이 프로토콜은 거대 소포 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하기위한 수단을 제공합니다. 거대한 소포를 개발하는 것은 쉽고, 소포를 준비하기 위해서는 매우 적은 양의 샘플 솔루션만 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 학위 후보인 유리 오타(유리 오타)가 될 것입니다.
먼저 갓 준비된 POPC 용액 20마이크로리터와 갓 준비된 비오틴-PEG-DSPE 용액 4마이크로리터를 유리 바이알에 추가합니다. 지질 필름이 형성될 때까지 공기 흐름에 의해 유기 용매를 증발시다. 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1 시간 동안 건조기에 필름을 놓습니다.
그런 다음 바이알에 200 마이크로리터의 미네랄 오일을 추가합니다. 유리병의 오프닝을 플라스틱 파라핀 필름으로 덮고, 120와트로의 초음파 욕조에서 유리병 함량을 1시간 이상 초음파 처리합니다. 작은 소포 준비를 위해, 방금 입증 된 것처럼 지질 필름을 만들고 LB 배지에 200 밀리의 포도당 200 마이크로 리터를 필름에 추가하십시오.
그런 다음 적어도 한 시간 동안 120 와트로 필름을 초음파 처리한 다음 미니 압출기와 100 나노 미터 기공 크기의 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 생성된 거대한 소포를 작은 소포로 압출합니다. 세균성 세포 사전 배양을 위해, LB 플레이트에서 37°C에서 하룻밤 배양을 위해 LB 배지의 밀리리터로 대장균을 접종한다. 다음 날 아침, 문화권 상수 20마이크로리터를 신선한 LB 배지 1.98밀리리터로 2시간 더 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, 분광계에서 배양 전 용액의 600 나노미터 또는 OD 600 값의 광학 밀도를 확인한다. OD 600의 1~1.5의 사전 배양 솔루션을 사용해야 합니다. 그런 다음 표 에 따라 갓 준비 된 자당 용액과 신선한 LB 배지와 사전 배양 용액을 혼합합니다.
거대한 소포 형성을 위해, 1.5 밀리리터 뚜껑 플라스틱 튜브에 거대한 소포의 갓 준비 된 외부 수성 용액의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 지질 함유 오일 용액 150마이크로리터를 거대한 소포의 바깥 수성 용액 위에 부드럽게 레이어링합니다. 오일 및 수성 용액의 인터페이스가 평평한지 확인하기 위해 검사하기 전에 실온에서 10~15분 동안 생성된 솔루션을 배양합니다.
물방울 형성을 포함하는 물과 오일 세균 세포의 경우, 0.6 밀리리터 뚜껑 플라스틱 튜브에 초음파 지질 함유 오일 용액의 50 마이크로 리터에 거대한 소포의 갓 준비 된 내부 수성 용액의 두 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 탭하여 두 구성 요소를 유화합니다. 다음으로, 파이펫을 사용하여 오일 및 수성 용액의 인터페이스에 50 마이크로리터의 물과 오일 액슬을 추가하고 원심분리에 의해 세균세포 함유 거대 소포를 퇴적시한다.
그런 다음 상단 오일 층을 흡인하고 거대한 소포를 수집합니다. 수제 챔버를 준비하려면 7mm 구멍을 10-10에서 1밀리미터 양면 씰에 중공 펀치로 뚫은 다음 양면 씰을 30~40mm 커버 글래스에 붙여 넣습니다. 지원되는 이중 층 멤브레인을 준비하려면 소형 소포 용액 30 마이크로리터를 수제 챔버 구멍에 추가합니다.
실온에서 소포를 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 200 밀리밀러 포도당으로 보충된 LB 배지 20 마이크로리터로 홀을 두 번 부드럽게 씻습니다. 후원자 이중 층 멤브레인에 거대한 소포를 고정하려면 실온에서 15 분 동안 구멍에 외부 수성 거대 소포 용액에 10 마이크로 리터의 중성구를 소개합니다.
인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 20 밀리 밀러 포도당으로 보충 LB 매체의 20 마이크로 리터와 구멍을 두 번 세척하고, 챔버의 구멍에 거대한 소포 용액의 전체 볼륨을 추가합니다. 그런 다음 18 18mm 커버 유리로 구멍을 밀봉합니다. 거대한 소포 내의 세균 성장을 모니터링하려면 반전 된 현미경으로 40X 목표를 선택하고 현미경 가열 단계 시스템에 챔버를 배치하십시오.
그런 다음 37°C에서 6시간 동안 정전기 조건하에서 챔버내세균세포 함유 거대 소포를 배양하고, 30분마다 세균세포 성장의 이미지를 캡처하고 기록하며, 과학적 보완금속 산화물 반도체 카메라로 배양한다. 세균 세포를 포함하는 거대한 소포는 전형적으로 10에서 30 마이크로미터사이크기범위입니다. 거대한 소포의 두 크기에 대 한, 대장균 세포 는 신장 및 분열 과정을 겪고, 일부 대장균 세포는 6 시간 관찰 기간 동안 세포의 매우 큰 수로 성장.
단일 세포 수준을 포함하는 거대 소포의 상대적 주파수는 얻어진 거대 소포의 약 10%이며, 단일 세포 수준에서 캡슐화된 거대한 소포는 세균 세포를 포함하는 거대 소포의 약 50%이다. 오일-워터 인터페이스의 안정성은 세균 세포를 포함하는 거대한 소포를 얻는 데 중요합니다. 거대한 소포 보정 전에 조심스럽게 오일을 흡인주의하십시오.
이 비디오를 시청 한 후, 당신은 개별 거 대 한 소포 내에서 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양 하는 방법의 좋은 이해 해야. 우리의 세균 배양 방법은 그들의 신진 대사 제품을 얻거나 분석하기 위하여 알려지지 않은 환경 박테리아를 배양하기 위한 미생물학에 있는 새로운 공구입니다.
