Name: single-cell gene expression profiling using facs and qpcr with internal standards
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
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우리는이 프로토콜의 개발 과정에서 셀 정렬을 수행하는 그녀의 도움에 대해 CCR ETIB 유동 세포 계측법 코어에서 V. 카푸어에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한이 프로토콜의 개발하는 동안 qPCR에를 수행에서의 원조 M. Raffeld과 CCR LP 분자 진단 장치 및 J. 주홍 및 NHLBI DNA 시퀀싱 및 유전체학 코어 감사합니다. 이 연구는 NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.

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The authors have nothing to disclose.

우리는 배양에서 성장 부착 세포 집단에서 개별 포유 동물 세포를 분리하는 각 셀에서 약 96 유전자의 발현을 분석하기위한 방법을 제시하고있다. 이 방법은 잘 작동하는 좋은 사전 준비는 매우 중요하다. 프라이머는 단일 셀 측정의 품질을 결정으로서 특히 주목 사체 (1.2~1.3 단계) 특정 설계 및 테스트 프라이머 쌍은, 시간 소모적이지만 중요한 단계이다. 신뢰할 수있는 프라이머 쌍을 얻을되고 나면, 그들은 관심의 성적에서의 cDNA를 증폭하는 데 사용됩니다; 앰플 리콘은 표준 (1.4 단계) 할 몰량에 함께 결합됩니다. 표준 절대 성적 계수를 추정하기 위해 필요하므로이 단계는 매우 중요하다; 표준 한번 만들어 분주하고, 세포 선별 유전자 발현 측정의 모든 후속 라운드를 사용한다. 마찬가지로, 세포 분류되어있는 날에, 그것은 특히 importan 인t은 용해 버퍼의 판 (3.7 및 3.11 단계) 할 때 신중하게 낮은 결합 피펫 팁과 마이크로 원심 튜브를 사용하여 표준을 희석합니다. (단계 4.2) 셀 소터를 목표로 또 다른 중요한 단계입니다; 세포가 성공적으로 PCR 플레이트에 용해 버퍼 9 μL의 대상을 칠이 순서대로 매우 신중하게 수행해야합니다. 연구의 다양한 요구에 적응하게 할 수있는 프로토콜의 여러 변형이있다. 여기서는 유전자 발현을 정량하기위한 비교적 저렴한 방식을 제공하는 염료 계 qPCR의 방법을 DNA 결합에 초점을 맞추었다. 그러나,이 방법은 형광 신호 모든 DNA를 증폭하기 때문에, 오프 - 표적 서열 결과 심지어는 높은 배경 신호를 생성하기위한 가능성이있다. 이러한 배경이 특정 표적을 증폭하는데 사용되는 프라이머 쌍은 단일 피크를 정확한 크기의 단일의 PCR 생성물 (도 2와 용융 곡선을 산출하도록함으로써 최소화 될 수있다). 배경이 여전히 품질 관리 방법을 이용하여 후에 문제가되는 경우에는 프로브 계 qPCR에 접근 시약의 큰 비용이라도 오프 - 타겟 검출을 최소화하기 위해 사용될 수있다. 