Name: in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

이 작품은 퐁 voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k (FWO) 데런 G0466.10, 11I0113N에 의해​​ 지원되었다; 소아 심장과, UZ 루벤, 벨기에 &quot;에디 멕스 연구비&quot;와 &quot;SPORTA 연구 그랜트&quot;(JC); 분자 및 혈관 생물학 센터는 루벤 대학에서 &quot;Geconcentreerde Onderzoe​​ksacties&quot;(GOA 13분의 2,009)과 베링거 인 겔 하임의 연구 보조금에 의해, Programmafinanciering KU 루벤 (PF / 10 / 014)에 의해 지원됩니다.

동물 실험은 KU 루벤의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 체외 관류 및 생체 실험 1. 준비 박테리아 <ol><li> 우리는 미 사용 구균이 원고에 설명 된 모든 실험 변형 뉴먼을. S. 구균 뉴만는 -80 ° C에서 10 % 글리세롤로 뇌 심장 주입 (BHI)에 저장 하였다. </li><li> 37 ° C (OD&gt; 3 600)에서 / N을 얼어 붙은 박테리아를 긁어 5 ㎖의 트립신 간장 국물 (TSB) O에 접종 멸균 루프를 사용합니다. </li><li> 원심 분리 (2,600g, RT, 5 분)에 의해 박테리아를 세척하고 5 ml의 PBS (인산염 완충 식염수)에있는 박테리아 펠렛을 재현 탁. </li><li> 에탄올 5 (6) 카르복시 - 형광 N-히드 록시 숙신 에스테르 (카르복시 - 형광)의 1 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비합니다. 실험실 등급 물에 150 μg의 / ㎖로 1 ㎎ / ㎖ 카르복시 플루오 레세 인 용액 (예를 들어, 한 MilliQ 워터) 희석. 빛의 튜브를 보호-20 ° C에서 알루미늄 포일과 함께 가게. </li><li> (2600 XG, RT, 5 분) 박테리아를 원심 분리기. 800 μL PBS에 박테리아 펠렛을 재현 탁하고 200 μL 또는 150 μg의 / ㎖ 카르복시 형광 용액 400 μL (최종 농도 생체 실험 50 ㎍ / ㎖) (관류 실험 30 ㎍ / ml의 최종 농도)를 추가합니다. 알루미늄 호일로 광으로부터 튜브를 보호하고 쉐이커상에서 RT에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 표지 한 후, PBS에서 6 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 블록. </li><li> 광학 농도계를 사용하여 박테리아 (OD), OD 시험관 실험 0.65 600 희석 (과 외경 생체 실험 1.8 600 (약 3 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) 황색 포도상 구균에 대한 / ㎖에 해당) PBS에서 황색 포도상 구균 약 1 × 109 CFU / ㎖)에 해당. 알루미늄 호일로 빛으로부터 튜브를 보호하고 얼음에 둡니다. </li></ol> 2. 