십시오. </li><li> 캐비닛의 에어로졸 장벽 피펫 팁 및 전용 pi​​pettors을 사용합니다. 개별 포장된 멸균 serological pipettes를 사용하려면, 폐기 포장 밖을 층류를 통해 연결 끝에 합격 깨면, 그리고 캐비닛에 피펫을 슬라이드. </li><li> EpiAirway 삽입은 무균 포셉으로 취급해야합니다. 플레이스 6 인치 미세 팁 곡선 자체 밀봉 살균 파우치와 압력솥에 집게를 해부. 사용하기 위해 최소한 6 하루 준비가있을 정도로 준비합니다. </li></ol> 2. EpiAirway 조직을 풀고 <ol><li> 70 % 에탄올로 biosafety 캐비닛에 작업 표면을 스프레이 깨끗한 종이 타월로 아래로 닦으십시오. 다시 스프레이와 표면을 사용하기 전에 건조 수 있습니다. EpiAirway 상자를 열고 스티로폼과 포장 재료를 폐기하십시오. </li><li> EpiAirway 항생제없는 유지 보수 언론, AIR - 100 - MM ABF (MM)는 MatTek 독점하고 삽입과 키트에 전송됩니다. biosafety 캐비닛, 미디어 유형과 날짜와 라벨이 여섯 무균 50 ML의 원심 분리기 튜브를하고 뚜껑을 느슨하게에. 70 % 에탄올로 미디어 병을 스프레이와 캐비닛 내부 엽니다. 각각의 튜브에 대한 새 살균 serological 피펫을 사용하여 각 튜브로 나누어지는 MM 25 ML, 4 ° C.에있는 뚜껑과 상점을 강화 매일 MM의 신선한 나누어지는을 사용합니다. </li><li> 1 X Dulbecco의 새로운 병 인산염 버퍼 칼슘, 마그네슘과 호수 (D - PBS)를 사용하여 위의 2.2를 반복합니다. 칼슘, 마그네슘없이 D - PBS를 사용하여 다시 반복합니다. 4 모든 aliquots를 저장 ° C. </li><li> EpiAirway 삽입 AIR - 100 ° C 고체 미디어 포함된 아가로 오스를 4에서 24 잘 판에 도착하고, 사용을위한 6 자 접시에 배치해야합니다. 에탄올 방지 마커를 사용하여 날짜와 설명 각 접시 라벨. 각 우물에 4 ° C EpiAirway의 MM 장소 1 밀리리터. 포장, 70 % 에탄올로 스프레이하고, biosafety 캐비닛의 위치에서 전송 플레이트를 제거합니다. 테이프를 제거하고 접시를 엽니다. autoclaved 집게를 사용하여 EpiAirway 삽입 위에 젖은 거즈를 제거합니다. </li><li> 6 잘 판의 우물에 아가로 오스에서 출시에 도움을 왜곡 움직임을 사용하여 autoclaved 포셉로 삽입하고, 장소를 선택하십시오. 어떤 아가로 오스는 전송 판의 온도가 주위에 증가 특히 같이 삽입을 준수합니다. 조심스럽게 삽입에서 아가로 오스를 제거하는 살균 면봉을 사용합니다. 멤브레인를 감동하지 않도록하고, 기포가가 삽입 아래에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 5% CO 2 humidified 37 ° C 배양기에 플레이트를 놓습니다. </li><li> 공동 문화를 시작하기 전에 인큐베이터에서 평형에 조직을 위해 최소 24 시간을 허용하십시오. </li></ol> 3. EpiAirway 조직의 유지 보수 <ol><li> autoclaved 집게를 사용하여 삽입을 선택하고 부드럽게 조직에 칼슘과 마그네슘으로 미리 예열 D - PBS 200 microliters을 피펫하고 삽입을 바위. 각도로 삽입을 기울이기 및 삽입의 하단에있는 멤브레인를 보유하고있는 플라스틱 고리로부터 무균 P1000의 피펫 팁을 넣으십시오. 조직을 만지지 마십시오. D - PBS는 씻어 표시 살균 cryovial에 장소 대기음. 샘플은 -20 ° C에서 냉동하고 나중에 mucin 및 / 또는 시토킨 표현 assayed 수 있습니다. </li><li> aspirating 신선한 MM 1 밀리리터로 대체하여 매일 기초 MM을 변경합니다. 각 잘에 대한 새 벽 피펫 팁을 사용합니다. 하루 10 %의 표백제로 사용되는 미디어를 취급하고 폐기. </li></ol> 4. EpiAirway 조직의 접종 <ol><li> 초콜릿 한천에 냉동 글리세롤 주식의 nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHi)의 새로운 문화를 밖으로 승리. humidified 5% CO 2 배양기에서 하룻밤 성장. </li><li> 그 다음날, 약 0.7의 OD (600 NM)에 칼슘과 마그네슘으로 미리 예열 D - PBS에서 NTHi의 한 식민지 resuspend. 적극적으로 사전 광학 밀도를 측정하는 소용돌이. 