이 작품 일부에 의해 지원 되었다 프로젝트 암 치료제 (P-직접) (K.M. 15cm0106102h0002) 및 프로젝트에 혁신적인 연구 개발에 대 한 암 연구 및 치료 진화 (P-만들기) (16 cm 01061150001, K.M.) 일본 기관에서 의료 연구 및 개발, 아메드; 다케다 과학 재단 (사원); 부여 공주 다카마쓰 암 연구 기금 (13-24520, 사원); 그리고 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP16K07133 (사원).

1. 시 약 설치
<ol><li>
셀 동기화에 사용 하는 시 약
	<ol>
<li>2.5 m m 티 미 딘을 포함 하는 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)를 생성 하려면 125 m m 티 미 딘 준비 조직 문화 학년 물 1 mL 당 티 미 딘의 30.28 mg을 디졸브. 여과 0.22 μ m 주사기 필터 장치 솔루션. DMEM 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보완의 50 mL 당 갓된 125 m m 티 미 딘 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Nocodazole의 0.1 μ g/mL를 포함 된 DMEM을 생성 하기 위해 디 메 틸 sulfoxide 5 μ g/μ nocodazole 준비를 (DMSO)에 nocodazole 분해. 추가 5 µ g의 1 µ L / µ L nocodazole DMEM의 50 mL 당 10% (vol/vol) FBS 보충.</li>
		<li>DMEM 포함 된 DMSO의 0.002% (vol/vol)를 생성 하려면 DMEM 10% (vol/vol) FBS와 보충의 50 mL 당 DMSO의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IP RdRP 분석 결과 대 한 사용 시 약
	<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 a: 150 m m NaCl, 20 mM Tris HCl (pH 7.4) 준비 및 0.5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>아세테이트 버퍼 x 5를 준비: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.8), 500mm 칼륨 아세테이트 및 20 m m MgCl2. 실 온에서 시 약 저장.</li>
		<li>워시 버퍼 1: 1 x 아세테이트 버퍼, 글리세롤 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) 트라이 톤 X-100 0.06 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일, ethylenediamenetetraacetic 산 (EDTA) 준비-무료. 사용의 일 또는 사용 하기 전에 하루에 워시 버퍼 1을 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>AGC 솔루션 준비: 아세테이트 버퍼, 10% (vol/vol) 글리세롤과 0.02% (wt/vol) 3 [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio x 1]-1-propanesulfonat (챕). 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>2mm CaCl2를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면 1 M CaCl2 AGC 솔루션 50 mL 당 100 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>3mm 에틸렌 글리콜 bis (b-aminoethylether)를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), AGC 솔루션 50 mL 당 0.4 M EGTA (pH 7.5)의 375 µ L 추가. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>워시 버퍼 2: 1 x 아세테이트 버퍼와 0.02% (wt/vol) 챕 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>HMD 솔루션 준비: 0.2 M HEPES-코 (pH 7.8), 40 m m MgCl2 와 2 mM dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 시 약 저장 참고: HMD 솔루션 3 개월에서 이상 갱신 수 한다.</li>
		<li>가수분해 K 버퍼 x 2 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). -20 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>버퍼를 로드 x 2 준비: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 오렌지 G. 저장-20 ° c.에 시 약</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. HeLa 세포의 준비
참고: 준비 HeLa 세포 mitotic 단계 (조작) 또는 비동기적으로 나누어 동기화 (unmanipulated). 37 ° c.에 5% CO2 의 셀 문화
<ol><li>
헬러 세포 유사 분열에서의 동기화
	<ol>
<li>플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.</li>
		<li>이틀 후 도금, 2.5 m m 티 미 딘 및 10% (vol/vol) FBS DMEM의 10 mL 매체를 바꿉니다. 24 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>세 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (-)의 10 mL로 세포 세척 하 고 10% (vol/vol) FBS 6 h에 대 한 포함 된 DMEM의 10 mL로 세포 문화.</li>
		<li>Nocodazole의 10% (vol/vol) FBS, 0.1 µ g/mL를 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>부드럽게, 문화 접시를 흔들어 하 고 분리 mitotic 세포를 포함 하는 상쾌한을 검색 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Unmanipulated HeLa 세포의 준비
	<ol>
<li>플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.</li>
		<li>도금, 후에 2 일 10 mL의 10% (vol/vol) FBS 포함 된 DMEM 매체를 바꿉니다. 문화 30 h 세포.</li>
		<li>0.002% (vol/vol) DMSO 10% (vol/vol) FBS, 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>Trypsinization 1 mM EDTA를 포함 하는 트립 신 (2.5 g/L)의 0.7 mL을 사용 하 여 셀을 수집 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP RdRP 분석 결과
<ol><li>단백질 A agarose 구슬 준비
	<ol>
<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 선호도 수 지의 1 mL (침대 볼륨 500 µ L)를 전송. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>구슬, 하의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총 세 세척)를 반복 합니다.</li>
		<li>구슬에의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L를 추가, 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 회전 통에 4 ° C에서 튜브 하룻밤 (또는 적어도 4 h) 회전 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 튜브 원심 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>구슬에 세포의 용 해 버퍼 A의 500 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° c.에 구슬 저장</li>
	</ol></li>
	<li>세포 lysate의 준비
	<ol>
<li>(선택 사항) 셀 2 단계에서 고정 되어 셀 느슨하게 될 때까지 얼음에 냉동된 세포를 녹여 놓고.</li>
		<li>셀 10 mL의 PBS (-)을 한 번 씻어. 1450 x g 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>부드러운 pipetting으로 얼음 세포의 용 해 버퍼의 세포의 용 해 버퍼 A 1 x 107 셀의 당 (1 mL)으로 세포를 lyse.</li>
		<li>다음 조건; 1.5 mL 튜브에 샘플을 sonicate 25%는 sonicator의 증폭을 설정 하 고 10 sonicate s.</li>
		<li>4 ° c.에 15 분 동안 20400 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>상쾌한을 수집 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 1 mL를 각각을 전송 합니다. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation
	<ol>
<li>사전 취소 단계의 3.2.6 lysate 40 µ L (구슬 볼륨 20 µ L)를 추가 하 여은 lysate의 1 mL 당 prewashed 단백질 A agarose 구슬의. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 30 분에서 4 ° c.에 대 한 샘플을 회전</li>