체외 관류 실험 <ol><li> 유리 Coverslips는의 코팅 <ol><li> 실험실 등급 물 폰 빌레 브란트 인자 (VWF) (P Haemate 재고 μg의 농도가 2400 / ml)로 희석를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 (증류 된 탈). </li><li> 160 μg / ML의 최종 농도로 (제조자에 의해 공급되는 SKF 용액의 pH 2.7-2.9) 등장 글루코오스 용액에 콜라겐을 희석. </li><li> 파라 필름에 코팅 200 μL 적하하고 액적 위에 커버 슬립을 배치함으로써 VWF 또는 콜라겐 코트 커버 글라스 (24 × 50mm). 액 커버 슬립의 표면을 따라 확산된다. </li><li> 실온에서 4 시간 동안 가습 용기에 커버 슬립을 품어. 조심스럽게 무딘 바늘로 파라 필름에서 된 커버를 들어 올립니다. 유량 용기의 바닥 부분에 커버 슬립을 탑재합니다. </li></ol></li><li> 플라스틱 코팅 내피 세포로 미끄러 <ol><li> 코트 플라스틱 전표(1 PCA 웰 세포 배양 챔버, Sarstedt의, 독일) PBS에 1 % 젤라틴 용액 1 ㎖와 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 젤라틴 코팅 된 플라스틱 전표에 씨앗 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) 및 70~80%의 포화 상태로 성장한다. 유량 용기의 바닥 부분에 플라스틱 슬립을 탑재합니다. </li></ol></li><li> 관류 실험 참고 : 체외 관류 모델의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. <ol><li> 다른 생리 학적 유동 조건을 시뮬레이션 2.5 다인 / cm 2 및 20 다인 / cm (2) 사이에 층류 전단 응력에서 마이크로 - 평행 판 유량 용기에 시험관 세균성 유착 과정을 수행한다. </li><li> 유량 용기 (자체 설계) 금속 프레임과 유기 유리로 만든 관류 실 (폴리 (메틸) 메타 크릴 레이트 (PMMA))로 구성되어 있습니다. 고정밀 주입 펌프 (2000 PHD 주입 하버드있어서, USA)에 연결하여, 우리는 플로우 (RA)를 생성 할 수있다0.0001 μL / 분, 220.82 ml / 분 사이 TES. </li><li> 유량 용기의 상부에 튜브를 연결하고 튜브에 매체를 삽입. 부드럽게 저부 위에 유동 챔버의 상부를 배치하고 유동 챔버를 조립한다. 공기 방울을 피하기 위해주의해야합니다. 챔버가 누출되지 않았는지 확인하고 여분의 코팅 용액을 제거 챔버를 통해 매체의 1 ml에 주입한다. 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 현미경 트레이에 37 ° C에서 열 제어 가열 패드에서 마우스를 놓습니다. 이 절차는 단말이기 때문에, 엄격한 asceptic 절차가 필요하지 않다. 경정맥 근처 절개를 부드럽게 자궁 근육의 오른쪽 측면을 제거하고 주변 조직으로부터 경정맥을 분리. </li><li> 주입 펌프 및 형광 현미경을 설정합니다. 주입 펌프 설정은 주사기의 직경과 원하는 유량 (2.4 절 참조)에 따라 달라집니다. 지금부터, 어두운 방에서 작동합니다. </li><li> VWF 코팅 : <ol><li> 형광 표지 된 세균을 채우고 주사기 주입 관에 연결. 공기 방울을 피하십시오. 10 분 동안 주입 펌프를 시작합니다. 