로 광학 밀도의 관계 식민지 - 성형 NTHi의 ML (CFU / ML) 단위당 것은 0.2의 OD가 (600 NM) 약 1.0 × 10 8 CFU / ML과 상통한다는 것입니다. 따라서 0.7의 OD (600 NM)는 3.5에 대한 X 10 8 CFU / ML입니다. 이 알고리즘은 접종하기 전에 각 NTHi 변형에 대한 검증해야합니다. </li><li> EpiAirway 조직은 AIR - 100는 0.6 cm 2 0.4 미크론 막의 표면적과 삽입에 성장하고 있습니다. 조직은 ~ 8.0 × 10 5 ~ 1.0 × 10 6 구성되어있다 &lt;/&gt; 세포를 한모금. 12 - 따라서, 1.0 X 10 7 CFU의 접종 약 10 감염의 다중성에 해당합니다. 예방, 3.1에서와 같이 각 EpiAirway 삽입을 린스, 다음 biosafety 캐비닛의 각 EpiAirway 인서트의 혀끝의 표면에 4.2 준비 세균성 정지 28 microliters를 추가합니다. 기초 MM의 예방하​​지 마십시오. 보육 각 접시를 반환합니다. </li></ol> 5. NTHi inoculum의 부량 <ol><li> 소독으로 0.1 % 젤라틴 (PBS - G), 압력솥과 인산염 버퍼 호수 (PBS) 솔루션을 준비합니다. 각각의 튜브에 멸균 PBS - G의 inoculum과 나누어지는 900 microliters의 OD (600 NM)에 따라 원하는 1시 10분의 dilutions와 라벨 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브. </li><li> 주사 NTHi를 열거하는 데 필요한 초콜릿 한천 플레이트의 수를 결정합니다. 한 시간 만이라도 상단의 절반에 휴식 접시의 바닥과 거꾸로 공기 인큐베이터에서 이러한 접시를 놓습니다. 이것은 접시가 모두 37 따뜻한 ° C와 NTHi의 드롭 도금을 촉진, 건조 표면.하실 수 있습니다 </li><li> 4.2에서 첫 번째 튜브로 세균성 정지 100 microliters을 추가하여 inoculum의 일련 1시 10분 dilutions를 시작합니다. 와동은 각 희석을 다해 5 초 동안 이전 다음 서비스를 제공하는 방법을. 각 희석의 절반 접시를 사용하여 미리 예열 및 표면 건조 초콜릿 한천 플레이트에 10 microliter의 aliquots 버려. 5 ~ 6 10 microliter의 aliquots 함께 실행하지 않고 각 100mm 판의 절반에 들어갈 수 있습니다. 언제 거꾸로 humidified 37 건조, 장소 ° C CO 2 배양기 하룻밤. </li><li> 그 다음날, 각 드롭 15-30 뚜렷한 식민지를 dilutions을 계산하고 NTHi의 실제 가능한 inoculum 다시 계산하여 CFU / ML을 결정합니다. </li></ol> 6. NTHi와 장기 공동 문화 <ol><li> 다음, -20에서 박테리아와 동결 같은 변형 ° 향후 분석을 위해 표시 cryovial에 C와 주사되어 각 조직의 세탁을 풀 3.1에서와 같이 24 시간마다는 삽입 씻으십시오. 이 샘플은 도트 blots에 의해 mucin의 존재 또는 엘리사에 의해 크린 시토킨의 표현에 대한 assayed 수 있습니다. 또한, 조직은 mRNA에 대한 수확 수 있으며 qPCR는 관심의 유전자에 수행할 수 있습니다. 3.2에서와 같이 매일 기초 MM을 변경합니다. 공동 문화의 기간 동안 계속합니다. </li></ol> 7. EpiAirway 조직의 수확 <ol><li> 칼슘, 마그네슘없이 D - PBS에서 사포닌의 신선한 1 % 솔루션을 준비, 필터 소독 및 37 ° C.에 따뜻한 </li><li> 37 ° C.에 칼슘, 마그네슘없이 MM 및 D - PBS의 다른 50 ML 튜브를 따뜻하게 </li><li> 5.1로 희석 튜브를 준비뿐만 아니라 삽입 번호와 NTHi 변형으로 표시 삽입 당 하나의 빈 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브. </li><li> EpiAirways은 자기편과 internalized 생물, 아니면 internalized 박테리아를 모두 포함하는 총 셀 관련 박테리아 중 하나에 대한 수확 수 있습니다. </li><li> 드롭 판 휴대 관련 또는 5.2과 같은 NTHi, 공기 인큐베이터에서 한 시간 동안 라벨과 건조를 침공. 필요한 초콜릿 한천 플레이트의 수를 결정 </li><li> 총 세포 관련 박테리아를 수확, 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 200 microliters로 세 번 EpiAirways의 혀끝의 표면을 씻어 다음 삽입을 기울 및 기저 막에서 남아있는 MM를 헹굴. 