또 다른 옵션은 프라이머 한 세트 - 스크립트 작성 역방향 및 전 사체의 큰 영역이 큰 영역에 포함 된 더 작은 영역을 증폭 프라이머의 제 2 세트를 증폭 할 RTSTA 단계에서 사용되는 중첩 PCR 접근법 일 것이다 , qPCR에 의해 유전자 발현을 측정하는 데 사용됩니다. 이 방법은 염료 계 23 qPCR의 DNA 결합의 특이성을 향상시키는 것으로 나타났다. 여러 방법은 유전자 발현 분석을 위해 각각의 세포를 분리 할 수있다. 세포 분리 방법의 선택은, 셀의 소스가 (예를 들어 조직으로부터 일차 전지에 비해 확립 된 세포주로서) 평가 (예, 형광 활성화 된 세포 분류기와 같은) 장치의 이용 등 여러 가지 요인에 따라, 또는세포가 분리되어야하는 속도. 이 프로토콜에서 제공되는 예에서는 명확하게 검출 가능한 형광 표지 된 단백질을 발현하는 세포주의 FACS를 이용했다. FACS는 희귀 세포 탐지 기능과 상대적으로 빠른 세포 분리의 장점을 가지고있다. 방법의 일 과제는 96 웰 PCR 플레이트에 용해 버퍼의 필요한 작은 볼륨으로 관심 셀의 증착이 비효율적 일 수 있고, 성공적 분리를 보증하기 위해 셀 정렬 구조의 최적화를 필요로 할 수 있다는 것이다. 낮은 속도 및 / 또는 더 높은 비용으로 세포 분리의 정밀도가 더 발생할 수 대안 적 방법은 개별 세포의 micropipetting, 종양 샘플에서 특정 세포의 레이저 캡처 미세 절제 또는 마이크로 유체 시스템의 사용 (예를 들어, 플루 C1 포함 체계). 여기에 설명 된 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 것은 내부 통제, 정제 된 PCR 증폭의 희석 시리즈, 전자입니다<html> 각 셀 내의 각 증명서의 절대 수의 추정을 네이블. 이러한 표준없이, 유전자 발현의 상대적 수준은 C의 t 값으로부터 도출 된 계산에 기초하여 얻어 질 수있다. 그러나, 이들 표준 절대 성적 계수가 이상적으로 정확하게 정량 된 앰플 리콘 표준 (도 8)의 범위 내 보간을 통해 추정 될 수있다. 유전자 발현의 정량화 중 PCR 기반 방법으로, 정확한 절대 정량 역전사를 포함하여 각 공정의 효율에 대한 지식을 필요로한다. 단일 세포에서 전사 수준을 정량화 현재의 과제는 여러 방법에 대한 검출 한계가 사체의 상당의 신뢰성 정량 방지 셀 (24) 당 10 ~ 100의 mRNA로 추정된다는 것이다. 다른 방법으로, 하나는 특히 관심의 대상을 정량화하기 smRNA 생선을 사용할 수 있습니다거의 성적 증명서에 포함 엉덩이 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 25, 26,. smRNA 물고기 진보는 적절한 장비 주어진 일단 (27)에서 검출 될 수있는 별개의 성적의 개수와 28 번 프로파일 링 할 수있는 세포의 수를 확대하고있다. smRNA FISH 자체 한계가 있지만 (전위 위양성 및 위음성 사체 검출 셀당 몇 표적 유전자에 대한 제한, 장비 및 시약의 비용), 이는의 결과를 보완하고 검증 할 수있는 강력한 방법을 제공 할 수있다 관심의 대상 유전자의 부분 집합의 qPCR에 기반 분석.