주입 시간이 사용 전단 속도 및 코팅, 박테리아 배지에 따라 밀착성의 정상 상태를 표현한다. </li><li> 10 분 후, 주입 관을 PBS와 주사기를 연결하고 주입 펌프를 개시하여 결합되지 않은 세균을 씻어. </li><li> 세척 과정 후 다른 위치에서 적어도 15 이미지 나 동영상을 가져 가라. 박테리아에 초점을 작은 잠재적으로 어렵습니다. 시험 관내 유동 실험에 앞서, 적절한 초점면은 커버 슬립에 형광 표지 된 박테리아의 드롭을 배치하고 유동 챔버 커버 슬립을 배치하여 검색 될 수있다. 이어서, 적절한 초점 평면을 검색하고 설정을 저장한다. 주 : 시험 관내 유동 실험 기간 동안, 세정 공정 중에 이미지를 캡처 (± 시작 후 5 분) 만 보장 그런부착 세균에 대한 신호가 포착된다. </li></ol></li><li> 콜라겐 코팅 : <ol><li> 단지 관류를 시작하기 전에 형광 표지 된 박테리아에 60 μg의 / ㎖의 VWF를 추가합니다. 60 μg의 / ㎖로 보충 VWF 형광 표지 또는 형광 표지 된 박테리아 박테리아를 채우고 주사기 주입 관에 연결. 공기 방울을 피하십시오. 반복 2.3.5.2 2.3.5.3에 단계 </li></ol></li><li> 내피 세포 : <ol><li> 칼슘 -ionophore A23187의 0.1 mM의 용액으로 관류에 의해 내피 세포를 활성화하여 관류에 의해 10 분 동안 박테리아 관류 동일한 전단 속도에서 DMEM에서 (원액을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 용해 된 10 mM) 0.1 mm이다. 반복 2.3.5.3에 2.3.5.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 다음과 같이 전단 속도와 전단 응력을 계산합니다. 전단 속도 = 6Q / WH 2 : Q는 : W ml / 분의 속도, 흐름 : CM에서 폭, H : CM 높이 전단 응력 (τ) = 전단 쥐예 점도 (μ) 여기서 μ : 중간 : 0.01 다인 X 초 / ㎠, 전체 혈액 : 0.04 다인 X 초 / ㎠ </li><li> 이미지 분석 <ol><li> 흑백 카메라와 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 라이브 영상을 얻기 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 개발할 수 있습니다. 1.5 초의 노출 시간을 사용합니다. 무작위로 유량 용기의 코팅 된 표면에 걸쳐 여러 스냅 샷 (이상 15)을 가지고 해당 파일 형식으로 저장할 수 있습니다. </li><li> ImageJ에와 이미지 분석을 수행합니다. 관심의 기능에 그레이 스케일 이미지를 분할, 하부 및 상부 임계 값을 설정하는 임계 값을 정의 - 이미지 (빼기 배경 프로세스)에서 부드러운 연속 배경을 제거하는 배경을 뺍니다. 임계 값에 한정되는 영역을 측정한다. </li><li> 박테리아 부착을 비교 통계 분석 소프트웨어를 사용하여, 예를 들면 형광 영역으로 표현. 일방향 ANOVA 또는 t를 사용하여 그룹을 비교WO 꼬리 학생의 T- 테스트를. 평균 (SEM)의 평균 ± 표준 오차로 모든 값을보고합니다. 