이 방법은 세포 및 tissular 수준에서 myelination 및 재마일레네이션의 기본 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 기본 문화와 생체 내 접근 방식 사이의 교차로에 있습니다. 조직 아키텍처를 보존하는 주요 이점을 가진 빠르고 접근 가능한 모델입니다.
절차를 시연하는 것은 멜리나 테티노트, 박사 후 연구원과 레미 론자노, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 시작하려면 작은 가위를 포라멘 매그넘에 부드럽게 삽입하고 측면을 향해 측면 절개를 한 다음 머리 두개골 주위를 모두 잘라 두개골을 잘라 두개골을 잘라냅니다. 두개골의 등대 부분을 회수하려면 미세하고 직선적인 집게를 사용하여 두개골의 등대 부분을 조심스럽게 들어 올립니다.
그런 다음 복부 두개골과 뇌 사이의 집게를 조심스럽게 소개합니다. 부드럽게 뇌를 뒤집어 작은 가위로 시차 및 삼차 신경을 잘라냅니다. 다음으로, 두개골의 머리 또는 등쪽 부분을 얼음 차가운 해부 배지를 함유한 60mm 세포 배양 접시 바로 위에 거꾸로 돌려 뇌가 중력에 의해 떨어질 수 있도록 돕습니다.
미세 한 집게를 사용 하 여, 등쪽 측면을 향하고 복 근 면 누워 뇌를 지향. 쌍안경 현미경의 밑에, 선뇌 측에 두뇌를 고정하기 위하여 미세하고 직선 적인 집게를 이용하십시오. 그런 다음 뒷뇌를 뇌의 나머지 부분과 분리합니다.
소뇌 아래소뇌를 잘라 서 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 분리. 소뇌가 고립되면, 조심스럽게 수막을 찢어 잘, 직선 집게를 사용합니다. 미세하고 구부러진 집게로 소뇌를 부드럽게 잡고 등쪽을 플라스틱 플랫폼에 올려 헬기 면도날과 수직으로 놓습니다.
다음으로, 멸균, 얇은 끝 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착되어 소뇌부 주변의 해부 매체에 대한 액세스를 흡인시합니다. 그런 다음, 티슈 헬기로 소뇌의 300 마이크로 미터 두께의 처진 부분을 슬라이스합니다. 다음으로, 얇게 썬 소뇌에 해부 매체 한 방울을 부드럽게 넣습니다.
그런 다음, 넓은 멧돼지 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착되어 슬라이스 된 소뇌를 천천히 흡기하고 얼음 차가운 해부 매체를 포함하는 60mm 세포 배양 접시로 다시 옮춥습니다. 다음으로, 두 개의 미세한 직선 집게를 사용하여 개별 조각을 분리합니다. 그런 다음, 넓은 멧돼지 파이펫 팁이 1 밀리리터 파이펫에 부착된 후, 버미에서 선택한 최대 4개의 슬라이스와 6개의 웰 플레이트의 하나의 배양 삽입에 일부 해부 배지를 전달합니다.
얇은 끝 파이펫 팁을 사용하여 슬라이스 주위의 해부 매체에 대한 액세스를 제거합니다. 탈근의 경우, 시험관내 6일 후 배양 삽입물 아래에 있는 모든 배양 배지를 제거하고 밀리리터 LPC당 0.5밀리그램을 함유한 미리 따뜻하고 신선한 배양 배지의 웰당 1밀리리터로 교체하십시오. 이산화탄소 환경의 섭씨 37도에서 15~17시간 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 사전 데운 배양 배지 1밀리리터를 함유한 25밀리리터 페트리 접시에 넣음으로써 인서트를 세척합니다. 그런 다음, 신선한, 미리 데운 배양 매체를 포함하는 새로운 6 개의 우물 접시에 배양 삽입을 즉시 전송합니다. 면역 히스토케를 시작하려면 먼저 집게를 사용하여 배양 삽입을 들어 올리고 그 아래에 배양 배지를 제거하십시오.
그런 다음, 소뇌 슬라이스를 해결하기 위해 멤브레인 인서츠에 1x PBS, ph 7.4에 4 %의 PFA의 2 밀리리터를 추가합니다. 30분 후, 매 세척할 때마다 1x PBS 2밀리리터로 슬라이스를 세 번 씻습니다. 다음으로, 쌍안경 현미경의 밑에, 25x에서 30 배율을 사용하여, 메스 또는 브러쉬를 사용하여 멤브레인서 삽입에서 조각을 부드럽게 분리합니다.
그런 다음 브러시를 사용하여 부동 조각을 4개의 웰 플레이트의 우물로 옮기고, 항체 소비를 제한하는 1x PBS를 함유한다. 그런 다음, 각 우물에서 PBS를 흡인하고 15 ~20 분 동안 영하 20도에서 미리 냉각 된 100 % 에탄올에서 슬라이스를 배양합니다. 인큐베이션 후 100% 에탄올을 흡인하고 1배 PBS로 슬라이스를 간략하게 씻어낸다.
그런 다음, 각 세척 할 때마다 10 분 동안 1 x PBS로 실온에서 두 번 씻습니다. 비특이적 항체 고정 부위를 차단하기 위해 PBS를 흡습하고 1x PBS, 5%NGS 및 0.3%비 이온 세제를 실내 온도에서 30~45분 동안 포함하는 용액으로 슬라이스를 배양한다. 다음으로, 차단 용액에 희석된 1차 항체를 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 슬라이스를 배양한다.
하룻밤 동안 인큐베이션 후, 매 세척 할 때마다 10 분 동안 1 x PBS로 슬라이스를 세 번 씻으시다. 그런 다음 차단 용액에 희석된 이차 항체를 1~500희석 비율로 추가하고 3시간 동안 어둠 속에서 실온에서 슬라이스를 배양한다. 이차 항체와 인큐베이션 후, 매 세척할 때마다 10분 동안 어둠 속에서 1x PBS로 슬라이스를 세 번 씻는다.
다음으로 쌍안경 현미경으로 슬라이드에 1x PBS의 100 마이크로리터를 놓고 브러시로 조각을 PBS로 옮기고 슬라이드에 평평하게 놓습니다. PBS에 대한 액세스를 제거합니다. 마지막으로, 유리 커버 슬립에 직접 장착 매체의 한 방울을 놓고 부드럽게 조각을 커버.
골린 면역스테인링은 9일에서 10C57 블랙 6마리의 중성마우스로부터 얻은 조직형 소뇌슬라이스에서 11일 간 관찰되었으며, 전압 문이 있는 나트륨 채널에 농축된 로나비의 노드를 통해 11일 간 관찰되었으며, 편집증적 악소글리아 접합 도메인에 의해 측면이 있다. PLP-GFP 형질전환 마우스에 대해 동일한 결과가 관찰되었다. 파켄기 세포의 양수는 대부분 문화에서 1 주일 후에 달성된다.
LPC 치료는 완전히 자발적으로 재myelinate 완전히 6 일 사후 탈근을 골라 진화 슬라이스를 demyelinates. 이 절차는 최대 25분이 소요됩니다. 그것은 정말 가장 중요한 포인트입니다.
Organotypic 슬라이스 배양은 myelination 역학의 라이브 이미징 연구에 적합합니다. 그것은 또한 약물 선별 실험을 대상으로 사용할 수 있습니다. 이 기술은 근생 및 재분화 프로세스를 연구하기 쉬운 정량적 접근 방식을 허용합니다.
실험자는 동물 복지, 과도하고 날카로운 신비에 적용되는 기본 안전 절차를 따라야합니다.