		<li>13000 x g 4 ° C에서 1 분 동안에 샘플 원심 고 복구는 상쾌한.</li>
		<li>40 µ (침대 볼륨 20 µ L) L prewashed 단백질 A agarose 구슬 및 안티 인간 TERT 항 체의 10 µ g의 추가 (복제: 10E9-2)8 에 사전 허가 lysate. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 밤에 4 ° C에서 샘플을 회전.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>워시 워시 버퍼 1 구슬: 구슬에 워시 버퍼 1의 1 mL을 추가, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 3 추가 시간이이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>AGC 솔루션 2mm CaCl2를 포함 하는 구슬 한번 세척: AGC 솔루션 2mm CaCl2 구슬에 포함 된의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>Micrococcal nuclease (MNase)와 구슬 치료: 표 1에 설명 된 MNase 반응 혼합물을 준비. 부드러운 pipetting으로 구슬 MNase 반응 혼합물의 60 µ L에서 resuspend. 흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 25 ° c.에 15 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에 참고: 기복이 셰이 커를 사용 하 여이 단계에서 속도 제한에 따라 엄격 하 게 매우 중요 하다. 동영상, 회전 믹서 등의 다른 유형을 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>구슬 3mm EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션 두 번 세척: 구슬 3 m m EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>워시 워시 버퍼 2 한번 구슬: 워시 버퍼 2의 1 mL를 추가구슬, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 하 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. RdRP 반응을 설정 하는 동안 얼음에 비즈를 유지. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP 반응
	<ol>
<li>표 2에 설명 된 대로 새로운 튜브에서 RdRP 반응 혼합물을 준비 합니다.</li>
		<li>[Α-32P]의 6 µ L 추가 UTP (3000 Ci/mmol) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합. 참고: [α-32P] ATP, [α-32P] CTP, 또는 [α-32P] GTP [α-32P] 대신 반응에 사용 될 수 있다 광섬유.</li>
		<li>템플릿 RNA의 1 µ L를 추가 (1 µ g / µ L) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합. 참고: 설정 하려면 RdRP 분석 결과, 다음 RNA 서식 파일 것이 좋습니다: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>단계의 3.4.3 RdRP 반응 혼합물의 20 µ L와 구슬 pipetting으로 resuspend.</li>
		<li>흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 32 ° c.에 2 h 형 peltier 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에</li>
		<li>가수분해 K (20 mg/mL)의 5.4 µ L과 2 x 가수분해 K 버퍼의 45.4 µ L 반응 혼합물에 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 턴테이블에 샘플 (20 ~ 25 rpm)를 흔들어</li>
		<li>샘플에 RNase 무료 물 109.2 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 하 고 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플을 다음 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트의 추가 (pH = 5.2), 4 강 수 캐리어와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 µ L. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>-20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. 참고: 단계 3.4.11에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>RNase 처리
	<ol>
<li>RNase 무료 물 단계 3.4.11에서 20 µ L에서 펠 릿 resuspend</li>
		<li>표 3에 설명 된 대로 새로운 튜브에 RNase 반응 혼합물을 준비 합니다.</li>
		<li>샘플, RNase 반응 혼합물의 180 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 2 h에 대 한 튜브를 품 어</li>
		<li>샘플을 10% (vol/vol) SDS의 2.3 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>샘플을 가수분해 K (20 mg/mL)의 2 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 205 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 후 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송.</li>
		<li>3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2), 강 수의 4 µ L와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>-20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조. 참고: 단계 3.5.9에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>젤 전기 이동 법 그리고 autoradiography
	<ol>
<li>RNase 무료 물 20 µ L와 샘플 resuspend</li>
		<li>버퍼를 로드 x 2의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>95 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 끓여 얼음에 샘플을 짝사랑.</li>
		<li>젤을 실행 합니다. 서식 파일 크기 34 국세청 (단계 3.4.3 참조) 경우, 7 M 요소-10 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법을 변성 시키기 위해 사용 된다.</li>
		<li>젤 젤 건조 기 건조.</li>
		<li>x-레이 카세트-80 ° c.에 강화 화면 내에서 건조 젤을 영화 노출</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins.">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li><li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human.">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li><li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription.">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).</li><li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+the+nucleus:+roles+for+small+RNAs+in+transcription,+epigenetics+and+beyond.">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li><li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production.">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA.">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li><li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance.">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li><li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase.">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li><li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin.">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li><li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization.">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