중요한 &lt;0.05의 P- 값을 고려 (* P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001). </li></ol></li></ol> 생체 장간막 관류 모델 3. <ol><li> 마우스의 제조 / 수술 <ol><li> 대변​​을 제한하기 위하여 실험 전날 밤 마우스를 빠르게. </li><li> 부 프레 노르 핀의 피하 주사 수술 전에 (0.1 ㎎ / ㎏ 체중 (BW)) 20 ~ 30 분으로 6-8 주 이전 마우스 (C57BL / 6) 수술 전 진통제를주십시오. </li><li> 복강 내 케타민 주사 (125 ㎎ / ㎏ BW)과 자일 라진 (12.5 ㎎ / ㎏ BW)에 의해 마우스를 마취. 페달 반사에 의해 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 적용합니다. </li><li> 현미경 트레이에 37 ° C에서 열 제어 가열 패드에서 마우스를 놓습니다. 이 절차는 단말이기 때문에, 엄격한 ascepti 필요 없다C 절차. 경정맥 근처 절개를 부드럽게 자궁 근육의 오른쪽 측면을 제거하고 주변 조직으로부터 경정맥을 분리. </li><li> 형광 표지 된 세균이나 다른 솔루션의 주입에 적합한 경정맥에 2 프랑​​스어 정맥 카테터를 삽입합니다. 중간 선 복부 절개를 통해 복강을 열고 mesenterium를 확산하기 위해 면봉을 사용하여 장간막 동맥과 세정맥 순환을 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 투명 플레이트에 오른쪽 마우스를 놓고 테이프로 캐 뉼러를 고정. 저체온증을 방지하기 위해 뜨거운 팩을 사용합니다. 조직의 탈수를 방지하기 위해, 창자에 500 μL 0.9 % NaCl을 놓습니다. </li></ol></li><li> 장간막 순환 세균의 유착 형광 현미경 <ol><li> 어두운 방에서 작업 할 수 있습니다. 혈관을 고정하고 거꾸로 현미경을 시각화하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 국소 10 mM의 솔루션 O 5 μl를 적용F 칼슘 -ionophore A23187 DMSO에 용해. 10 초 후, 경정맥 카테터를 통해 박테리아를 분류 100 μL (단계 1 참조)에 주입. 시간 경과 이미지를 가져 가라. 실험이 종료 된 후, 승인 기관 가이드 라인에 따라 마우스를 안락사. </li></ol></li><li> 이미지 분석 <ol><li> 흑백 카메라를 이용하고 이미징 소프트웨어를 사용하여 개발 캡처 반전 형광 현미경을 이용하여 실시간 화상을 얻기. 자동 노출 시간과 사용되는 장비에 특정 대비 최적화를 적용합니다. </li><li> 1,000 이미지 / 초 40주기를 사용하여 - 도구 모음의 &#39;취득&#39;도구 (시간 다차원 취득)를 사용하여 시간 경과 이미지를 획득. 해당 이미지 파일 포맷으로 이미지를 저장한다. </li><li> 이미지 당 형광 신호의 영역을 측정하는 ImageJ에 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리​​. F에 그레이 스케일 이미지를 분할하는, 상부 및 하부 임계 값을 설정하는 임계 값을 정의관심 eatures. 이자 (혈관)의 영역을 식별하고 상기 임계 관심 영역에 한정되는 영역을 측정한다. 세균 부착을 비교, 어떤 통계 나 그래프 소프트웨어를 사용하여 형광 영역으로 표현했다. </li></ol></li></ol>

