우리는 그의 과학적인 조언과 현미경 장비에 UNIL의 이미징 CIF 플랫폼에 특히 모니크 Nenniger 그녀의 뛰어난 기술 지원 Tosato뿐만 아니라 장 - 이브 Chatton 감사드립니다. 자금은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 제공되었다.

1. 마우스 VNO의 해부 <ol><li> 성인 마우스를 사용합니다. 페로몬 감지가 multimodalities에 연루되어 마찬가지로, 변종, genotypes, 성별과 연령 사이의주의 구별은 중요하고 결과에 영향을 미칠 것이다. 여기, 우리는 이전 페로몬 - 수용체 쌍 (2 heptanone - V1rb2) 31 (그림 1A)의 식별에 사용되는 성인 VG 마우스 30을 선택합니다. </li><li> NaCl 118 MM, NaHCO 3 25 MM, D - 포도당 10 MM, KCl이 MM, MgCl 2 2 MM, 아니 2 PO 4 1.2 MM, CaCl 2 2, 절개를 시작하기 전에 (ACSF 신선한 차가운 인공 세리 브로 - 척골 액을 준비 MM; oxycarbon (95% O 2 포화 산도 7.4) : 5 % CO 2). 그, CaCl 2를 제외한 모든 ACSF 구성 요소를 섞는다. 직접 oxycarbon로 버블링하여 솔루션을 포화. 결국, CaCl 2를 추가하고 원하는 볼륨 ddH 2 0로 조정합니다. U 때까지 얼음 ACSF 솔루션을 유지SE. </li><li> 마우스의 안락사는 우선적으로 막 실험을하기 전에 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입에 의해 수행되어야합니다. </li><li> 마우스 머리를 자르고. 지속 oxycarbonated 추운 ACSF에서 해부 현미경으로 그것을 놓으십시오. </li><li> 아래턱을 잘라 미각 (그림 1B)를 시각화하기 위해 머리를 위치. </li><li> 마이크로 가위로 미각의 위쪽 부분 (그림의 1B)에 수평 절개를 만들고 마이크로 해부 포셉과 미각 막를 제거합니다. 하이드 레이트와 ACSF (그림 1C)로 노출된 구멍을 청소하십시오. </li><li> 상부를 잘라 비강 심장 (그림 1C)의 하단 부분입니다. 정교한 VNO가 들어있는 비강 심장을 추출하고 얼음 (그림의 1D)에 ACSF에 직접 넣습니다. </li><li> 수직으로 미세 해부 집게를 사용하여 VNO의 두 부분을 분리하고 정교한 VNO의 연골 캡슐 (를 제거그림. 1E). 모든 연골 조각이 제거되었는지 확인합니다. </li></ol> 2. VNO 조직 슬라이스 준비 이 섹션 2)에 설명되어있는 VNO 조직 슬라이스 준비는 주로 칼슘 이미징 조사입니다. VNO 슬라이스 또한 조직의 구조적 무결성을 프로토콜 (섹션 3 참조하시기 바랍니다)) 확인 떠있는 조각에 immunohistostainings 사용할 수 있습니다. <ol><li> 낮은 용융 한천 (표준 PBS 3 %)하고 작업 장소를 준비합니다. 당신은 금형을 포함, ACSF, 마이크로톰 및 지원, 마이크로 해부 집게가 필요합니다 (22 X 22 X 20mm), 정밀 잎사귀, 붓, 조직 문화 접시, cyanacrylat 접착제, 얼음과 온도계. </li><li> 3퍼센트 낮은 용해 한천로 포함 금형을 입력합니다. 온도가 41 이상되어 있지 않은지 확인합니다 ° C 수직 코로나 조각을 얻을 수 있도록 곧 닦아 VNO (그림 2A)를 배치하기 전에. </li><li> 얼음에 포함 금형을 소다음 1 분 및 응고까지에 대한 한천 블록에서 분리. 피라미드 모양의 한천 블록을 잘라 마이크로톰 지원 (그림 2B)에 접착제로 놓으십시오. </li><li> 0.5 mm / s의, 0.7 mm의 진폭과 차가운 ACSF 100 μm의의 두께의 속도로, 마이크로톰와 코로나 VNO의 조각을 잘라 차가운 가득한 조직 문화 판에서 그들을 배치하기 전에 브러시로 조직 조각을 수집 ACSF. </li><li> 당신의 조각이 GFP 같은 내생 형광을 (유전자 타겟 뉴런에서)이 포함되어있다면 당신은 형광 stereomicroscope (그림 2C)에서 그들을 선택할 수 있습니다. </li></ol> 3. VNO 떠있는 조각에 Immunohistochemistry 이 절차의 목적은 제 2에서 얻어진 VNO 조직 슬라이스)의 무결성을 확인하는 것입니다. Acetylated - tubulin은 VNO 감각 뉴런의 dendrites과 microvilli로 표현 미세 소관 / cytoskeleton 마커입니다. 칼슘 이미징 실험, direc 가지tly에 대한 프로토콜 섹션 4). 부동 VNO 슬라이스에 immunohistostaining 방법은 관심의 단백질의 표현의 평가에 적용할 수 있습니다. 이런 목적을 위해, 우리는 4 1H에 대한 VNO 당신을 고칠 것을 ° C를 정착액 솔루션 (PBS, pH를 7.6에서 paraformaldehyde 4 %) 포인트 1.7 이후)이 시점 PBS에서 프로토콜과 사용 산도 7.6에서보다는 좋습니다 ACSF 솔루션입니다. <ol><li> 조직 문화 판에서는 정착액 솔루션에 대한 관심의 조각 (PBS, pH를 7.6에서 paraformaldehyde 4 %) 4 1H ° C. 