IP RdRP 분석 결과 인간 TERT의 RdRP 활동을 감지 하는 중요 한 방법입니다. TERT 단백질 높은 mitotic HeLa 세포, TERT RdRP 복잡 한8,,910을 형성에 표현 된다. 이 mitotic는 HeLa 세포 RdRP 활동을 감지 하는 최적의 자료는 건의 한다. 위에서 설명한 프로토콜, mitotic 그리고 비 동기화 HeLa 세포 포함 됩니다 긍정 및 부정적인 예제로 각각. 그림 1A에서 같이, mitotic는 HeLa 세포에서 권장 RNA 템플릿에서 RdRP 분석 결과 제품 20 ~ 30 사이의 광범위 한 방사성 신호 표시 nt. HeLa 세포 이외에 우리 셀 라인의 종류와 시험 수행 있고 다른 세포 유형9에 신호 패턴을 변경할 수 있습니다 발견: 일부 강한 신호만 약 30 표시 nt, 일부는 HeLa 세포와 비슷한 패턴을 보여. 우리는 짧은 RNA는 34 nt 템플릿8, 이외 템플릿 분석 결과 수행도 하 고 긴 (~ 300 nt) 다양 한 시퀀스, RNAs 성공적으로 일부 선호 있을 수 있지만 해당 서식 파일에서 RdRP 제품을 얻을. 그러나 첫 번째 재판에 대 한, 좋습니다 mitotic 단계에 34 nt RNA 템플릿을 HeLa 세포를 사용 하 여. 뇌관-종속 및 뇌관-독립적인 방식으로11RdRPs 이중 가닥 RNA를 생성할 수 있습니다. 우리 보고 TERT 인간 RdRP7,9;이 속성 유지 TERT 다시 못쓰게 메커니즘73'-폴드 구조 RNA 템플릿에서 dsRNA를 합성. 34 nt RNA 서식 파일, TERT 뇌관9를 사용 하지 않고 보완 가닥을 합성. 특히 RdRP 제품 뇌관-독립적인 방식으로, 즉 드 노 보 합성 RNA 제품, [α-32P] 합성을 검출 하기 위하여 NTP [γ-32P]로 대체 될 수 있다 NTP RdRP 반응9에.
TERT 구슬에 면역성이 있는 복합물의 MNase 처리는 원하는 결과 달성 하기 위해 중요 한 단계 이다. 너무 오래 또는 집중 떨고 MNase 치료를 수행 하는 경우 RdRP 제품 현저 하 게 감소 것입니다. 이러한 문제를 방지 하려면 좋습니다 엄격 하 게 신중 하 게 프로토콜을 따라. HMD 솔루션 성공 위한 또 다른 중요 한 요소 이다입니다. 신호는 매우 약한 찾을, 새로 준비 한 HMD 솔루션을 교체 합니다.
프로토콜을 통해 하나 RNase 오염을 피하기 위해 주의 해야한다. Ribonuclease 치료 전용 장비로 수행 되어야 한다. Ribonuclease 조작 후 팁 삭제 해야 하나 그리고 RNase와 튜브 즉시, 전문 솔루션 (예: RNase 조용한), RNase 제거 나무를 변경.
TERT TERC 뿐만 아니라 생 RNAs의 또한 많은 종류와 상호 작용 하 고 우리가7그들의 부분을 보고 있다. MNase 치료 없이 IP RdRP 분석 결과 같은 IP RdRP 분석 결과에서 수정 그들의 시퀀스 기능에 생 RNA 템플릿 RdRP TERT-관련 활동과 bioinformatic 가이드에 대 한 전체 목록을 제공 합니다. 우리가 성공적으로 조직 lysate에이 프로토콜을 적용 했습니다. TERT 정상 및 종양 직물의 다양 한 표현 때문에이 분석 결과 인간의 TERT의 비정규 효소 기능을 조사 하기 위해 유용할 수 있습니다.

