이 프로토콜은 개별 인간 적인 islet 세포의 높은 처리량 전사 데이터를 생성합니다, 이는 아노크롬 세포 이질성을 연구하고, 희소한 세포 모형 및 질병에 있는 유전자 조절을 연구하기 위하여 이용될 수 있는. 이 기술은 더 큰 규모의 단일 셀 데이터를 생성하고, 사용하기 쉽고, 처리 시간이 상당히 짧습니다. 이 방법은 다른 종의 섬과 다른 새로 고립된 조직을 프로파일에 적용할 수 있습니다.
그러나, 프로토콜은 조직 특정 해리 절차에 맞게 최적화될 필요가 있습니다. 고품질 해리 셀을 준비하는 것이 중요합니다. 단일 셀 분할 전에 셀 서스펜션의 QC가 핵심이며, 에멀젼을 신중하고 신속하게 처리한다.
칩이 막힌 지 알고 같은 일부 품질 검사점은 읽기보다 더 잘 볼 수 있습니다. 인간 섬을 획득하고 하룻밤 동안 배양 한 후 P200 파이펫을 사용하여 200 ~ 300 개의 섬을 계산하고 손으로 선택하십시오. 5밀리미터의 완전한 섬 매체를 포함하는 15mm 원유형 튜브로 섬떼를 옮기고, 섭씨 37도로 미리 데워집니다.
튜브를 원심분리기에 200배 G로 2분간 놓습니다. 바닥에 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네티를 부드럽게 흡인합니다. 1밀리미터의 미리 데운 셀 해리 솔루션을 추가하고 부드럽게 위아래로 파이프를 통해 펠릿을 방해합니다.
섬은 섭씨 37도에서 9~11분 동안 배양합니다. 3분마다 파이펫을 10초 동안 천천히 위아래로 내려가 세포를 단일 셀로 분리합니다. 섬 세포가 잘 해리되고 용액이 흐리면 완전한 섬 매체9 밀리리터를 추가하고 30 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 새로운 15 밀리리터 원유형 튜브에 필터링하십시오.
5 분 동안 400 배 G에서 원심 분리로 세포를 수집합니다. 1X PBS 04%BSA 용액의 200~300마이크로리터에서 수퍼내탄을 흡인하고 다시 중단한다. 지금, AO/DAPI의 0.5 마이크로리터와 세포 배양의 10 마이크로리터를 섞는다.
파이펫을 위아래로 위아래로 섞어 철저히 섞습니다. 슬라이드에 10.5 마이크로리터를 로드하고 형광 기반 자동 셀 카운터에서 셀 수 분석을 실행하여 수와 생존 가능성을 결정합니다. 마이크로 유체 칩을 칩 케이스에 넣습니다.
칩 케이스를 오리엔테이션하여 유정이 실험을 수행하는 사람과 가장 가깝습니다. 파이펫을 사용하여 계산된 셀 볼륨을 준비된 튜브 스트립에 추가합니다. 파이펫을 5번 섞습니다.
파이펫 팁을 버리지 않고 90 마이크로리터의 셀 혼합물을 칩 중 하나를 행으로 옮기십시오. 30초 동안 기다린 다음, 40 마이크로리터의 젤 비드를 2줄로 로드하기 위해 매우 느리게 파이펫을 넣습니다. 270 마이크로리터의 분할 오일을 3열의 우물에 분배합니다.
칩 개스킷을 칩 홀더의 탭에 연결합니다. 조립된 칩 홀더를 단일 셀 분할 장치에 넣고 실행 버튼을 누릅니다. 실행 완료 시 홀더에서 칩 개스킷을 제거하고 칩 케이스를 45도 각도로 열고 칩에서 에멀젼 100 마이크로리터를 블루 플라스틱 65 웰 플레이트의 우물로 옮기습니다.
각 에멀젼에 시약을 깨는 분홍색 에멀젼 125 마이크로리터를 분배합니다. 1 분 동안 기다린 다음 각 우물의 전체 볼륨을 각 0.2 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 튜브 스트립에 투명층과 분홍색 층이 있는지 확인하십시오.
파이펫을 사용하면 명확한 층을 방해하지 않고 튜브 스트립 의 바닥에서 분홍색 층의 125 마이크로 리터를 제거하십시오. 소량의 소량의 분홍색 층이 튜브에 남아 있는 것은 정상입니다. 그런 다음 각 튜브 스트립에 200 마이크로리터의 정리 믹스를 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양합니다.
튜브 스트립을 자기 스탠드로 옮기고 2분 동안 기다렸다가 용액이 지워지도록 합니다. 상체를 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 구슬을 80%에탄올로 두 번 씻습니다.
구슬이 1분 동안 건조되도록 합니다. 자석에서 튜브 스트립을 제거하고 구슬에 용출 용액 35.5 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫은 용액의 구슬을 다시 일시 중단하고 실온에서 2 분 동안 배양합니다.
튜브 스트립을 자기 스탠드로 옮기고 용액이 지워지도록 합니다. 튜브 스트립에서 0.2 밀리리터 튜브 스트립을 청소하기 위해 정제 된 보완 DNA를 전달합니다. 보완 DNA를 증폭시키기 위해 먼저 각 샘플에 상호 보완적인 DNA 증폭 마스터 믹스 65 마이크로리터를 추가합니다.
