이 방법은 Mirian 수질 호흡기 네트워크의 캡처 된 분석을 위해 설치류 뇌간의 재현 가능한 해부 및 슬라이스를 용이하게합니다. 이 기술은 뛰어난 실험적 유연성을 제공하므로 체외 차단 해제 또는 녹화를 위한 슬라이스 준비를 준비할 수 있습니다. 이 방법은 호흡 리듬을 생성하는 신경 통제 회로를 탐구하고 유전자 변형 설치류에서 호흡의 병리학 및 변태를 이해하기 위하여 전기 생리학 실험에 사용될 수 있습니다.
neuraxis의 해부 후, 동물의 고립 된 트렁크를 해부 현미경 의 밑에 방면 챔버로 신속하게 옮기고 조직 등쪽을 위로 놓고, 연막 끝이 챔버의 전면을 향하고 있다. 어깨에 조직을 고정하고 척수의 가장 caudal 끝은 피질과 두개골의 밑에 뇌간을 손상시키지 않도록 정수리 봉합사 다음 두개골을 통해 중증 절개를 합니다. 처진 봉합사에서 시작하여 측면으로 작업하여 두개골의 후두 봉합사를 잘라 두개골의 반사 및 고정되어 두개골의 장밋빛을 고정하고 안정화시킬 수 있는 뼈의 플랩을 만듭니다.
두 두개골 플랩을 모두 반사 한 후, 대뇌 피질의 나머지 부분을 소비, 등색 라미네절절제술을 수행하기 위해 상대적으로 그대로 소뇌의 소살 부분을 떠나. 마이크로 스프링 가위와 집게를 사용하여 두개골과 척추 컬을 둘러싼 근육을 제거하십시오. 흉곽의 등쪽 측면을 따라 조직을 제거하고 갈비뼈를 그대로 두고 척추 라미나의 측면 과정을 조심스럽게 잘라낸다.
폰과 메둘라를 덮어 내는 조직을 잘라낸 후, 척수의 진실, 소뇌, 폰 및 시작이 명확하게 드러날 것입니다. 복부 심근 절제술을 수행하려면 조직 등쪽을 아래로 놓고 흉곽과 척추의 가장 caudal 끝에 고정하십시오. 두개골 플랩을 사용하여 조직의 장밋빛을 고정하고 흉골과 모든 복부 장기를 포함한 흉곽의 복부 절반을 제거하십시오.
갈비뼈와 척수를 노출하고 혀, 식도, 기관, 후두 및 두개골과 척추의 기지를 덮어 다른 연조직과 근육의 모든 제거 흉곽에 부착 된 연조직을 해부. 단단한 팔레트를 식별하기 위해 v 자형 들여쓰기를 포함하는 두개골 기저부뼈의 직사각형 플레이트를 과도하게 둘러싼 조직을 해부합니다. 그런 다음 팔레트의 중간선을 따라 잘라 조심스럽게 조직을 위쪽으로 들어 올리고 이를 제거하기 위해 횡방향 컷을 수행합니다.
복부 성 근막 절제술을 시작하려면, 라미나, 첫 번째 자궁 경부 척추에서 뇌간과 척수의 복부 표면을 노출하여 흉부 척추 7에 약 7을 노출하고 라미나의 척추 의 양쪽을 따라 5 ~ 10 밀리미터를 잘라. 척수가 노출되면, 약 20~25밀리미터의 뿌리를 양간으로 자르고, 척수를 따라 약 T7로 자르고 C1, C2 및 C3의 로스트랄 가장자리를 후크 또는 구부러진 집게로 조심스럽게 들어 올려 세 척추를 제거하기 위해 뼈 아래를 잘라낼 수 있게 합니다. 척수의 원하는 길이가 척추 기둥에서 분리된 경우 척수 조직을 제거하기 위해 횡방향 절단을 합니다.
두라를 제거한 후, 플라스틱 절단 블록에 파라핀 플랫폼의 중앙에 뇌간을 놓고 미세 한 곤충 핀을 사용하여 1센티미터 이하로 트리밍하여 말단 척수를 통해 뇌의 소달 끝을 고정시십시오. 그런 다음 비브라톤 블록 홀더의 고정 된 뇌간과 파라핀 덮인 절단 블록을 정렬하여 블레이드가 뇌의 로스트랄 면에 수직으로 절단되도록합니다. 다음으로, 조직의 가장 끝에 고르지 않은 외투 조직의 200 ~ 300 마이크로미터를 제거하기 위해 초기 슬라이스를 만들고, PARP 선형성과 고르지 않은 조직을 제거하기 위해 작은 컷을 보장하기 위해 필요에 따라 작은 조정을합니다.
글로시인두 뿌리는 뇌의 측면 가장자리에서 볼 수 있게 되고, 이러한 로스트랄 신경 해부학 마커로부터 뇌의 300~500 마이크로미터 슬라이스를 잘라 보칭거 이전 복합체 및 관련 전송 회로를 캡처합니다. 모든 슬라이스 절차 단계는 강력한 리듬을 생성하기 위해 올바른 방향으로 필요한 모든 뉴런 회로와 함께 재현 가능한 실행 가능한 슬라이스를 만드는 데 중요합니다. 피망 리듬을 생성하고 전송하는 데 필요한 최소한의 신경 회로 요소는 모두 이 방법을 사용하여 얇은 슬라이스로 캡처할 수 있습니다.
전 보칭거 복합체를 포함 하 여, hypoglossal 모터 뉴런 및 hypoglossal 신경 루트에 투영 하는 전 운동 뉴런. 사전 보칭거 복합체, 저혈당 또는 12번째 두개골 신경 뿌리제 및 C4 신경 뿌리제는 호흡 에 사용할 수 있습니다. 이 절차의 주요 측면은 루트릿의 주의 깊은 격리와 최종 슬라이스를 절단하기 전에 뇌간이 손상되지 않았는지 확인하는 것입니다.
이 절차에 따라, 전기 생리학 기록은 네트워크에 의해 생성 된 전기 활동을 기록하기 위해 패치 클램프 방법, 여분의 세포 기록 또는 흡입 전극을 사용하여 만들 수 있습니다. 이전에 발표된 프로토콜은 단계별 세부 사항을 거의 제공하지 못해 새로운 연구자가 다른 실험실로 여행하고 조미조사자와 시간을 보내지 않고이 방법을 사용하기가 어려워졌습니다.