인간의 telomerase 역전사 (TERT) 잘 알려져, telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere telomerase RNA 구성 요소 (TERC), 특정 RNA 템플릿1을 사용 하 여. TERT telomerase의 구성 요소로 서 telomeric DNA polymerizes, 비록 구조 및 계통 발생 분석 나타냅니다 TERT 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)와 밀접 하 게 관련 된 도메인을 공유 이러한 polymerases2,,34. RdRP 보완 RNA 가닥 RNA 서식 파일을 생성 하는 효소 이다. 효소는 바이러스 뿐만 아니라 모델 생물, 식물, 효 모, 벌레, 등 에서도 인코딩되고 RdRP에 의해 이중 가닥 RNA 합성 transcriptional 및 post-transcriptional 유전자가 유기 체5,6 침묵에 기여 . 인간의 RdRP 오랜 시간 동안 실종 됐다, 하지만 우리는 인간 TERT 20097에서 RdRP 활동을 발견.
우리는 먼저 재조합 단백질7, TERT의 RdRP 활동을 확인 후 민감한 생체 외에서 분석 결과 내 생 TERT8RdRP 활동 감지를 설립. 여기, 우리가 시험관에 RdRP 분석 결과 (분석 결과 IP RdRP) 생 TERT에 대 한 보여 줍니다. 이 방법은 생 TERT의 immunoprecipitation (IP)로 시작 하 고 뒤에 있는 방사성 ribonucleotides는 초기 RNA 가닥에 통합 RdRP 반응, 생체 외에서 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:464px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:155px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">044-29765</td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin mixed solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>32777-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline (PBS(-))</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymidine</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>07147-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>08904-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31333-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>35434-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>18321-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>25223-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Protein A Plus Agarose</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td align="right">22812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>17514-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium hydroxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium acetate</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>28405-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&#8226;6H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>135-00165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>17045-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-21105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete, EDTA-free</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2&#8226;2H2O)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>06731-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micrococcal nuclease (MNase)</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>2910A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>15214-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>07957-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14128-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG507H</td>
			<td>Use fresh RI for the assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase inhibitor</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>SIN-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3 M Sodium acetate</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>316-90081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol (99.5)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td align="right">9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase One Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>02873-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formamide, deionized</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>16345-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>15130-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orange G</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>25401-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>e.g., ASTEC</td>
			<td>SCA-325DRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>e.g., TOMY</td>
			<td>EX-135</td>
			<td>For step B)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro refrigerated centrifuge</td>
			<td>e.g., KUBOTA</td>
			<td align="right">3740</td>
			<td>For step 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125</td>
			<td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro refrigerated centrifuge</td>
			<td>e.g., TOMY</td>
			<td>MX-305</td>
			<td>For step 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cooled incubator</td>
			<td>e.g., Panasonic</td>
			<td>MIR-154-PJ</td>
			<td>Set a rotary shaker inside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rotary shaker</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>RT-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cooled incubator&#160;</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>BR-43FL</td>
			<td>Set a shaker &#8220;MINI WAVE&#8221; inside, for step 7.7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MINI WAVE</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>WEV-03</td>
			<td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>e.g., TAITEC</td>
			<td>HB-80</td>
			<td>Set a shaker &#8220;MINI WAVE&#8221; inside, for step 8.5 and 8.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Block incubator</td>
			<td>e.g., ASTEC</td>
			<td>BI-516S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

