이 절차의 전반적인 목표는 인간의 말초 혈액에서 내인성 LRRK2 키나아제 활성을 평가하는 방법을 제공하는 것입니다. 이것은 마이클 J.Fox 재단 인산 특정 Rab monoclonal 항체를 채택하는 Rab 단백질의 LRRK2 매개 인산화를 감시하여 달성됩니다. 여기서, 우리는 Rab2와 Rab10둘 다의 높은 발현 수준을 가진 균질한 사이트 인구의 구성으로 인간 말초 혈액 호중구에 집중합니다.
호중구 절연은 완료 된 작용의 40 분 이내에 99 %의 순수하고 실행 가능한 호중구의 격리를 허용하는 동시에 단백질 수준의 높은 양을 산출하는 부정적인 선택을 기반으로합니다. 혈액 수집 튜브에 혈액 10 밀리리터를 수집합니다. 튜브를 7~8번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
50 밀리리터 원내 튜브로 10밀리리터의 혈액을 전달합니다. EDTA 스톡 용액 1, 0.1 어금니 EDTA PBS 용액의 혈액 100 마이크로리터에 넣고 부드럽게 섞습니다. 500 마이크로리터 절연 칵테일, 호중구 격리 키트에서 밀리리터당 50 마이크로리터를 전체 혈액 샘플에 추가합니다.
매우 미세한 자기 구슬을 재중단하기 위해 사용하기 전에 30 초 동안 호중구 격리 키트에서 자기 구슬을 소용돌이. 혈액 샘플에 500 마이크로리터 마그네틱 구슬을 넣고 튜브를 여러 번 반전시켜 부드럽게 섞습니다. 실온에서 5분간 배양하세요.
EDTA 스톡 솔루션 2로 50 밀리리터까지 튜브를 위로 합니다. 이것은 하나의 밀리머 EDTA PBS 솔루션입니다. 2~3회 위아래로 매우 부드럽게 파이펫팅하여 섞는다.
튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 제거하여 튜브의 후속 동요를 방지합니다. 실온에서 10분 동안 배양하세요. 새로운 50 밀리리터 원판 튜브에 호중구를 포함하는 조심스럽게 파이펫 농축 셀 서스펜션.
자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 말고 튜브 의 바닥에 있는 적혈구의 수집 및 혼란을 피하십시오. 약 10 밀리리터의 적혈구 현탁액을 튜브 바닥에 남겨 둡니다. 사용 전 30초 동안 소용돌이 자기 구슬을 사용하고 농축 된 호중구를 포함하는 튜브에 0.5 밀리리터 자기 구슬을 추가합니다.
튜브를 반전시켜 부드럽게 섞습니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 제거하여 후속 교반을 피하십시오.
실온에서 5분간 배양하세요. 새로운 50 밀리리터 원판 튜브에 호중구를 포함하는 농축 된 세포 현탁액을 조심스럽게 피펫. 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 마십시오.
튜브 바닥에 서스펜션의 약 5 밀리리터를 둡니다. 세포 혼합물에서 자기 구슬을 완전히 제거하려면 농축 된 세포를 포함하는 튜브를 자석에 배치하십시오. 실온에서 10분 동안 배양하세요.
이제 순수 호중구를 새로운 50 밀리리터 원판 튜브로 포함하는 농축 된 세포 현탁액을 조심스럽게 피펫합니다. 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 마십시오. 튜브 바닥에 약 5 밀리리터의 서스펜션을 남깁니다.
1 밀리머 EDTA 스톡 용액 2를 약 41 밀리리터의 최종 부피로 절연 된 세포를 위로합니다. 파이펫을 위아래로 섞어 드시고 있습니다. 각 튜브에 약 20 밀리리터가 있는 두 개의 튜브에 솔루션을 균등하게 나눕니다.
원심분리기는 335G의 두 튜브를 5분 동안 사용할 수 있습니다. 원심분리 단계에서는 MLi-2 억제제 재고, 200 마이크로몰어 슬래시 1000X 농도를 영하 80도 냉동고에서 꺼내 서열사용을 위해 실온에서 둡니다. 원심분리 단계 직후와 튜브의 동요 없이 호중구 펠릿을 방해하지 않고 상피물을 부어 줍니다.
각 세포 펠릿을 실온에서 세포 배양 배지의 10 밀리리터에서 부드럽게 4번 위아래로 피펫팅하여 재보냅니다. 하나의 튜브 DMSO 와 다른 튜브 MLi-2 라벨. DMSO 라벨 튜브에 DMSO의 10 마이크로 리터를 추가하고 부드럽게 혼합 위아래로 파이펫하여 200 마이크로 몰러 MLi-2 주식 용액의 10 마이크로 리터를 추가합니다.
실온에서 30분 동안 시료를 배양합니다. 인큐베이션 기간 동안 10분마다 반전으로 부드럽게 섞습니다. 30분 동안 LRRK2 키나제 억제제 처리 시 마이너스 80도 냉동고에서 0.5 어금니 DIFP 스톡 용액을 제거하고 얼음 위에 연기 후드에 놓습니다.
