생체 내 식세포 분석에서 이것은 연구원이 성인 혈액 세포에 있는 phagocytosis를 통제하는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 유전 스크린 및 게놈 전체 협회 연구 결과를 실행하는 것을 허용합니다. 본 실험은 정량적이고, 수행하기 쉬우며, 병원균 인식, 섭취 및 통관에 영향을 미치는 숙주 요인에 대해 살아있는 동물의 선별에 적용될 수 있다. 바늘 풀러와 얇은 벽 유리 모세 혈관을 당긴 후, 현미경에서 바늘을 잡고 마이크로 미터를 사용하고, 번호 5, 미세 점, 스테인레스 스틸 핀셋을 사용하여 팁을 100 마이크로 미터 팁 직경으로 부수습니다.
각 비행에 주입될 액체의 양을 측정하기 위해 PBS에서 멸균 5%의 식품 착색으로 모세관 바늘을 적재하고 0.01mm 단계 마이크로미터에 미네랄 오일 한 방울에 액체를 추방합니다. 밀리리터 입자당 1.6밀리리터10마이크로리터를 작은 파라필름 사각형에 분배하고 액체를 바늘로 당깁니다. 바늘을 인젝터 노즐에 장착하고, 마취된 파리를 플라이 패드의 지정된 영역을 따라 줄을 서서, 복부 쪽은 패드 의 앞쪽을 향합니다.
벤치에 해당 영역에 바이알을 배치하고, 총 입자의 약 10 나노 리터를 제공하기 위해 액체의 5, 100 밀리초 펌프와 복부의 상단 모서리에 파리를 주입. 각 비행이 주입될 때 적절한 바이알로 전송하여 바이알의 시간을 지적합니다. 다음으로, 0.4%의 Trypan Blue 용액으로 새 바늘을 적재하고 공압 인젝터를 게이트에 설정하여 공기의 일정한 흐름이 바늘에서 액체를 밀어 낼 수 있도록 합니다.
초기 주사 후 30 분, 복부가 가득 하고 불경해 할 때까지 Trypan Blue로 각 비행 복부를 주입하십시오. 전기 테이프, 복부 측면으로 현미경 슬라이드에 파리를 장착하고 날개를 플라이 의 측면으로 밀어 테이프에 고정하십시오. 그런 다음 머리를 테이프에 부드럽게 밀어 넣고 비행이 움직이지 않도록 합니다.
모든 파리가 확보된 직후, 디지털 카메라와 컴퓨터에 부착된 반전형 형광 현미경에 한 번에 하나씩 곤충을 이미지하여 디지털 카메라용 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 각 비행의 등쪽 용기에 초점을 맞춘다. 그런 다음 실험 간의 노출 시간과 배율을 기록합니다. 형광을 정량화하려면 적절한 이미징 분석 프로그램을 열고 하나의 이미지를 엽니다.
등쪽 용기의 형광 강도를 측정하려면 등쪽 용기 주위에 다각형을 그리고 측정을 선택하여 다각형 내부의 형광 강도를 기록합니다. 배경 형광 강도를 확인하려면 첫 번째 다각형을 복사하여 각 플라이의 등류 용기에 인접한 영역으로 이동합니다. 그런 다음 측정값을 선택하고 배경 영역의 형광 강도를 기록합니다.
등광에 의해 등광을 원동형으로 정상화시키고, 나머지 파리의 형광 강도를 측정한 후, 등류 혈관형광을 배경 형광에 의해 분할하고, 모든 파리의 평균 정규화된 등산혈관 형광 강도를 하나의 변형으로 계산한다. 전기 테이프 에 복부 측면을 아래로 장착 한 후, 등쪽 용기가있는 복부의 처음 두 세그먼트는 명확하게 볼 수 있습니다. 실험 오류의 주요 소스는 절차의 주입 및 이미징 단계에서 발생합니다.
동일한 바늘을 사용하여 여러 개의 파리를 주입하면 플라이 조직이나 입자로 막힐 수 있습니다. 전체 복부전체에 걸쳐 충분히 Trypan Blue 형광을 충분히 받지 못하는 파리는 등류 용기의 배경 형광 비율을 감소시켜 동물의 실제 형광 강도 비율을 감소시킬 수 있습니다. 파리는 이산화탄소에 의해 고정된 상태에서 사진을 찍어야 하며, 적극적으로 움직이는 파리는 정량화할 수 없는 흐릿한 이미지를 생성합니다.
에틸 메탄술포네이트 처리 된 파리의 Zuker 컬렉션에서 돌연변이 라인은 그람 음성 및 그램 양성 박테리아를 phagocytose 할 수 없으며 생체 내 phagocytosis 분석에서 거의 등색 용기 형광을 표시하지 않으며, 동종 배경 주커 균주와 다른 일반적인 실험실 제어 변형에 짝을 이룹니다. 파리가 이미지화 될 때 병원균 인식 및 섭취의 유사한 단계에 있는지 확인하기 위해 파리가 주입되는 시간과 순서를 추적하십시오. 식세포 결함의 근본적인 분자 메커니즘은 공초점 현미경 검사법을 가진 단 하나 혈구를 연구하거나 형광 활성화 세포 분류 후에 또는 성인 혈구의 자기 비드 절연에 의해 결정될 수 있습니다.
