이 프로토콜은 배양 단계를 간소화하고 고품질 이식물을 얻기 위한 간단한 접근 방식을 통합하고 달팽이관 세포의 분자 메커니즘을 탐구하고 밝히는 데 기여할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 해부 단계, 적절한 폴리머 표면 코팅, 최적화된 중간 부피 및 외식물의 부착 시간을 조정하여 직접 장기 처리를 최소화한다는 것입니다. 이 기술은 감각신경성 난청을 연구하기 위한 인기 있는 체외 접근 방식을 나타냅니다.
이는 이독성 모델을 구축하고, 구조 분석을 수행하고, 신호 전달 경로를 평가하고, 약물 스크리닝 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 원칙적으로 이 방법은 다른 조직 이식에 적용할 수 있습니다. 또한 배아 발달 단계에 대한 통찰력을 얻기 위해 내이 연구에 사용할 수 있습니다.
시작하려면 목이 잘린 쥐의 머리를 멸균 패드에 놓습니다. 가위와 집게를 사용하여 하악골을 제거한 다음 피부를 들어 올려 두개골에서 벗겨냅니다. 두개골을 고정하기 위해 안와강에 겸자를 놓습니다.
날카로운 메스 칼날을 사용하여 달팽이관을 손상시키지 않고 시상 봉합사와 관상 봉합 부위를 따라 두개골을 조심스럽게 자릅니다. 이제 두 개의 두개골 반쪽에서 뇌를 제거합니다. 현미경으로 측두골의 달팽이관을 국소화하고 달팽이관과 측두골 사이의 주변 조직을 풉니다.
그런 다음 겸자를 상반고리관에 놓습니다. 측두골을 달팽이관에서 부드럽게 당겨 빼내고 측두골과 함께 전정에 부착된 달팽이관을 잡습니다. 흰 선으로 보이는 정점 부위에 겸자 팁을 삽입하고 연골 달팽이관 캡슐을 하나씩 제거하여 달팽이관을 노출시킵니다.
겸자를 달팽이관 아래에 놓고 전정 기관과 측두골에서 분리합니다. 달팽이관을 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 새로운 60mm 접시에 옮깁니다. 코르티 이식 장기를 분리하려면 장기를 기저부에 두고 달팽이관을 기저고리 부위에 고정하고 달팽이관을 찢지 않고 달팽이관을 부드럽게 풉니다.
그런 다음 달팽이관 기저부를 잡고 나선형 인대와 선조체 혈관을 잡아당깁니다. 인공와우 이식을 분리하기 위해 겸자를 사용하여 골성 나선형 층판에서 나선형 신경절을 분리하고 분리하는 동안 모디올러스를 풉니다. 겸자로 후크 부분을 잡고 선조체 혈관이 있는 나선형 인대를 제거합니다.
또한 Reissner의 멤브레인을 한 조각씩 떼어냅니다. 인공와우를 이식하려면 실험실 주걱을 이식이 포함된 접시에 담그십시오. 주걱을 흔들어 유모 세포가 위를 향하도록 몇 마이크로리터의 PBS와 함께 이식을 들어 올립니다.
배지에서 주걱을 부드럽게 흔들어 외형물을 8웰 챔버 슬라이드에 넣습니다. 외식이 챔버 안으로 미끄러지도록 합니다. 100마이크로리터 피펫을 사용하여 80마이크로리터의 배지를 제거하고 폐기합니다.
현미경으로 유모 세포와 나선형 신경절 뉴런 세포의 가시성을 확인합니다. 필요한 경우 겸자를 사용하여 겹치는 조직을 밀어냅니다. 우물에서 남은 매체를 제거합니다.
이제 외식이 챔버 표면에 더 평평하게 놓입니다. 10초 후, 피펫팅을 식재 바로 옆에 한두 방울 떨어뜨리고 나머지 배지는 식생 분리를 방지하기 위해 약간 떨어진 곳에 떨어뜨립니다. 배지를 추가하는 동안 외식이 움직이지 않도록 하십시오.
장기를 챔버 바닥에 단단히 부착하기 위해 2시간 동안 챔버를 배양합니다. 배양 후 배지를 흡인합니다. 그리고 100 또는 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 300 마이크로리터의 신선하고 미리 데워진 완전한 배지를 조심스럽게 추가합니다.
회전하는 원반 공초점 현미경 이미지는 쥐의 코르티 장기 외식이 정상 조건과 스트레스 조건 모두에서 구조와 전체 길이를 유지한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 주사 컨포칼 현미경은 세포 사멸을 겪는 유모 세포와 함께 생쥐 장기에서 외래 식물의 생존 유모 세포를 보여주었습니다. 이 프로토콜은 적절한 세포 투과성 프로브와 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 달팽이관 세포의 생물학적 프로세서를 모니터링할 수 있게 했습니다.
이러한 인공와우 식구의 배양은 유모 세포와 나선형 신경절 세포 간의 상호 작용에 대한 분석을 향상시킵니다. 인공와우의 유모세포는 유모세포 마커인 MYO7A로 검출되었습니다. 유사하게, 건강하고 손상된 나선형 신경절 세포체와 신경돌기는 신경 마커인 Tuj 1을 사용하여 확인되었습니다.
확대된 개요에서 MYO7A 항체로 표지된 유모 세포의 세포체를 볼 수 있었습니다. 외부 유모 세포 입체 섬모 및 팔로이딘으로 표지 된 개별 내부 유모 세포 입체 섬모의 디콘볼루션 이미지가 확인되었습니다. 현미경으로 시술하는 동안, 특히 뼈가 있는 나선형 층판에서 나선형 신경절을 분리할 때 주의를 기울여야 합니다.
온전한 외형물은 조심스럽게 옮기고 정렬해야 합니다. 이 프로토콜은 내이 이식에 대한 시험관 내 연구를 최적화했습니다. 신호 전달 경로 및 약물 독성과 같은 이러한 연구의 결과는 더 광범위한 생체 내 연구의 설계를 안내할 수 있습니다.