그런 다음 밀리리터 마이크로사이클스틴-LR 스톡 용액당 1밀리그램을 영하 80도 냉동고에서 이동하고 실온에서 해동합니다. 냉동실에서 해동을 허용한 다음 후속 사용을 위해 얼음 위에 놓아 리시스 버퍼의 0.25 밀리리터인 알리쿼트(aliquot)를 해동합니다. DMSO의 마이크로리터 1개를 포함하는 RPMI 배지 1밀리리터를 이 DMSO 리서스펜션 버퍼라고 준비합니다.
200 마이크로몰라 MLi-2 또는 대체 LRRK2 키나아제 억제제의 1개의 마이크로리터를 포함하는 RPMI 배지의 1밀리리터를 준비하고 이 MLi-2 재서스펜션 버퍼를 호출합니다. 30분 잠복기 후, 원심분리기는 이전과 마찬가지로 335G에서 5분 동안 두 튜브를 모두 분리합니다. 호중구 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브의 상체를 조심스럽게 폐기하십시오.
DMSO 라벨 튜브의 경우 DMSO 재서스펜션 버퍼의 1밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 분리합니다. 그리고 MLi-2 표지 튜브의 경우, MLi-2 리서스펜션 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. DMSO 및 MLi-2 및 원심분리기 두 튜브가 335G에서 3분 동안 부착된 원심분리 튜브로 재중단된 세포 펠릿을 이송합니다.
원심 분리 단계에서 는 리시스 버퍼를 준비합니다. 연기 후드에서 0.25 마이크로리터0.5 어금다 DIFP 용액을 조심스럽게 추가하고 밀리리터 마이크로사이클스틴-LR당 1밀리그램의 0.25 마이크로리터를 0.25 밀리리터 용해 버퍼에 조심스럽게 추가합니다. 섞고 사용할 때까지 얼음위에 둡니다.
원심분리 직후, 호중구 펠릿을 방해하지 않고 파이펫으로 모든 상퍼를 주의 깊게 완전히 제거하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 즉시 각 튜브에 DIFP 및 미세 세포-LR을 포함하는 용해 버퍼 100 마이크로 리터를 추가합니다. 100~ 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 약 5~10회 위아래로 피펫을 배관하여 셀 펠릿을 재연합니다.
10 분 동안 얼음에 세포를 거짓말. 그런 다음 원심분리기 튜브는 섭씨 4도에서 15분 동안 20, 000배 G로 세포 이물질을 제거합니다. 호중구 용해를 포함하는 DMSO 및 MLi-2 상피물질을 새로운 원심분리 튜브로 옮긴다.
파편 펠릿을 폐기하십시오. 호중구 용액은 이제 사용할 준비가 되어 있거나 액체 질소로 얼어 붙고 향후 분석을 위해 영하 80도에 저장될 수 있습니다. 공개적으로 이용 가능한 가져오기 데이터베이스의 데이터를 사용하여, 이 그래프는 LRRK2와 Rab10 단백질의 풍부가 인간 말초 혈액 호중구 및 단핵구에서 특히 높다는 것을 보여줍니다.
이 절차로 인간 말초 혈액 호중구를 격리하면 세포의 불순한 수율이 높습니다. 상단에있는 테이블은 세 건강한 기증자에서 말초 혈액의 10 밀리리터에서 분리 된 세포의 총 수를 보여줍니다. 또한 단단 세포의 순도 및 생존력뿐만 아니라 총 단백질 용액 수율이 도시되어 있다.
LRRK2 키나아제 억제제, MLi-2의 유무에 관계없이 치료 후, 호중구는 강력한 프로테아제 억제제, DIFP의 존재에서 용해된다. 왼쪽에 있는 도면 B의 경우, 차선당 전세포 추출물 10마이크로그램이 표시된 항체를 사용하여 멀티플렉스 정량적 면역블롯 분석을 실시하였다. 오른쪽 의 그림, C는, 특히 큰 LRRK2 단백질의 단백질, 성분해 분해의 예방을 위한 DIFP의 중요성을 보여줍니다.
비교에서, PMSF 혼자 높은 농도는 덜 효과적입니다. 여기서 LRRK2-대조Rab10 인산화는 대조군과 비교했을 때 이종화척 VPS35 D620N 돌연변이를 품고 있는 유전 파킨슨병 환자로부터 유래된 말초 혈액 호중구에서 약 3배 증가되는 것으로 나타났다. 상기 위그래프는 멀티플렉스 면역블롯 분석과 그 아래, 정량화를 나타낸다.
이것은 VPS35 D620N 돌연변이가 아직 알려지지 않은 기계장치에 의하여 활동의 LRRK2 키나아제 경로를 활성화한다는 것을 건의합니다. 요약하자면, 우리는 인간 말초 유래 호중구에서 Rab10과 같은 Rab 단백질 인산화를 모니터링하여 LRRK2 키나아제 경로 활성을 측정하는 촉진및 견고한 분석법을 제시하며, 이 방법을 통해 LRRK2 경로 활성을 평가하고 돌연변이, 질병 상태 또는 억제제가 LRRK2 경로를 조절하는 방법을 결정할 수 있습니다.