집단 내의 개별 셀은 균일 생리적 자극 1,2,3,4 널리 상이한 응답을 표시 할 수있다. 인구의 세포의 유전 적 변이는 응답이 다양한 한기구이지만, 심지어 세포의 클론 인구에서, 응답의 변동성을 증가시킬 수있는 몇 가지가 아닌 유전 적 요인도 있습니다. 예를 들어, 각각의 단백질과 다른 중요한 신호 분자의 농도는 하류의 유전자 발현 프로파일의 변동을 초래하는, 셀별로 달라질 수있다. 또한, 유전자 활성화 버스트 7, 8, 9 당 사체 비교적 적은 수로 제한 될 수있다 사체 (5), (6)의 짧은 지속 기간의 버스트에서 발생할 수있다. 이러한유전자 활성화에 확률 성이 크게 생물학적 반응의 다양성에 기여하고, 생리 학적 자극에 반응하는 미생물 (10) 및 포유 동물 세포 (1)에 2 선택적인 이점을 제공 할 수있다. 인해 변형 모두 유전 및 비유 전적 소스, 자극에 대한 응답에서 특정 셀의 유전자 발현 프로파일은 벌크 응답의 측정으로부터 구한 평균 유전자 발현 프로파일과 크게 다를 수있다. 개별 세포가 자극에 응답하여 변화 표시되는 범위를 결정하는 개별 세포의 분리를위한 기술을 필요로 관심 사체에 대한 발현 수준을 측정하고, 얻어진 발현 데이터의 계산 분석. 비용의 넓은 범위를 덮고, 단일 세포에서의 유전자 발현을 분석하기위한 몇 가지 방법이 있으며, 전 사체의 수 프로브 및정량의 정확성. 예를 들어, 단일 셀 RNA-SEQ은 전사 따르면 개별 셀에서 가장 높은 발현 유전자 고유 사체 수천 정량화하는 능력의 다양한 깊이를 구비하고; 비용 감소를 계속하지만 그러나, 이러한 시퀀싱 깊이와 관련된 비용이 엄청날 수있다. 반대로, 현장 하이브리드 (smRNA의 FISH)에서 단일 분자 RNA의 형광에 대한 성적 증명서의 정확한 정량을 제공에도 낮은 발현 관심의 유전자에 따라 합리적인 비용으로 유전자; 그러나, 표적 유전자의 소수만이 방법에 의해 주어진 셀에서 분석 될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 정량 PCR 기반의 분석은, 이러한 기술 사이의 중간을 제공합니다. 이 분석은 96 개의 셀을 한 번에 관심 96 사체까지 정량화하는 마이크로 유체 실시간 PCR 기계를 사용한다. 상기 한 방법들의 각각은 필요한 하드웨어 비용이 있지만, 개별의 qPCR 분석의 비용은 상대적이며낮은. 이 프로토콜은 마이크로 유체 실시간 PCR 기기의 제조업체 (프로토콜 ADP 41, 플루)에 의해 제안 된 하나에서 적응된다. PCR을 기반 접근 방식의 각 증명서의 절대 수의 추정을 가능하게하기 위해, 우리는 여러 실험을 통해 사용할 수있는 준비된 표적 유전자의 증폭의 내부 통제의 사용을 할 수있는 프로토콜을 확장했다. 이 기술의 일례로서, MCF-7 인간 유방암 세포에서 p53 유전자에 의해 조절 유전자 발현의 정량화 11를 설명한다. 세포는 DNA 이중 가닥 휴식을 유도하는 화학 제로 도전. 이전의 연구는 DNA 이중 가닥 나누기에 p53의 응답이 모두 p53의 수준 (12)의 측면에서 별개의 표적 유전자 (11)의 활성화에 개별 셀의 이질성의 큰 거래를 나타내는 것으로 나타났습니다. 또한, p53의 100 개 이상의 발현을 조절세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 13, 14을 포함한 다수의 다운 스트림 경로에 관여 표적 유전자를 잘 특성화. 각 세포에서 p53에 매개 반응은 복잡하고 변수 모두이기 때문에, 접근법에서 시스템 이익 분석은 거의 100 표적 유전자는 예컨대 이하에 설명하는 개별 세포를 동시에 탐색 할 수있다. (예 : 단일 셀 분리 및 용해를위한 대안의 방법)를 약간의 수정 프로토콜 용이 포유 동물 세포 유형 성적 및 세포 반응의 다양한 연구에 적용 할 수 있습니다. 적절한 사전 준비로, 세포 선별 유전자 발현 측정 라운드는 3 일 동안이 프로토콜에 따라 수행 될 수있다. 다음 타이밍 제안 : 사전에 관심있는 성적표를 선택 파악하고 그 transcr에서의 cDNA를 증폭 프라이머 쌍을 확인IPTS, 그리고 표준과 그 프라이머를 이용하여 프라이머 믹스를 준비합니다. 1 일에, 세포 치료, 수확을 다음과 세포를 분류, 역전사 및 특정 대상 증폭을 수행하고, 비법 인 프라이머를 제거하는 엑소 뉴 클레아 제와 샘플을 취급합니다. 제 2 일에, qPCR에를 사용하여 정렬 세포에 대한 품질 관리를 수행합니다. 마지막 3 일에 qPCR에 미세 유체를 이용하여 정렬 세포에서 유전자 발현을 측정한다. 그림 1은 관련된 단계를 요약 한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample &amp;amp; Assay Loading Reagent Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Certified (US)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal Sealing Film, Sterile</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (loading machine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Analysis software&amp;nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell gene expression profiling using facs and qpcr with internal standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