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전단 응력은 혈관 벽에 초기 세균 접착 및 혈관 내 또는 심 내막 식생 및 전이성 감염 4,5의 다음 세대를위한 중요한 요소이다. 우리는 생리적 전단 응력에 따라 혈관 내 감염의 발병 기전을 연구하기 위해 생체 외 및 생체 내 모델에서 보완 설명했다. 이 모델은 우리가 주요 S.으로 폰 빌레 브란트 인자 결합 단백질 (vWbp)를 식별 할 수있다 구균 단백질은 VWF 4 노출 부상 혈관 벽 흐름에서 상호 작용할 수 있습니다. 혈관 내 감염, 특히 감염성 심내막염뿐만 아니라, 때문에 로컬 및 원격 ( &#39;전이&#39;) 합병증뿐만 아니라, 때문에 패혈증에 의한 장기 부전 및 사망의 우려이다. 심내막염과 전이성 감염을 일으키는 세균이 혈관 벽에 부착함으로써 흐르는 혈액의 전단 응력에 저항해야한다. 가장세균에 대한 연구는 요인 정적 조건에서 수행 된 독성. 그러나 이러한 설립 상호 작용은 세균 호스트 상호 작용의 새로운, 이전에 인식 할 수없는 요인을 밝힐 수 유량 조건에서 전단력과 연구를 견딜 수 있습니다. 마이크로 병류 챔버를 사용하여, 그리고 다른 혈관 접착 VWF의 중요성을 보여준다. 전단 응력에서 점진적가 전개 될 그 휴식 구형 구조에서 VWF하고는 GPIB 수용체 (6)를 통해 혈소판과 상호 작용 A1 도메인을 제공합니다. 흐름 챔버 광범위 혈소판 기능 (7)을 연구하기 위해 사용되었다. 놀랍게도, 또한 S. 유동하 구균 밀착성 전단에 노출 A1 도메인 VWF 필요하며, 특히. 우리는 vWbp는 VWF 바인딩 중재 확인했다. vWbp은 S.에 기여하는 응고 효소이다 호스트의 프로트롬빈을 활성화하여 구균의 병태 생리. Staphylothrombin, 입술세균 응고 효소와 프로트롬빈의 복잡한을 ulting, 불용성 섬유소 8,9에 피브리노겐을 변환합니다. 우리의 연구 vWbp 만 프로트롬빈을 활성화시키지 않는 것을 도시하지만, 유동 4,10,11 하에서 혈관 밀착성을 향상 박테리아 피브린 혈소판 집합체의 형성을 유발 하였다. 체외 유량 용기 모델은 세포 또는 매트릭스 구성 요소에 세균 부착에 다른 선수를 연구 할 수 있습니다. 박테리아 병원성 인자는 특정 표면 단백질을 발현하는 돌연변이 또는 무해한 균을 이용하여 연구 될 수있다. 대안으로, 약물 억제제 또는 차단 항체는 유동 챔버 내의 매질에 첨가 될 수있다. 그러한 세포 외 기질의 다른 구성 성분으로서 숙주 인자의 역할은 서로 다른 코팅으로 커버 슬립을 이용하여 연구 될 수있다. 커버 슬립은 활성화 상태가 특정한 자극을 추가하여 변조 될 수있는 내피 세포로 피복 될 수있다. 아파혈관벽에서 RT는, 숙주 세포 및 혈액 혈장 단백질의 기여는 유동 매체에 이들 인자를 첨가하여 연구 될 수있다. 따라서, 증가하는 복잡성의 다른 조건은 세균이 생체 내에서 혈관 벽에 부착 할 수 있도록 상호 작용을 해명 층류의 표준화 된 조건에서 연구 될 수있다. 체외 모델에서 확인 된 상호 작용은 이후 복잡한 유기체의 관련성을 테스트하기 위해 동물 모델에서 공부하고 있습니다. 흐름에 따라 동적 상호 작용을 연구하는 생체 내 모델에서 다른 하나는 같은 햄스터의 지느러미 피부 집계 챔버 (12)와 cremaster 모델 (13)로, 기술되었다. 이에 비해, 여기에서 설명 장간막 관류 모델 가능성 마우스의 유전 적 배경을 호스트 다양하고 약리 개입을 평가하기 때문에 사용의 용이성의 여러 가지 이점을 제공한다. 결론적으로, 모델 바와S의뿐만 아니라 표면 단백질을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다 구균,하지만 다른 호스트 배경에 다른 많은 미생물의 더 나은 혈관 감염의 발병 기전을 이해합니다.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table><tbody><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>fluorescent labeling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm collagen</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>collagen</td></tr><tr><td>1-well PCA cell culture chambers</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>plastic slips</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorphine</td></tr><tr><td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>ketamin</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xylazine</td></tr><tr><td>2 french intravenous catheter green</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionophore solution A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&amp;nbsp; with needle</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300015</td><td>intra-peritoneal injection</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>Thickness No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusion</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>High-accuracy Harvard infusion pump</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Inverted fluorescence microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Graphpad Software</td><td>Analysis software</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&amp;nbsp;</td><td>Black and white camera</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

