이러한 면역조직화학및 조직병리학 프로토콜은 엽산 수용체 베타를 검사하는 데 사용될 수 있는데, 이는 거대 세포 동맥염의 혈관 미세 환경에 대한 잠재적 예후 및 치료적 가치를 가진 후보 단백질이다. 이 프로토콜은 시간 테스트 및 널리 사용 되 고 임시 동맥 조직에서 엽산 체 베타 속성을 탐구 하는 데 사용할 수 있습니다., 장기 저장 후. 조직 섹션을 획득하려면 마이크로토메를 사용하여 파라핀임베디드 측두동맥의 4~5마이크로미터 두께의 부분을 슬라이스하고, 각 섹션을 40도 의 수조에 띄우고 주름을 제거합니다.
유리 현미경 슬라이드를 사용하여 슬라이드 당 3 개의 섹션을 캡처하고 60 분 동안 섭씨 60도 오븐에서 온전한 접시에 슬라이드를 데우십시오. 섹션이 슬라이드를 부착하면 슬라이드를 수직 랙에 넣고 24시간 동안 섭씨 37도에서 건조합니다. 다음 날 슬라이드를 슬라이드 컨테이너로 전송하여 섭씨 4도에서 최소 12시간 동안 보관합니다.
다음으로, 슬라이드 랙에 로드 슬라이드를 로드하고 2 개의 5 분, 100 % 자일렌 몰입 및 내림차순으로 조직을 수화하고, 농도 에탄올 몰입 시리즈당 5 분, 30 초마다 10 초의 교반을 합니다. 70%에탄올침림 후, 슬라이드를 5분간 양적 증류수로 두 번 헹구고 30초마다 10초의 교반을 합니다. 항원 회수의 경우 랙을 섭씨 95도의 200 마이크로리터, 리터당 10 밀리미터가 30분 동안 유리 용기에 옮기습니다.
인큐베이션이 끝나면 슬라이드가 실온으로 20분 간 식히고 5분 동안 흐르는 물로 헹구십시오. 내인성 과산화효소 활성을 제거하기 위해, 먼저 각 조직 샘플 주위에 원을 그리는 소수성 마커를 사용하여 10 분 동안 과산화수소 3 %의 200 마이크로 리터로 샘플을 배양한 다음 3 개의 세척당 3 개의 미콜리터에 3 개의 세척이 뒤따릅니다. 마지막 세척 후, 각 슬라이드를 부드럽게 두드려 여분의 버퍼를 제거하고 관심있는 1 차 항체 칵테일의 200 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 습한 챔버에서 1 시간 배양을 위해 각 슬라이드에 커버 슬립을 넣습니다.
인큐베이션이 끝나면 커버 슬립을 버리고 슬라이드를 신선한 TBSS에서 2분 동안 세번 으로 헹립니다. 초과 버퍼를 제거한 후 적절한 바이오타이니드 이차 항체 용액의 200마이크로리터와 각 슬라이드에 커버 슬립을 추가하여 실온에서 습한 챔버에서 45분 간 배양합니다. 커버 슬립을 폐기한 후, 입증된 대로 TBSS로 슬라이드를 헹돌립니다.
초과 버퍼를 제거합니다. 그리고 실온에서 10 분 동안 DAB 기판 버퍼의 200 마이크로 리터로 섹션을 레이블. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 TBSS와 흐르는 수돗물로 10분 간 세척한 후 헤마톡슬린과 3분간 대응합니다.
그런 다음 각 슬라이드에 적절한 장착 매체의 70 마이크로리터를 추가하고 천천히 유리 커버 스트립을 장착 매체에 팁을 주어 커버 슬립이 제자리에 낮아질 때 거품을 만들지 않도록 합니다. 조직 병리학 적 분석을 위해, 가벼운 현미경의 단계에 슬라이드를 배치하고 첫 번째 조직 섹션의 혈관 아키텍처를 평가한다. 그런 다음 섹션당 림프구 수에 비해 대식세포의 수를 정량화합니다.
면역조직화학적 분석을 위해, 각 조직 섹션에서 엽산 수용체 베타 염색 패턴을 검사하고 엽산 수용체 베타 양성, CD68 양성 및 CD3 양성 세포의 수를 섹션당 무작위로 선택된 10개에서 정량화한다. 정상적인 표본에서 헤마톡린과 에신 염색은 투니카 내티카내내피나 내피 세포, 튜니카 미디어의 매끄러운 근육 세포, 그리고 투아의 바사 혈관이라고 불리는 섬유아세포및 피더 혈관을 포함하는 이질성 콜라겐 매트릭스와 함께 정상적인 동맥 해부학을 나타낸다. 거대 세포 동맥염 양성 측두동맥은 중등도에서 중증 염증, 또는 히시오시테, 림프구, 간헐적인 혈장 세포 및 다중 핵거대 세포를 보여줍니다.
발광 협개도 지적되며, 내부 탄성 라미나(lamina)의 90%의 내장 및 방해가 수반됩니다. CD3 양성 림프구 및 CD68 양성 대식세포는 모든 거대 세포 동맥염 양성 표본에도 존재하며, 모든 생검에서 유사한 염색 패턴이 관찰된다. 엽산 수용체 베타를 위한 염색은 대식세포 및 다핵거대 세포로 제한되며, 이는 재래시 및 미디어에 우선적으로 국한된다.
특히 엽산 수용체 베타는 전체 대식세포의 약 30%를 구성하였다. 측두동맥 생검 처리, 절단 및 탈왁스는 후속 단계를 수행하기 위해서는 신중한 손재주가 필요합니다. 슬라이드 해석은 숙련 된 심장 혈관 병리학자의 전문 지식을 필요로합니다.
표본과 시약을 취급할 때 장갑과 통풍후드와 같은 접촉 및 호흡 예방 조치를 사용하도록 시청자에게 상기시킵니다.