최초의 세척은 나중에 분석을 위해 냉동 수 있으며 다음과 세척을 삭제. </li><li> 각 조직의 꼭대기의 표면에 7.1에서 멸균 1퍼센트 사포닌 솔루션의 세탁 MM없이 신선한 6 잘 판에 삽입하고, 피펫 250 microliters를 놓습니다. 10 분 인큐베이터로 돌아가기. </li><li> 인큐베이터에서 제거하고, 멸균 P1000 피펫 팁을 사용하여 사용하여 백업 및 규정 모션, 삽입의 가장자리에서 조직을 제거하는 원운동 다음을 막의 조직을 씻어. 큰 구멍 살균 P1000의 피펫 팁을 사용, 7.3에서 준비한 빈 튜브 라벨에 정지를 놓습니다. 삽입의 혀끝의 표면에 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 250 microliters를 추가합니다. </li><li> 수확으로 남아있는 조직이 있는지 확인하기 위해 거꾸로 위상 대비 현미경을 사용하여 삽입을 검사합니다. 필요한 경우, 다른 살균 P1000 피펫 팁로 다시 스크럽, 다음 큰 구멍 살균 P1000의 피펫 팁을 사용하여 7.8에서 관이 정지를 추가합니다. 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS를 사용하여 1 밀리리터로 튜브의 전체 볼륨을 가져와. </li><li> 일분 최고 속도에 적극적으로 와동 세포 현탁액. 26 게이지 바늘로 장착되어 살균 한 ML의 주사기를 사용하여 주사 바늘을 통해 주사기로 정지를 대기음. 천천히 거품을 만들 수 없습니다 간병, 바늘 3 회를 통해 현탁액을 전달합니다. 일분 적극적으로 다시 소용돌이. </li><li> 7 준비 첫 번째 희석 튜브에 큰 구멍 피펫 팁, 장소 정지 100 microliters을 사용합니다.3. 와동을 다해 초 동안 다음, 시리얼 1시 10분 dilutions합니다. 표면 건조 초콜릿 한천 플레이트에 드롭 판 원하는 dilutions. </li><li> internalized 세균만을 수확, 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 200 microliters 각각 삽입에게 3 회 씻는다. 첫 번째 세차를 유지하고 냉동. 100 마이크로 그램 / ML의 최종 농도로 미리 예열 MM에 gentamicin 황산을 추가합니다. 수확으로 삽입할 당 미디어 1.5 ML를 준비합니다. gentamicin 함유 MM과 기초 MM를 교체하고, 혀끝의 표면에 gentamicin 함유 MM 300 microliters를 추가합니다. 한 시간 만이라도 다시 CO 2 배양기에 플레이트를 놓습니다. </li><li> 혀끝의 표면에서 gentamicin 함유 MM를 제거하고 혀끝의 표면과 칼슘, 마그네슘없이 사전 예열 D - PBS로 광범위하게 삽입 기저 막 씻는다. 7.7-7.11와 같이 진행합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : NTHi과 함께 5 일간의 공동 문화를 후 (A.) 감염되지 않은 EpiAirway 조직 및 (B.) 조직의 전자 micrographs를 스캔은 그림 1에 표시됩니다. NTHi와 장기 공동 문화가 혀끝의에 상당한 손상되지 않습니다 조직, EpiAirway 모델의 유틸리티를 강조. 조직 내부 시간이 지남에 따라 계량 internalized 박테리아의 숫자를 묘사한 그래프는 그림 2에 표시됩니다. 두 결과가 매우 재현할 수 있으며, EpiAirway 조직하고 일관성 있고 인간 상부기도의 체외 모델에서 생물학 관련 공부하는 NTHi 호스트 병원체 상호 작용. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. EpiAirway 조직의 전자 현미경을 검사합니다. A. 감염되지 않은 제어 조직. NTHi 공동 문화의 5 일 후에 B. 조직. 혀끝의 표면에 대한 중대한 손상은 감염 조직에서 관찰되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. NTHi 개수 EpiAirway의 공동 문화 중에 시간이 지남에 따라 internalized. 스트레인 R2866은 다음 각 지정된 시점에서 internalized 박테리아에 대한 수확 약 1.0 X 10 7 CFU / 삽입 (데이 0)에서 주사를했다. 바 = 3이 최소한의 중복 복제 N를 나타냅니다. 오류 막대는 SD 있습니다.