문제를 해결 </li><li> 0.5 %에서 NGS (혈청 정상 염소) 10 % 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS 용액에 4 박 귀하의 조직 조각 ° C를 차단합니다. </li><li> 0.25 %에서 NGS 5% 그리고 Triton X - 100을 포함하는 PBS 용액에 실온 (RT)에서 16h에 대한 기본 항체와 조각 (안티 acetylated - tubulin, 마우스, 1:2000) 품다. </li><li> NGS 2 % 포함하는 PBS 용액 5 분 동안 3 번 씻으십시오. </li><li> seco와 함께 어둠 속에 품어RT에서 1 시간을위한 NGS에게 2 % 포함하는 PBS 용액에 ndary 항체 (Cy5 - 복합 염소 안티 - 마우스, 1:200). </li><li> NGS에게 2 % 포함하는 PBS로 5 분 3 번 씻어, PBS가 1 %만을 PBS를 NGS. </li><li> 소수성 구분된 지역 (소수성 펜을 사용)의 중심에서 그들을 배치하여 형광등 설치 미디어 (DAPI을 포함하거나하지 않음)에 슬라이스를 마운트하고 coverslips로 조각 커버. </li><li> 공촛점 현미경 및 3D reconstructions (그림 2D - F)를 허용하는 소프트웨어와 함께 관찰과 인수를 확인하십시오. </li></ol> 4. VNO 슬라이스에 칼슘 이미징 <ol><li> 다음 절차는 어둠 속에서 자리를 취할 것입니다. 37 상반기 대한 품어 VNO 슬라이스 ° Fura - 오전 2시 (7 μm의, DMSO 1 mm의 재고 솔루션)와 추위 ACSF 구성된로드 솔루션에 C와 pluronic 0.1 % (W / V, ddH 2에서 20 %의 재고 솔루션 O). </li><li> 사용까지 oxycarbonation와 얼음로드 슬라이스 보관하십시오. 로드된 조각은 보관 수 있습니다3 4h. </li><li> ACSF을 포함하는 재관류 챔버에서 브러쉬와 함께 로드된 조각 장소 및 조직 슬라이스 앵커 (그림 3A)과 슬라이스를 유지합니다. </li><li> 칼슘 이미징 현미경 (그림 3B)의 무대에서 재관류 챔버를 놓고 지속적으로 RT에서 oxycarbonated ACSF와 perfuse. 온도는 바이폴라 온도 컨트롤러의 사용으로 적용할 수 있습니다. </li><li> 로드 VNO의 조각 (그림 3C - E)의 관측은 25x 63x 또는 객관적이고 시원한 SNAP - HQ 카메라로, 거꾸로 형광 현미경으로 수행됩니다. 조명 polychromator 악기와 함께 (380분의 340 NM) 순차적으로 행해지며 5Hz의 속도로 기록됩니다. 필터링 방출은 510 nm의에서 이루어집니다. 세포 내 칼슘 비율 변경 (ΔF = 340 nm/380 NM)는 적절한 소프트웨어를 모니터링하고 있습니다. </li><li> Chemostimulation는 자신의 실험 목적에 따라 선택해야합니다. 여기 ACSF의 perfusions는 페로몬 m을 포함하는IX (isobutylamine, 2 heptanone, 4 heptanone, 2 heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β - farnesene, 10 -6 M), 2 heptanone (10 -6 M) 또는 갓 (남성과 여성의 1 수집 : 1) 마우스 소변 (1:100)는 32 수행됩니다. ATP (125 μm의)의 재관류는 실험의 끝에 생존 능력 테스트로 사용됩니다 (그림 3 층) 및 약 80 % 가능한 뉴런의 비율을 나타내는 것입니다. 이러한 조건에서 조각 2 시간까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 감각 뉴런의 GFP - 태그 subpopulations는 특정 조명 (여기서 V1rb2 표현 뉴런)에 의해 시각 있으며 (그림 3G - I) 정확하게 분석할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 다중 형질 도입 마우스 VNO에서 일어나고, 또는 새 페로몬 - 수용체 쌍을 식별하는 경로를 조사하기 위해 기능 분석을 설정하려면, 우리는 VG 마우스 라인 (그림 1A의 활용 </stroNG&gt;). 이 라인에서, 240 V1Rs 수용체 중 하나를 밖는 V1Rb2 수용체는 vomeronasal 감각 뉴런의 특정 subpopulation의 쉽게 시각화를 허용 GFP - 태그입니다. VNO (그림 1E)의 추출 및 해부 후, 우리는 급성 VNO의 조각 (그림 2C)를 준비합니다. 우리는 acetylated - tubulin 단백질 (그림 2D - F)에 대한 immunohistostainings를 수행하여 준비 tissular 무결성을 확인하고 검증하기 위해, 그들의 일부를 수정. 