튜브 스트립을 열순환기에 놓고 원고에 따라 프로그램을 실행합니다. 샘플은 섭씨 4도에서 최대 72시간 동안 보관할 수 있습니다. 보완 DNA를 15개의 아나그램과 20마이크로리터로 정상화한 후, 30마이크로리터의 표기 혼합물을 얼음에 대한 각 보완DNA 샘플에 혼합합니다.
시료를 써볼사이클러에 넣고 5분간 55도의 태그레이션 프로토콜을 실행하여 섭씨 10도까지 낮추고 유지합니다. 그런 다음 샘플 인덱스 PCR 마스터 믹스 60 마이크로리터와 20 마이크로몰라 forolegol 샘플 인덱스의 10 마이크로리터를 30 마이크로리터 정제 보완 DNA 샘플에 추가합니다. 튜브를 써모사이클러에 반환하여 최종 라이브러리 제품을 증폭시합니다.
각 샘플을 마이크로리터당 2나노그램으로 정상화하고 정규화된 각 시료의 3마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브에 함께 가져옵니다. 용출 버퍼로 풀을 마이크로리터 당 0.25 나노그램으로 희석합니다. 희석된 풀 샘플의 12마이크로리터, 1마리의 동물 또는 DNA 제어의 마이크로리터 1개, 용출 완충제 2편, 수산화나트륨 0.4마이크로리터 5개를 결합하여 풀을 분해한다.
혼합물을 5분 동안 배양한 다음 pH8에서 200 밀리머 트리의 마이크로리터 10을 추가하고 HTA-1의 1345.95 마이크로리터에 혼합물의 4.05 마이크로리터를 적재합니다. 다음으로 시퀀서카트리지에 1.3 밀리리터를 싣고 시퀀싱 레시피를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 실행합니다. 컴퓨터에서 셀 레인저를 실행하여 FASTQ 파일로 시퀀싱하여 생성된 멀티플렉스 원시 기본 호출 파일을 해제합니다.
FASTQ 파일을 인간 b37.3 게놈 어셈블리에 정렬하고 CSC 유전자 모델을 사용하여 발현 정량화를 얻습니다. 바코드 순위 플롯을 검사하여 셀 관련 바코드와 배경을 분리했는지 확인합니다. 세포 질을 제어하기 위하여는, 500 미만검출된 유전자, 3 이하, 000의 유일한 분자 식별자의 총 수 및 0.2 생존 점 보다 더 큰 세포를 제외합니다.
조직 및 세포 유형에 따라 컷오프를 조정합니다. 다음으로, R 패키지 맥러스스트를 사용하여 하나 이상의 호르몬 유전자를 표현하는 세포를 제거하십시오. R 패키지 seurat를 사용하여 총 고유 분자 식별자에 의해 유전자 발현을 정상화하고 세포 수준에서 10, 000의 스케일 인자에 곱한다.
그런 다음 모든 세포의 평균 발현 및 분산을 사용하여 가변 유전자를 검출합니다. 조직 및 세포 유형에 따라 컷오프를 조정합니다. 가변 유전자를 가진 주요 성분 분석을 수행합니다.
선택한 수의 주성분이 있는 클러스터 셀입니다. 세포의 나머지 부분과 하나의 세포 클러스터를 비교하여 세포 클러스터 농축 유전자를 파생시십시오. 이 단세포 RNA 시퀀싱 프로토콜에서, 획득한 인간 섬은 RNA 형광 및 C2 혼성화에서 알파 및 베타 세포에 의해 검증된 바와 같이 먼저 해리되었다.
분할 단계 다음 에멀젼의 성공적인 예는 젤 구슬에서 분리 된 최소한의 분할 오일과 균일 한 창백한, 흐린 솔루션을 보여줍니다. 대조적으로, 젤 구슬과 오일 사이의 명확한 위상 분리와 가난한 품질 에멀젼칩 실행 중 나막신 때문일 수 있습니다. 상호 보완적인 DNA 증폭 후에, 대표적인 단편 크기 분포는 1, 000 에서 2, 000 염기 쌍 근처에 상주하는 우수한 상보적인 DNA 견본을 위한 전형적인 피크를 보여줍니다.
600개의 염기 쌍 근처의 스파이크는 islet-보완 DNA에 특이적이었습니다. RNA 시퀀싱 라이브러리를 위한 단편 크기의 분포는 300에서 500개의 베이스 쌍 사이였습니다. 클러스터링 분석은 T 분산 스토세스틱 이웃 포함 치수의 공간에 있는 12개의 세포 모형을 밝혔습니다.
알파 세포에 있는 3개의 하위 인구 및 베타 세포에 있는 4개가 드러났습니다. 이 기술은 연구원이 인간 섬에 대한 포괄적 인 세포 섬을 구축 할 수 있습니다. 비 당뇨병 과 당뇨병 기증자에서 더 많은 데이터, 그것은 치료 대상 발견에 대 한 자원에 사용 됩니다.