프로토콜의 일반적인 개요는 세포 치료, FACS에 의해 단일 세포를 분리하는 단계를 포함한도 1에 도시 된 생성 및 단일 세포 용 해물, 단일 세포의 cDNA 라이브러리 확인의으로부터의 cDNA 라이브러리의 프리 앰프 정렬 웰 및 qPCR에 의한 유전자 발현의 측정. 단일 셀 분리 및 유전자 발현 분석을위한 준비에있어서, 먼저 각각의 관심 대상 유전자 유효 올리고 뉴클레오티드 프라이머 쌍을 식별 할 필요가있다. 그림 2는 프라이머 품질 관리 방법의 두 가지 예를 보여줍니다. 용융 곡선은 프라이머 쌍은 테스트중인과 qPCR에 다음 생성됩니다. 유효한 프라이머는 단일 피크 (도 2A, 녹색 곡선)과 용융 곡선을 초래한다. 여러 봉우리 (그림 2A, 파란색 곡선) 또는 발음 어깨 곡선 (Figur 경우즉도 2a를 참조하면, 적색 곡선)이 다중 PCR 산물의 존재를 나타내고, 존재하고, 프라이머가 재 디자인되어야한다. 두 번째 품질 관리 방법으로서, 아가로 오스 겔 전기 영동은 시각적으로 정확한 크기의 단일 밴드 (그림 2B) 테스트를 각각의 프라이머 쌍 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 여러 밴드 또는 잘못된 크기의 밴드는 프라이머 (그림 2B) 유효하지 않은 것을 나타냅니다. 프라이머 검증 및 정확한 증폭에서 qPCR의 표준 라이브러리의 생성에 따라, 셀 정렬이 수행 될 수있다. 예 정렬 방식은 그림 3에 표시됩니다. 각 분류 판은 각 대상 앰플 리콘의 10, 100, 1,000, 10,000 사본, 앰플 리콘 표준의 희석 시리즈를 포함하는 우물을 포함해야한다. 또한, 어떤 세포, 세포를 10, 100 셀이 단일 셀 웰에 부가하여, 정렬되지되는 웰을 포함 할 것을 권장한다.비효율 정렬로 인해, 하나의 셀이 성공적으로 증착되어있는 플레이트의 웰을 확인하는 것이 필요하다. 역전사 특정 표적 증폭에 대한 절차에 따라,이 검증 단계 들어 qPCR을는 하우스 키핑 유전자 (도 4)의 발현을 측정하기 위해 수행되어야한다. 앰플 리콘 표준의 우물 (그림 4, 검은 곡선) 균등하게 증폭 곡선을 표시해야합니다. (적색 곡선 그림 4), &quot;10 셀&quot;우물 (그림 4, 파란색 곡선), 및 &quot;100 셀&quot;우물 (그림 4 또한 &quot;아니오 셀&quot;우물에 해당하는 곡선의 명확한 구분이 있어야한다 ; 보라색 곡선). 명확한 분리는 성공적으로 셀 증착 (그림 4에 해당하는 &quot;1 셀&quot;우물에 대해 발생한다 적은없는 셀 컨트롤 만 g에 대한보다 C의 t 값 녹색 증폭 곡선무 세포 컨트롤에 대한 그 근처 C의 t 값) 녹색 곡선, 실패 전지 증착 (그림 4 대 10 셀 컨트롤 것)보다 reater. 단일 세포 용 해물과 웰이 식별되고 나면, (잠재적으로 여러 플레이트로부터) 웰로부터 cDNA를 웰 당 하나의 단일 세포 용 해물과 함께 qPCR에 미세 유체 칩에 전송 될 수있다. 예를 들어,도 5는 서로 다른 세 가지의 qPCR 분석 한 새 플레이트로 96 웰 플레이트를 정렬에서 단일 세포로부터 cDNA를 결합한 가상 어레이를 도시한다. 많은 없거나 제로 유전자 발현 측정 값 (도 7에 화살표로 나타내는 행) 또는 비정상적으로 낮은 하우스 키핑 유전자의 발현에 의해 나타낸 바와 같이 미세 유체 qPCR의 결과를 분석 할 가능성이있는 셀을받지 않은 샘플 먼저 제거되어야한다. 각 분석의 경우, 용융 피크 모든 측정은이 인접 해의 것과 일치하지 않습니다동일한 분석에서 연구 샘플도 제거해야합니다. 불량 샘플 측정을 제거한 후, 선형 회귀 분석은 각 단일 세포 샘플에서 관심있는 각각의 성적의 절대 수를 추정하는 앰플 리콘 표준에 대응하는 측정을 수행 할 수있다. 그림 8은 beeswarm와 바이올린 플롯으로, 역전사 효율 × 분자 단위로 측정이 유전자 발현 추정의 시각화를 보여줍니다. 이러한 예에서, 비 처리 세포는 여러 세포에서 모두 발현되지 CDKN1A와 2 차의 크기에 걸친 수준에서 유전자를 발현하는 사람과, CDKN1A 발현 수준의 넓은 범위를 도시한다. 3 시간 동안 neocarzinostatin (NCS) 치료 후, 대부분의 세포는 훨씬 높은 수준 CDKN1A을 표현하고 변동성이 크기의 약 단일 주문 감소한다. 치료 증가의 기간으로, CDKN1A 발현의 평균 수준은 감소하고 가변성<html> 식을 확장합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig1.jpg" /> 그림 1 : 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링의 단계의 개요. 처리 된 세포는 수확 직접 용해 버퍼에 FACS를 통해 분류되어 있습니다. 관심의 mRNA 종 역전사되고, 생성 된 cDNA를 PCR에 의해 증폭된다. 