이 방법은 효모 텔로머 비코딩 RNA TERRA 국소화와 같은 텔로미어에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며, 나는 그것이 기원 또는 트랜스의 텔로미어라고 주장 할 수 있습니다, 다른 cromes-mants이 기술의 주요 장점은 연구원이 살아있는 세포에서 단일 텔로미어에서 표현 테라 분자를 시각화 할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 클라우디오 오스 페고라와 니콜 베틴, 내 실험실에서 두 대학원생이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 AGS 셀을 성장하기 시작합니다.
그런 다음 세포가 50~ 60%에 도달하면 sgRNA Cas9 발현 벡터 및 MS2 카세트로 변환합니다. 다음 날 배양 매체를 네오마이신을 함유한 매체로 대체한다. 이 후 추가 10 마이크로 리터 0.25% 96 잘 플레이트의 각 우물에 Tripsyn.
현미경과 마커를 사용하여 접시에 보이는 각 클론의 위치를 표시합니다. 네오마이신 배양 매체를 충분한 PBS로 교체하여 클론에 액체의 박막을 형성한다. 트립신의 5 마이크로 리터를 포함하는 10 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 천천히 식민지에 트립신을 해제합니다.
트립신이 세포를 1분 동안 분리하도록 허용합니다. 끝으로 식민지를 긁어, 끝에 빨아. 이 후, 콜로니에서 세포를 96 웰 플레이트의 우물로 옮킨다.
상온에서 5분간 접시를 배양합니다. 그런 다음 선택적 매체의 150 마이크로 리터로 우물을 채웁니다. 다음으로, 3개의 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 젤라틴을 추가합니다.
플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하고 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 클론이 90 %에 도달 한 후, 접시의 각 우물에서 매체를 흡인하고 PBS로 접시를 씻습니다. 그런 다음 트립신 의 마이크로 리터 30 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.
다음으로 각 웰에 70마이크로리터의 선택적 배지를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 세포를 방해. 120 마이크로리터를 포함하는 젤라틴화된 DNA 플레이트의 웰에 혼합물의 30마이크로리터를 전달한다.
그런 다음 혼합물의 마이크로리터 30을 50 마이크로리터를 포함하는 젤라틴 냉동 플레이트로 전달한다. 인큐베이터에 DNA를 놓고, 세포가 90%의 합류에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 자랄 수 있도록 합니다. 그 후, 얼음 냉기 냉동 매체 80 마이크로리터를 동결 판의 각 웰에 추가합니다.
접시를 파라필름으로 밀봉하고 뚜껑을 교체하고 판을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그런 다음 냉동 판을 섭씨 80도에서 유지하십시오. DNA 플레이트의 클론이 90%에 도달하면 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다.
그런 다음 Lysis 버퍼의 50 마이크로 리터로 세포를 lyse. 접시를 파라필름으로 덮고 뚜껑을 교체하고 접시를 사란 랩으로 감쌉니다. 그 후 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오.
다음 날 각 우물에 100 마이크로리터의 염화나트륨 용액을 추가하고 실온에서 6시간 또는 하룻밤 동안 DNA 강수량을 허용합니다. 그런 다음 접시를 반전하고 잘 당 70 %의 200 마이크로 리터로 세 번 세척하십시오. 접시의 각 웰에 RNase A 용액 20 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
그 후 PCR 증폭을 위해 게놈 DNA 3마이크로리터를 사용하고 PCR 기계를 설치합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 6개의 웰 플레이트에서 PCR 양성 클론을 성장시다. 클론이 90%에 도달하면 PBS로 세포를 세척하고, 각 웰에 Proteinase K로 250 마이크로리터를 추가합니다.
세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어내고 Lysate를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 16시간 동안 섭씨 37도에서 Lysate를 배양합니다. Lysate에 에탄올 1 밀리리터를 넣고 힘차게 흔들어 줍니다.
텍스트 프로토콜에 따라 F-12K 배지에서 클론을 성장시킬 수 있습니다. 그런 다음 70%의 합류에 도달하면 세포에 Cre-expressing 아데노바이러스를 추가합니다. 감염 후 48시간 후에 세포를 3개의 10센티미터 요리로 나눕습니다.
그런 다음 세포 동결 및 RNA 추출을 위한 세 번째 접시를 배양합니다. 먼저, 테라-MS2 클론과 야생형 AGS 세포를 유리 바닥 접시에 접시에 담는다. 그런 다음 폴리브레인과 바이러스 를 발현하는 MS2-GFP를 배지에 추가합니다.
24시간 후에 레트로바이러스를 함유하는 배지를 버리고, 페놀 레드 없이 신선한 배지를 세포에 첨가한다. 마지막으로, 반전된 현미경과 민감한 카메라 영상을 사용하여 적절한 목표와 조리개를 가진 세포를 이미지하게 됩니다. 단일 서브텔로미어에서 MS2 서열 태그를 포함하는 이 프로토콜암 세포 클론이 생성되고 이미지화되었다.
네오마이신 내성 클론은 PCR을 사용하여 스크리니징되었다. 양성 클론은 게놈 DNA 추출 및 남부 얼룩 분석을 위해 lysed에서 배양되었습니다. PCR 및 남부 블롯 분석에 양성클론은 MS2 카세트에 존재하는 네오마이신 유전자를 제거하기 위해 아데노바이러스를 발현하는 CRE-GFP에 감염되었다.
네오마이신 저항 유전자의 제거가 확인되면, 클론으로부터 추출된 RNA는 테라-MS2 전사체의 발현을 위해 시험되었다. 공초점 현미경검사법에 의한 살아있는 세포에서 테라-MS2 전사체를 시각화하기 위해, 선택된 클론은 MS2-GFP 융합 단백질을 발현하는 레트로바이러스에 감염되었다. TERRA-MS2 전사체와 텔로미어는 선택된 클론에서 MS2-GFP 융합 단백질과 mCherry 융합 텔로미어 결합 단백질인 TRF2를 공동 발현함으로써 공초점 현미경 검사를 통해 살아있는 세포에서 동시에 시각화되었다.
이 절차를 시도할 때 클론의 혼합 된 인구 대신 단일 클론을 선택하기 위해 모든 노력을 기울이는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 염색체 스프레드에 대한 DNA FISH와 같은 다른 방법은 고정 된 세포에서 MS2 카세트의 통합을 시각화하기 위해 사용될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 텔로미어 분야의 연구원들이 살아있는 인간 세포에서 단일 텔로미어 테라 분자의 세포 국소화를 탐구하는 길을 열 수 있습니다.
바이러스 벡터 및 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 불확실 할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 실험실 코트, 장갑 착용 및 방사선을 최소화하기 위해 플렉시 유리 방패를 사용하는 것과 같은 예방 조치는이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.