인간의 telomerase 역전사 (TERT), telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere RNA 의존 DNA 중 합 효소 활동을 통해. TERT는 역전사로 지명 된다, 비록 TERT의 구조 및 계통 발생 분석 TERT 오른 손잡이 polymerases의 회원 이며, 뿐만 아니라 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)에 관한 설명. 우리는 첫째로 RdRP 무료 한 RNA를 생성 하는 인간 TERT의 활동 비 코딩 RNA 서식 서 암 세포에 침묵 하는 RNA에 기여 하 고 식별. 이 정식이 아닌 효소 활동 분석, 우리 2009 년에서 재조합 TERT 분석 결과 RdRP를 개발, 그 후 생 TERT RdRP 시험 생체 외에서 설립. 이 원고에서 우리는 후자의 방법을 설명합니다. 간단히, TERT 면역성이 있는 복합물 셀에서 격리 되며 RNA 템플릿과 RdRP 반응에 대 한 방사성 rNTP를 포함 하 여 rNTPs와 알을 품을. 단일 가닥 RNA를 제거 하려면 반응 제품, 그리고 최종 제품 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 분석은 RNase 처리 됩니다. 방사선된 RdRP 제품 하룻밤 노출 후 autoradiography 하 여 검색할 수 있습니다.

권장된 RNA 템플릿을 사용 하 여 방사성 RdRP 제품 하룻밤 노출 (그림 1A) 후 mitotic 단계에서 특히 HeLa 세포에서에서 20 ~ 30 뉴클레오티드 (nt) 사이 관찰 된다. RdRP 제품의 신호 강도 약 25 위치 두 봉우리를 설명 하는 일반적으로, 제품의 크기 분포와 협 화음에 nt 다음 세대 시퀀싱9에의해 확인 nt와 30. Mitotic 세포는 달리 동기화 없이 HeLa 세포는 거의 20-30 nt 방사성 제품의 부재를 보여 줍니다. 타원형 신호 20 아래 배치 된 모든 샘플에서 nt는 특이 현상이 나타난다.
경우에 mitotic는 HeLa 세포에서 약한 신호를 가진 ~ 30 nt 제품, RdRP 반응 잘 가지 않 았 어 나타냅니다. 예를 들어 MNase 치료 약 및 부적절 하 게 수행, mitotic 헬러의 신호 강도 세포 감소 크게 (그림 1B). 오래 된 HMD 솔루션 수행 RdRP 반응 또한 제품 (그림 1C)을 줄일 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> 그림 1 : Mitotic는 HeLa 세포에서 내 생 TERT의 대표 RdRP 제품. HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과의 (A) 3 개의 대표적인 결과 (조작) nocodazole 또는 (unmanipulated) DMSO로 치료. 화학적 합성된 34 nt RNA 템플렛으로 사용 되었다. (B) 부적절 한 MNase 치료 수행 mitotic HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과. (C) IP RdRP 분석 결과 신선한 또는 오래 된 HMD 솔루션 수행 mitotic HeLa 세포에서. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U / µ L</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease 버퍼, 10 배</td>
			<td>8 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>51 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: MNase 반응 혼합 구성 요소입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>챕 스, 0.07% (wt/권)</td>
			<td>6 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>HMD 솔루션</td>
			<td>2 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 m m</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0.4 m m</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 억제제, 40 U / µ L</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: RdRP 반응 혼합 구성 요소입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 하나 Ribonuclease, 10 U / µ L</td>
			<td>0.2 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>반응 버퍼, 10 배</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>159.8 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: Ribonuclease 반응 혼합 구성 요소입니다.