각 샘플의 하우스 키핑 유전자 발현은 샘플 실제로 셀을 획득하는 판별 qPCR에 의해 측정된다. 이 품질 관리 시험을 통과 샘플에서 최대 96 유전자의 발현을 qPCR에 미세 유체를 이용하여 측정된다. 이 수치는 이전의 출판물 (11)에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 19 / 55219fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2 : 프라이머 테스트의 예 결과. (A)는 qPCR에에서 곡선을 용융. 파란색 용융 곡선 (TNFRSF10D)는 여러 봉우리가 있고 붉은 용융 곡선 (TRIM22)는 가까운 첫 번째 피크에 두 번째 피크 금액은 &quot;어깨&quot;를 가지고있다. 다음은 그 반응에 사용 된 프라이머는 여러 대상을 증폭 및 재 설계 할 필요가 있음을 나타냅니다. 녹색 용융 곡선 (SCN3B)는 하나의 목표를 증폭 프라이머와 일치하는 단일 피크를 갖는다. (B) 아가로 오스 겔에서 DNA의 실행을 증폭. SCN3B, TRIM22 및 TRPM2에 대한 차선 여러 밴드를 포함; 그 DNA의 증폭을 위해 사용 된 프라이머는 다수의 표적을 증폭하고 재 설계 할 필요가있다. TNFRSF10D의 차선은 하나의 목표를 증폭 프라이머와 일치 하나의 밴드를 가지고 있습니다. 그것은 TNFRSF10D 대한 이러한 겔이 테스트를 통과하지만, 용융 곡선을 실패 동안 SCN3B 용 프라이머 용융 곡선 테스트를 통과하지만 겔 테스트 실패 것을 주목할 가치가있다테스트; 프라이머 검증이 두 가지 방법은 상호 보완 적이다. 이 예에서, 하나는 네 개의 프라이머 세트를 재 설계 할 필요가 있다고 결론 지을 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig3.jpg" /> 그림 3 : 셀 정렬을위한 플레이트지도. 이 플레이트 맵 1 셀 웰 (적색), 10, 100 셀 웰 (진한 적색), 표준 (녹색), 어떠한 셀 웰 (흰색)를 포함한다. 각각의 접시에 각각의 표준이 복제를 포함하면 표준의 변화를 보상하는 데 도움이됩니다. 10 셀 100 셀 우물을 포함하는 유전자 발현에 대한 전성 검사로 유용합니다. 무 세포 웰은 네가티브 대조군으로서 작용한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig3large.jpg" target="_blank">t의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그의 그림. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig4.jpg" /> 그림 4 : GAPDH의 발현을 측정하는 일종의 품질 관리에서 qPCR의 증폭 곡선의 예. 어떤 세포 샘플 (적색) 식의 배경 레벨을 표시하지 않는다. 두 가지 그룹, 고 발현 한과 무 세포 샘플과 유사한 낮은 표현 하나에 1 셀 샘플 (녹색) 분할. 고 발현 샘플은 대부분 정렬 중에 리얼 셀을 수신; 저 발현 샘플은 대부분하지 않았다. 10 세포 (파란색)와 셀 (100) (자주색) 샘플 1 샘플 셀보다 높은 발현을 보여준다; 10 세포 샘플 때문에 정렬 비효율 최고 발현 한 세포 샘플에 가깝다. 예상대로 (검정) 표준은 균일하게 분산된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig5.jpg" /> 그림 5 : 샘플의 예 판지도를 믹스. 이 판지도 qPCR에 (H11-H12에 대한 1 셀의 세 가지 다른 판 (행 AG)로부터 샘플, 세 판 (H1-H8), 아니 셀 컨트롤 (H9-H10)에서 혼합 표준과 노 템플릿 컨트롤이 포함되어 있습니다 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig6.jpg" /> 도 6 :로드 (1, 2, 3 ...)의 순서로 qPCR의 마이크로 유체 칩의 다이어그램. 노치 (A1)은 플레이트의 왼쪽 상단 코너입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig6large.jpg" target="_blank">생의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>의 그림입니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig7.jpg" /> 그림 7 : qPCR에 결과의 열지도. 각 행은 한 세포 샘플 표준 또는 컨트롤을 나타내고; 각 열은 측정 된 성적 증명서를 나타냅니다. 검은 사각형 또는 X가 (화살표)의 비정상적인 수의 행 가능성이 실제 셀을받지 않은 샘플을 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/55219/55219fig8.jpg" /> 그림 8 : Beeswarm와 바이올린 플롯. beeswarm 플롯 (청색 점)에서, 각 점은 특정 세포에서의 유전자 발현을 나타낸다. 