혈관 감염 심내막염 발생할하기 위해, 박테리아는 흐르는 혈액의 전단 응력에 노출 된 상태로 혈관 벽에 부착 할 수 있어야한다. 미생물의 부착에 기여하는 혈관 박테리아 및 숙주 요인을 파악하기 위해, 전단 생리적 조건 하에서 이러한 상호 작용을 연구 적절한 모델이 필요하다. 여기서, 우리는 세포 외 기질의 서로 다른 컴포넌트에 세균 밀착성을 조사하기 위해 또는 내피 세포 받을수 관내 유동 챔버 모델을 설명하고 개발 된 생체 내에 현미경 모델이 직접 생체 내에 내장의 순환에 박테리아의 초기 밀착성을 시각화 . 이러한 방법은 기류 하에서 박테리아의 부착에 필요한 박테리아 및 숙주 요인을 파악하기 위해 사용될 수있다. 우리는 전단 응력의 ​​관련성과 Staphy의 접착 폰 빌레 브란트 인자의 역할을 도시lococcus 구균 모두 시험 관내 및 생체 내 모델에서 사용.

VWF에 황색 포도상 구균의 접착, 피하 매트릭스와 내피 세포는 전단 응력 의존 현상이다 S. 사이의 상호 작용에 전단 응력의 ​​역할을 강조 구균과 VWF, 우리는 다른 전단 속도로 코팅 된 커버 (체외 관류 모델의 개략적 인 개요 황색 포도상 구균의 1. 접착이 250 초에서 증가 전단 율 증가 VWF하는 그림에 제시되어있다 -1 2,000에 VWF을 통해 관류를 수행 초 -1 (도 2), 높은 전단력이 억제되지만 VWF에 박테리아의 부착을 강화하지 않는 것을 나타낸다. 콜라겐 세균성 유착 VWF의 기여도를 조사하기 위해, 피하 행렬의 주성분은, 우리는 형광 표지 된 관류 S. VWF의 존재 또는 부재하에 콜라겐 위에 구균. VWF, S.의 부착이없는콜라겐 ureus는 전단 속도가 증가함에 따라 감소 하였다. 그러나 VWF는 배지에 존재하는 경우이며, S.의 밀착성 아우 레 우스는 전단 율을 (도 3)가 증가함에 따라 증가 하였다. 체외 흐름 모델은 또한 흐름 하에서 내피 세포 박테리아의 부착을 조사있게 해준다. 우리는 HUVECs를가와 형광 S.을 표시 관류 전단 속도 500에서 2,000 초 구균 -1. 표시된 경우, HUVECs를가 VWF의 방출을 유발하는, 칼슘 -ionophore으로 활성화되었다. 내피 세포의 활성화 및 후속 VWF 자료, S의 증가 접착 전형적인 &quot;문자열 형&quot;패턴을 형성 구균 (도 4a)의 형광 선형 연신 VWF 분자 따라 박테리아의 결합을 제안하는 전단력 (도 4b)의 방향으로 정렬 된 박테리아 클러스터를, 표지. 초기 생체내장의 혈관에 세균 부착이 VWF에 의해 매개된다 S. 이후 생체 내에서 활성화 된 혈관 벽에 세균 부착을 조사하기 위해 (- - / VWF) 구균은 VWF을 준수 할 수 있습니다, 우리는 (VWF + / +)와 VWF 결핍 생쥐 야생형 마우스를 사용했다. 내장의 혈관의 실시간 videomicroscopy은 형광 S. 표시 순환 생체 시각화를 허용 구균 (생체 관류 모델의 개략도 개요는 그림 5에 표시됩니다). 칼슘 -ionophore 의한 내피 세포의 약리 활성 후, 우리는 WT 마우스의 혈관 벽에 개별 박테리아와 세균의 집합체의 신속한 로컬 축적을 관찰 (보조 비디오 1, 2). 박테리아 부착은 거의 VWF의 -deficie의 활성화 혈관벽에서 관찰되지 않았다NT 마우스 (보충 비디오 3) WT 마우스에 접착과 비교 (그림 6). VWF의 부재는 S.의 능력을 저하 구균이 활성화 된 혈관 벽에 부착합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> 그림 1. 체외 흐름 모델의 개략도. 관내 유량 모델은 피하 행렬 세균 밀착성 상이한 전단 의존성 기전 연구를 허용 다기능 모델이지만 또한 혈전 형성. 마이크로 병렬 흐름 챔버는 단백질과 내피 세포의 다른 코팅과 커버 슬립 (플라스틱 또는 유리)에 배치됩니다. 다른 박테리아 (오렌지색 및 회색 도트)의 밀착성을 분석 할 수 있고, 혈장 단백질, 혈소판 및 전혈의 존재의 영향을 평가할 수있다. 혈소판 (파란색 타원) 또는 fibrinog에 대한 형광 마커EN (블루 문자열) 세균성 및 호스트 요소를 구별하기 위해 다른 억제제 (블랙 타원)과 조합하여 사용될 수있다. S의 세균 유착의 대표 이미지 VWF의 존재 (아래)에서 콜라겐 코팅 유무 (상) 구균은 (스케일 바는 100 μm의 경우) 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> S의 그림 2. 접착 전단 속도를 증가 VWF 증가에 구균. 코팅 VWF를 통해 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류 (/ ㎖ 50 μg의가)와 형광 S. 표시 매체에서 250 초 -1 (초 -1) 2,000의 전단 속도 (n은&gt; 5)에서 구균 뉴먼. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> S의 그림 3. 접착 내피 밑층에 구균은 전단 및 VWF 따라 달라집니다.와 형광 S. 