조각의 다른 분수는 칼슘 이미징 실험에 사용됩니다. 그 내용은 슬라이스는 Fura - 오전 2시 (그림 3C - E)와로드하고 각 신경 세포의 세포 내 칼슘 수준은 ΔF 비율 (그림 3 층)로 모니터합니다. 뉴런의 생존은 ΔF 비율의 신속하고 일시적 증가 (그림 3 층) 예상되는 이후 ATP (125 μm의)의 재관류에 의해 평가됩니다. 페로몬의 주요 원천되고 소변, 신선한의 재관류니 수집 마우스 소변 (1:100)는 내생 컨트롤로 사용됩니다. 그것은 기록된 뉴런 (세포 1과 2, 그림. 층)의 약 50 %의 칼슘 과도를 트리거합니다. GFP 조명 아래 V1Rb2 긍정적인 뉴런이 관찰하며, 알려진 pheromonal 리간드, 2 heptanone의 재관류는 세포 활성화 (셀 1, 그림. 3I)을 시작하고 있습니다. 흥미롭게도, 정품 인증의 연결도 VNO에 페로몬 코딩의 복잡성을 보여주는, V1Rb2 수용체 (GFP 부정적인 뉴런) (세포 2, 그림. 3I)를 표현하지 뉴런의 일부에서 관찰됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> 그림 1. 마우스 vomeronasal 기관의 해부. VG 라인에서 (A) 마우스. (B) 마우스 안락사 후, 미각을 시각화하기 위해 전체 머리가 쌍안경 현미경으로 배치하고 아래턱이 제거됩니다. 작은 가로 절개가 이루어집니다(검은 점선). (C) 미각의 제거 후, ​​VNO 줄지어 비강 심장은 위쪽에서 절단하고 아래쪽 부분 (흰색 점선 라인) VNO 추출을 촉진하기. (D) VNO는 ACSF 솔루션에 위치하고 (삽입 : 두 부품의 높은 전력보기) 구분합니다. (E) VNO의 연골이 캡슐은 정교한 제거하며, 연골 캡슐없이 VNO는 실험의 나머지 부분에 사용됩니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 BE, 1mm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 vomeronasal 급성 슬라이스 준비와 tissular 무결성. (A) 마우스 VNO는 수직으로 한천 3 % 용액에 모두 담겨있다. 한천의 온도가 41 ° C.보다 낮은되어야합니다 (B) 한천 블록은 피라미드 모양으로 절단과 100 μm의 VNO 섹션이 (검은 점선) ACSF에서 생성됩니다. (C) VNO의 조각은 특정을 시각화하기 위해 형광 stereomicroscope에 따라 선택하실 수 있습니다태그 감각 뉴런의 인구. (DF) Tissular 무결성 acetylated - tubulin 단백질, 준비의 완벽한 보존을 보여주 V1rb2 유전자 타겟 뉴런의 높은 전력보기에 대한 immunohistostainings로 평가할 수 있습니다. 오랜 dendrites는 루멘 (E)뿐만 아니라 돌기 손잡이와 microvilli의 구조 단백질의 표현의 표면에 도달과 함께 뉴런은 (F) 볼 수 있습니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 B, 5mm, C, 60 μm의, D, 40 μm의, EF, 20 μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> 그림 3. 칼슘 이미징 및 vomeronasal 급성 조직 조각에서 페로몬 탐지. (A) Fura - 오전 2시 로딩 단계 후, VNO 슬라이스는 재관류 챔버에 배치하고 적응 앵커 (고전력보기)로 유지됩니다. (B) 실험이 어둡고 VNO 조각으로 수행하는가 지속적으로 진공 시스템과 RT에서 ACSF와 perfused 있습니다. 온도가 chos 수 있습니다양극성 Pelletier 요소와 열 프로브로 구성된 온도 컨트롤러 시스템을 사용 ko 페이지를 참조하십시오. 이 특별한 실험 RT에서 수행되었다. (CE) VNO 슬라이스는 (D)와의 연결을 활성화 (E, 여기서 ATP)를하는 동안 전에 호프만 위상 콘트라스트 (C, HV) 또는 Fura 380 NM 조명 아래에서 관찰할 수 있습니다. (F)의 연결 가능성은 ATP (125 μm의)의 재관류로 평가됩니다. 여기 chemostimulation는 소변 (소변, 1:100) 또는 165 ML / H.의 일정한 흐름 속도로 마우스 페로몬을 혼합 (믹스 산도., 10 -6 M)로 이루어집니다 세포 내 칼슘 수준 (ΔF)은 (셀 1-3) 각 셀에 대해 개별적으로 녹음하실 수 있습니다. (G) V1Rb2의 신경 세포가 GFP 조명 (1) 아래에서 시각입니다. (H)이 신경 세포 (1)뿐만 아니라 비 V1rb2 표현 뉴런 (2)의로드가 표시됩니다. (I) V1rb2의 뉴런은 세포 내 칼슘 증가와 함께 2 heptanone에 응답할 수 있습니다. 이 특정되지 않은 V1rb2 표현 신경 세포는 또한 2 heptanone (셀 2)에 응답합니다. 스케일 바는 다음과 같습니다 CE, 20 μm의, GH,15 μm의; ΔF = 340 NM / NM 380. (F와 I) 자극 응용 프로그램의 기간은 각 추적 아래에 막대로 표시됩니다. 