바이올린 플롯 (회색 형상)에서 &quot;바이올린&quot;의 폭은 유전자 발현 measu의 주파수를 나타낸다분석 세포 집단의 특정 수준의 주위에 rements. 밝은 파란색 막대는 가장 낮은 수준을 나타냅니다. 파란색 막대 내에서 측정이 추정되는 동안 파란색 막대 위의 측정은 표준 사이에 보간됩니다. 여기에 도시 된 데이터는 DNA 이중 가닥 나누기를 유도하기 위해 지정된 시간에 대한 neocarzinostatin (NCS)으로 처리 금성 태그 p53의 발현 MCF-7 세포에서 발현 CDKN1A 측정한다. 이 수치는 이전 간행물 (11) 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55219/55219fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 조건 </td><td> 온도 </td><td> 시각 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 50 ° C </td><td> 15 분 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 95 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 20주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 15 초 </td></tr><tr><td> 60 ° C </td><td> 4 분 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 역전사 및 특정 대상 증폭 (RTSTA) 열 사이클링 프로그램입니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 조건 </td><td> 온도 </td><td> 시각 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 37 ° C </td><td> 30 분 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 80 ° C </td><td> 15 분 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table>표 2 : 엑소 뉴 클레아 제 I 처리 (EXOI) 열 사이클링 프로그램입니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 볼륨 / 웰 (μL) </td><td> / 10 % 없더군요 w (96) 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 배 반응 믹스 </td><td> 5.00 </td><td> 528.00 </td></tr><tr><td> 역전사 효소 / 중합 효소 믹스 </td><td> 0.20 </td><td> 21.12 </td></tr><tr><td> 10 배 STA 프라이머 믹스 </td><td> 1.00 </td><td> 105.60 </td></tr><tr><td> 2.64 U / μL (희석)의 RNAse 억제제 </td><td> 0.02 </td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> 클레아없는 물 </td><td> 0.78 </td><td> 82.48 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 7.00 </td><td> 739.20 </td></tr></tbody></table>표 3 : 세포 용해 완충액의 성분. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 볼륨 / 웰 (μL) </td><td> / 10 % 없더군요 w (96) 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 클레아없는 물 </td><td> 2.52 </td><td> 266.00 </td></tr><tr><td> 엑소 뉴 클레아 제 I의 반응 버퍼 (10 배) </td><td> 0.36 </td><td> 38.00 </td></tr><tr><td> 엑소 뉴 클레아 제 I (20 U / μL) </td><td> 0.72 </td><td> 76.00 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 3.60 </td><td> 380.00 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 엑소 뉴 클레아 제의 성분은 증폭 된 cDNA 샘플을 치료 혼합한다.