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.7K 조회수.  National Cancer Center Research Institute. 인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

연구

유전학

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome editing, embryonic stem (ES) cell-based gene-targeting technology does not have these shortcomings and is widely used to modify animal/mouse genome ranging from large deletions/insertions to single nucleotide substitutions. Notably, identifying the relatively few homologous recombination (HR) events necessary to obtain desired ES clones is a key step, which demands accurate and reliable methods. Southern blotting and/or conventional PCR are often utilized for this purpose. Here, we describe the detailed procedures of using those two methods to identify HR events that occurred in mouse ES cells in which the endogenous Myh9 gene is intended to be disrupted and replaced by cDNAs encoding other nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). The whole procedure of Southern blotting includes the construction of targeting vector(s), electroporation, drug selection, the expansion and storage of ES cells/clones, the preparation, digestion, and blotting of genomic DNA (gDNA), the hybridization and washing of probe(s), and a final step of autoradiography on the X-ray films. PCR can be performed directly with prepared and diluted gDNA. To obtain ideal results, the probes and restriction enzyme (RE) cutting sites for Southern blotting and the primers for PCR should be carefully planned. Though the execution of Southern blotting is time-consuming and labor-intensive and PCR results have false positives, the correct identification by Southern blotting and the rapid screening by PCR allow the sole or combined application of these methods described in this paper to be widely used and consulted by most labs in the identification of genotypes of ES cells and genetically modified animals.

Here, we present a detailed protocol for identifying homologous recombination events that occurred in mouse embryonic stem cells using Southern blotting and/or PCR. This method is exemplified by the generation of nonmuscle myosin II genetic replacement mouse models using traditional embryonic stem cell-based homologous recombination-mediated targeting technology.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was developed to detect the conserved region of the nucleoprotein (N) gene of lyssaviruses. The method applies reverse transcription (RT) using viral RNA as template and oligo (dT)15 and random hexamers as primers to synthesize the viral complementary DNA (cDNA). Then, the viral cDNA is used as a template to amplify an 845 bp N gene fragment in first-round PCR using outer primers, followed by second-round nested PCR to amplify the final 371 bp fragment using inner primers. This method can detect different genetic clades of rabies viruses (RABV). The validation, using 9,624 brain specimens from eight domestic animal species in 10 years of clinical rabies diagnoses and surveillance in China, showed that the method has 100% sensitivity and 99.97% specificity in comparison with the direct fluorescent antibody test (FAT), the gold standard method recommended by the World Health Organization (WHO) and the World Organization for Animal Health (OIE). In addition, the method could also specifically amplify the targeted N gene fragment of 15 other approved and two novel lyssavirus species in the 10th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) as evaluated by a mimic detection of synthesized N gene plasmids of all lyssaviruses. The method provides a convenient alternative to FAT for rabies diagnosis and has been approved as a National Standard (GB/T36789-2018) of China.

A pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction has been developed to detect specifically all known lyssaviruses. Validation using rabies brain samples of different animal species showed that this method has a sensitivity and specificity equivalent to the gold standard fluorescent antibody test and could be used for routine rabies diagnosis.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...