임의의 색상 규모는 형광 강도를 나타냅니다.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 칼슘 이미징 방법은, 급성 슬라이스 준비, 마우스 VNO의 뉴런의 반응을 기록 pheromonal 수 있습니다. 이 방법으로 vomeronasal 뉴런에 대한 동물의 해부는 연습과 함께, 쉽게 달성되고 오랫동안 살아있는 조직 준비를 제공합니다. 그것은 약리 조사 또는 pheromonal 코딩의 연구와 같은 시간이 많이 소요 실험을 수 있습니다. 이 생리적 기법으로, 큰 인구뿐만 아니라 정확 subpopulations의 연결은 특히 분석하실 수 있습니다. 또한,이 방법은 쉽게 다른 칼슘 염료에 따라 immunohistochemical 접근이나 실험에 적용할 수 있습니다. 이러한 조합 방법의 사용은 반드시 마우스 vomeronasal 기관 표현 수많은 고아 chemoreceptors에 대한 새로운 pheromonal 리간드의 신분을하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 아데노신 5&#39; - triphosphate 나트륨 소금 용액 (ATP) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A6559 - 25UMO </td><td></td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A7002 - 100G </td><td> 우선적으로 immunohistochemistry을 위해 </td></tr><tr><td> 한천 (낮은 용융) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A0701 - 25G </td><td> 우선적으로 칼슘 이미징을위한 </td></tr><tr><td> CL - 100 바이폴라 온도 컨트롤러 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> W64 - 0352 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 - AffiniPure 염소 안티 - 마우스 IgG </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> 빛과 보호 </td></tr><tr><td> DMSO (디메틸 Sulfoxide) </td><td> 머크 </td><td> 317275 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> 금형을 포함, 껍질 - A - 웨이 </td><td> Polysciences </td><td> 18646A - 1 </td><td> 22 X 22 X 20mm </td></tr><tr><td> 형광등 설치 미디어 (DAPI로 Vectashield, 10 ML) </td><td> Rectolab </td><td> H - 1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA - 오전 2시 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> 빛과 보호 </td></tr><tr><td> Glisseal N (진공 그리스, 60g) </td><td> 보어의 케미 </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> 대형 욕조 기록 챔버 (RC - 26G) </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (칼슘 이미징 소프트웨어, v.7.6.5.0) </td><td> Visitron 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단클론 방지 Tubulin, acetylateD 마우스 항체 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T6793 - .2ML </td><td></td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 (NGS, 10 ML) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> 야근에 대한 플랫폼 (P - 1) </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F - 127, 2g </td><td> Invitrogen </td><td> P - 6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (먹이지 병, 10g) </td><td> 칼 로스 </td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC - 20 듀얼 인라인 솔루션 히터 / 쿨러 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> W64 - 0353 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이스 앵커 (SHD - 26GKIT) </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> 슈퍼 PAP 펜 (소수성펜) </td><td> Pelco 국제 </td><td> 22,309 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> Fluka </td><td> 93420 - 250ML </td><td></td></tr><tr><td> 진동 블레이드 마이크로톰 VT 1200S </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome 고속 polychromator 시스템 </td><td> Visitron 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D 데이터 시각화 (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane 과학 소프트웨어 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

피터 Karlson과 마틴 Lüscher는 내부 종 (species) 통신에 사용되는 화학 물질을 설명하기 위해 1959 1 처음 용어 페로몬를 사용합니다. 페로몬은 휘발성 또는 비휘발성 수명이 짧은 분자이 분비 및 / 또는 소변, 페로몬 3 주 원본으로 알려진 액체로 생물 학적 체액 3,4에 포함되어 있습니다. Pheromonal 통신 등 가족과 상호 작용 5,6, 계층적 조직 3 성적 상호 작용 7,8 등 주요 동물 modalities 다양한 연루되고 결과적으로 직접 주어진 종 9,10,11의 생존과 상관 있습니다. 마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO) 10,12, 비강의 기지에 위치한 이점 구조에 의해 중재되며, 연골 캡슐에 동봉. 각 VNO는 외부와 접촉을 허용 루멘 13,14와 관 모양을 가지고화학의 세계. 감각 neuroepithelium은 주로 vomeronasal 바이폴라 감각 뉴런 (VSNs) 15로 구성되어 있습니다. 각 VSN 화학 감지 16 연루 100 microvilli 최대 베어링 큰 돌기 손잡이로 끝나는 루멘에 하나의 dendrite를 확장합니다. VSNs 수많은 subpopulations이 흐릅니다. 그들은 그들이 17,18을 인식 리간드 (들)에 의해 가능하게함으로써 표현하고 chemoreceptor으로 구분됩니다. 두 가지 주요 vomeronasal 수용체 가족, V1Rs 및 V2Rs 19,20,21,22은 240 23 120 24 회원 각각 구성되어 있으며, neuroepithelium 별도의 레이어에 표현됩니다. 후각 수용체 (ORs) 25 메티오닌 펩타이드 수용체는 (FPRs) 26,27도 VSNs로 표현됩니다. 이들의 연결 subpopulations가 감지 페로몬에 동일한 스트림 신호 경로를 사용 여부에 상관없이 알 수 있습니다. 칼슘 투과 채널 (에 의해 연주 중요한 역할에도 불구하고성숙한 뉴런 28 TRPC2 독립 전달 채널의 microvilli에 존재 TRPC2)는 6,29 제안되었습니다. 의 연결을 subpopulations의 높은 번호와 오르간의 독특한 형태로 인해, VNO에있는 신호 요소의 약리 및 생리 조사가 복잡하고 있습니다. 여기, 우리는 칼슘 이미징 조사를 수행하기위한 마우스 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비를 제시한다. 이것은 생리적 접근은 이전 Fura - 오전 2시, 칼슘 색소를로드 VSNs의 일반 또는 개별 subpopulations의 살아있는 조직의 자연 환경에서 관찰하실 수 있습니다. 이 방법은 GFP - 태그 페로몬 수용체를 공부 또한 편리합니다 그리고 다른 형광 칼슘 프로브의 사용에 대한 적응이다. 예를 들어, 우리는 여기 페로몬 V1rb2 수용체의 번역이 polycistronic 전략에 의한 GFP의 표현에 연결되어있는 VG 마우스 라인 30 사용합니다. </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K 조회수.  University of Lausanne. 마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 - 리간드 식별 편리합니다.

비디오: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

연구

신경과학

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

슬라이스 뜨거운 것이 : 생리적 온도에서 급성 성인 뇌 슬라이스

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...