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Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

연구

유전학

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

환경과학

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

발생학

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding of the basis of various diseases as well as resistance and/or susceptibility mechanisms. However, FFPE tissues, which represent the most common method for preserving tissue morphology in clinical specimens, are not the best sources for gene expression profiling analysis. The RNA obtained from such samples is often degraded, fragmented, and chemically modified, which leads to suboptimal sequencing libraries. In turn, these generate poor quality sequence data that may not be reliable for gene expression analysis and mutation discovery. In order to make the most of FFPE samples and obtain the best possible data from low quality samples, it is important to take certain precautions while planning experimental design, preparing sequencing libraries, and during data analysis. This includes the use of appropriate metrics for precise sample quality control (QC), identifying the best methods for various steps during the sequencing library generation, and careful library QC. In addition, applying correct software tools and parameters for sequence data analysis is critical in order to identify artifacts in RNA-seq data, filter out contamination and low quality reads, assess uniformity of gene coverage, and measure the reproducibility of gene expression profiles among biological replicates. These steps can ensure high accuracy and reproducibility for profiling of very heterogeneous RNA samples. Here we describe the various steps for sample QC, library preparation and QC, sequencing, and data analysis that can help to increase the amount of useful data obtained from low quality RNA, such as that obtained from FFPE-RNA tissues.

This method describes the steps to improve the quality and quantity of sequence data that can be obtained from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) RNA samples. We describe the methodology to more accurately assess the quality of FFPE-RNA samples, prepare sequencing libraries, and analyze the data from FFPE-RNA samples.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

생화학

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

의학

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

디지털 바 코딩 플랫폼을 사용에 감염 미생물의 유전자 발현 프로파일 링

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

면역학 및 감염병학

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

생물학

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...