표지 코팅 된 콜라겐 (160 μg의 / ㎖)를 통해 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류 매체에서 250 초 2,000 -1의 전단 속도 (n은&gt; 5)에서 구균 뉴먼. 여기서 나타낸 VWF (60 μg의 / ml)을 매질 중에 존재 하였다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. ** P &lt;0.01. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> S의 그림 4. 접착 활성화 된 내피 세포에 구균은 내피 세포를 통해 전단에 의존. 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류입니다. (가) 인간 제대 정맥 내피 세포는 칼슘 -ionophore로 활성화되었다의 형광 미 표시 10 분 관류 다음에 23,187 (0.1 mM)을 매체에서 500 초 2,000 -1의 전단 속도 (n은&gt; 5)에서 구균 뉴먼. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. * P &lt;0.05. S.와 활성화 HUVECs를 통해 마이크로 병렬 흐름 챔버 관류의 (B) 이미지 1000 sec의 전단 속도 -2. S.에서 구균 구균이 VWF의 다량에 접착 (스케일 바는 100 ㎛이다) 제안, ± 200 마이크론 길이의 문자열을 형성한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> 그림 5. 생체 장간막 관류 모델의 개략도. 우측 경정맥 카테터 (노란 선) 불소의 관리에 삽입escently 표시 박테리아 (오렌지 도트), 추가 마취제 또는 제약 억제제 및 항체 등의 다른 구성 요소. 복강 열리고 mesenterium는 형광 현미경으로 혈관 (정맥과 동맥)을 시각적으로 확산된다. VWF의 방출을 유도하는 칼슘 -ionophore에 의한 내피 세포의 약리 활성화 한 후, 박테리아는 경정맥 카테터를 통해 주입 할 수있다. 실시간 혈관 비디오 현미경 형광 표지 된 박테리아를 순환의 생체 내 시각화 및 박테리아 혈소판 혈전의 결과로 형성. 수 있습니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> 도 6 S.의 초기 접착력 구균- / - 마우스. 생체 내에서 활성화 된 내피 세포는 C57BL / 6 VWF + / +와 C57BL가 / 6 VWF와 VWF 생체 ​​정맥 장간막 관류 모델에 의해 매개되는. 접착이의 형광 S. 표시 - / - 마우스 로컬 활성화 혈관 벽에 구균은 VWF 크게 낮다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. *** P &lt;0.001, N&gt; 7. <img alt="비디오 그림 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> 비디오 1 : S의 실시간 접착 구균 VWF + / + 마우스의 활성화 혈관 벽에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 비디오 2 : 실시간 집계 형성과 S의 색전술 구균은 VWF + / + 마우스에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="비디오 그림 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> 비디오 3 : S의 실시간 접착 - / - 마우스 - / -. VWF + / +와 VWF와 쥐 생체 내 장간막 관류 모델 구균 VWF 활성 혈관 벽에. 칼슘 -ionophore (10 mM)을 다섯 μL는 어플리했다시각 혈관 침대의 지역 에디션. 카르복시 플루오 레세 인 - 표지 S.의 현탁액 구균 경정맥 카테터를 통하여 주입 하였다. 장간막 순환이 거꾸로 현미경으로 시각화했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.6K 조회수.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

비디오: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

SynVivo 합성 미세 혈관의 네트워크를 사용하여 전단 접착지도의 생성

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

생체공학

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

발생학

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

유동 하에서 혈관 약물 표적화 연구를 위한 체외 3D 세포 배양 동맥 모델

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...