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	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 방법은 허용하는 공기 - 액체 인터페이스에서 기본 인간의 호흡기 조직의 생물학 관련 배경으로 장기 호스트 병원체 상호 작용의 조사. 여기서 우리는 감염 유기체로 NTHi를 사용해야하지만, 시간이 지남에 따라 허용되지 않는 세포 독성을 소개하지 않는 박테리아의 상호 작용이 방법으로 계량하실 수 있습니다. EpiAirway 모델은 또한 바이러스, 약물, 또는 화학 물질에 영향을 인간의 상부기도 <su...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 사포닌 </td><td> Calbiochem </td><td> 558255 - 25GM </td><td> 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS에 1 %, 소독 필터 </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco의 칼슘, 마그네슘과 생리 인산염은 버퍼 </td><td> Lonza </td><td> 17 - 513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco의 칼슘이나 마그네슘없이 생리 인산염은 버퍼 </td><td> Lonza </td><td> 17 - 515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway 항생제없는 조직 </td><td> MatTek </td><td> AIR - 100 - ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway 항생제없는 유지 보수 미디어 </td><td> MatTek </td><td> AIR - 100 - MM - ABF </td><td> 키트와 함께 제공된 </td></tr><tr><td> 10X 인산염 버퍼 생리 식염수 </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1X로 희석 사용하기 전에 </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> JT 베이커 </td><td> 2124-01 </td><td> 1 X PBS 및 압력솥에 0.1 %의 최종 농도에 추가 </td></tr><tr><td> Difco GC 매체 자료 (초콜릿 한천 배지) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> 압력솥 36 500 ML ddH 2 O에서 g와 60 쿨 ° C </td></tr><tr><td> BBL의 혈색소 (초콜릿 한천 배지) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60 쿨 500 ML ddH 2 O에서 압력솥 10g, ° C 이상 GC 매체 기반으로 믹스 </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX 농축 (초콜릿 한천 배지) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> ° C와 rehydrated IsoVitaleX 10 ML을 추가, 초콜릿 한천 플레이트를 부어 55 GC 매체 기지와 헤모글로빈의 혼합물을 쿨 </td></tr><tr><td> 해부 포셉, 좋은 팁이 곡선 </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> 자체 밀봉 살균 파우치 </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin 황산, 10 MG / ML </td><td> Lonza </td><td> 17 - 519Z </td><td> gentamicin 죽이기 위해 EpiAirway의 MM 10 microliters / ML 추가 </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

2; Nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHi)는 호흡기 점막 1 반복 및 만성 감염을 일으킬 수 인간 적응 그람 음성 세균 있습니다. 이러한 생물은 호흡 조직 및 내부 생존하는 메커니즘, 박테리아와 인간 세포의 성공적인 장기 협력 문화가 필요합니다 수행할 수있는 모델을 연구한다. 우리는 공기 - 액체 인터페이스에 제기된 주요 인간의 호흡기 상피 조직을 사용 EpiAirway 모델 (MatTek, 애쉬 랜드, MA). 이들은 꽉 분기점, 속눈썹이있는 세포와 nonciliated, mucin를 생산하고, 감염에 대한 응답으로 크린 시토킨를 생산하는 능력을 유지 고블렛 세포를 포함하지 않는 불후의, 잘 차별, 3 차원 조직입니다. 인간 상부기도의 체외 모델에서 본 생물학 관련은 여러 가지 방법으로 사용할 수 있으며이 방법의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 NTHi과 quantitate와 EpiAirway 조직의 장기 공동 문화 셀 - 관련 및 internalized 박테리아를 수행하는 것입니다 . 뿐만 아니라, 공동 문화 감염의 mucin 생산 및 시토킨 프로필이 결정하실 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 많은 현재의 프로토콜의 기존 방법에 따라 개선 연장 기간 세 이상의 세균 감염을 지원하지 않습니다 인간의 세포의 잠수 monolayer 또는 트랜 스웰 문화를 사용합니다. 유기체가 overlying 미디어에 복제할 수있다면 예를 들어,이 실험을 체포, 세포 독성 및 호스트 세포의 손실 허용되지 않는 수준이 발생할 수 있습니다. EpiAirway 모델은 장기 호스트 병원체 상호 작용의 특성을 허용합니다. EpiAirway에 대한 소스가 오히려 불후의 라인보다 일반적인 인간 tracheo - 기관지 세포이기 때문에 또한, 각 구조와 기능 4 모두 실제 인간의 상부 호흡기 트랙트 조직의 훌륭한 표현이다. 이 방법은 EpiAirway 조직은 이전에 배달 2 일 안티 - 미생물 및 안티 곰팡이 화합물의 젖을에서, 모든 절차는 항생제가없는 조건에서 수행됩니다. 이것은 모두 박테리아와 인간의 기본 조직은 동일한 biosafety 캐비닛에 사용되므로, 특별 고려 사항을 요구하고, 오랜 시간 동안 공동 양식입니다.

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

이 방법은 EpiAirways, 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 기본 인간의 호흡기 상피 조직, 생물학 관련 공동 문화 확장 박테리아의 특성을 허용<em&gt; 체외에서</em&gt; 모델입니다. 접근 방식은 공동 문화 장기 의무가있는 모든 미생물과 함께 사용할 수 있습니다.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K 조회수.  Mercer University School of Medicine. 이 방법은 EpiAirways, 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 기본 인간의 호흡기 상피 조직, 생물학 관련 공동 문화 확장 박테리아의 특성을 허용 체외에서 모델입니다. 접근 방식은 공동 문화 장기 의무가있는 모든 미생물과 함께 사용할 수 있습니다.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

연구

면역학 및 감염병학

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

초파리 번데기 내에서 염증 성 세포 역학의 장기 Vivo에서 추적

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...