Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
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저자는 귀중한 업무 및 토론을 위해 Cobb 연구소의 모든 현재 및 전 회원들과 관리 지원을 담당 한 Dionne Ware에게 감사드립니다. 이러한 연구는 국립 보건원 R37 DK34128 및 웰치 재단 그랜트 I1243에 의해 MHC

1. 키나아제 정제 자원 및 일반 면역 침전 파이프 라인 참고 :이 분석과 함께 사용하기위한 키나제는 교양 세포의 immunoprecipitates 또는 친화력 태그 정제 6 와 같은 재조합 수단에 의해 공급 수 있습니다. 다음은 관심 키나아제에 따라 변형 될 수있는 flag-tagged immunoprecipitation에 대한 일반적인 프로토콜입니다. 가능한 모든 것은 얼음에 보관해야합니다. <ol><li> 락 할 동안 세포 용 해물 200 μL에 1 mg / mL 항체 2 μL (일반적으로 ~ 1 mg / mL 총 단백질 농도)를 첨가하고 4 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오. </li><li> 단백질 A 세파 로즈 비즈를 4 ℃에서 짧게 회전하여 5000 xg ( &quot;터치 스핀&quot;)에서 1 분간 1 분간 방치하여 용해 완충액 (아래 참조)으로 2 ~ 3 회 세척하고 피펫으로 상등액을 제거하고 완충액에 비즈를 resuspending . <ol><li> 용해 버퍼 준비 : 50 MM HEPES 산도 7.7, 150 MM NaCl, 1.5 MM MgCl 2, 1 mM EGTA, 10 % 글리세롤, 0.2 mM 나트륨 오르토 바나 데이트, 100 mM 플루오르 화 나트륨, 50 mM β- 글리세로 포스페이트, 0.1 % 트리톤 X 100 또는 0.1 % NP-40. </li></ol></li><li> lysates에 용해 버퍼에 단백질 A sepharose 구슬의 50 % 슬러리 30 μL를 추가합니다; 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하면서 흔들어 준다. </li><li> 4 ° C에서 스핀을 터치하여 비드를 펠렛 화하고 상층 액을 제거합니다. </li><li> 비드 세척 완충액 (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) 1 mL로 3 번 씻는다. </li><li> 1X 키나제 반응 완충액 (10mM HEPES pH 8.0, 10mM MgCl 2 )으로 1 회 씻는다. 구슬을 제거하지 않고 가능한 많은 버퍼를 제거하십시오. </li></ol> 2. 키니 아제 반응의 초기화 참고 : IP 키나제 검사의 경우, 일시 중지되지 않은 비드 ~ 15 μL가 일반적인 시작 시료입니다. 재조합 단백질 키나아제 분석의 경우, 일반적인 시작 량은 최종 반응 부피 25-50 μL에 대해 1-10에서 0.1-1.0 μg 범위입니다. 재조합 단백질 시료의 부피 조절s는 분석을 초기화하기 전에 저장되는 버퍼와 동일해야합니다. 대량의 키나아제를 사용하는 경우 분석 기간 동안 단백질 안정성을 유지하는 데 도움이되는 BSA와 같은 담체 단백질을 포함하십시오. <ol><li> 아래에 주어진 5x 키나아제 반응 버퍼를 준비하십시오 : 50 mM HEPES pH 8.0 50 mM MgCl2 50 mM 벤 자미 딘 (프로테아제 억제제) 50 mM DTT (환원제) 250 μM ATP (레이블이 지정되지 않았거나 &quot;저온&quot;) </li><li> 키나아제 샘플을 1.5 mL 튜브에 얼음에 보관하십시오. 별도의 냉각 된 1.5 mL 튜브에서 다음 반응 혼합물을 조제하십시오 : H 2 O 21 μL 6 μL 5x 키나아제 반응 완충액 1 μL 방사성 표지 ( &quot;핫&quot;) ATP 2 μL 기질 (~ 5 mg / mL) 참고 : 재조합 키나아제 분석의 경우, 정제 된 단백질을 수용하기 위해 부피를 조절할 수 있습니다. 최종 반응 부피가 30 μL가되도록 계산한다. 이 조리법을 사용하여 마스터 준비혼합. 표지 된 ATP를 받으면 반응 혼합물에 첨가하기 전에 0.01 Mci / μL의 비 활동으로 H2O의 원료를 희석한다. </li><li> 분석을 초기화하려면 전체 반응 혼합물을 키나제 샘플에 첨가하고 분석 할 키나아제 활성에 따라 30 분에서 1 분간 5 분간 반응을 일으킨다. 참고 : 이전에 활성을 측정하지 않은 키나아제로 작업 할 때는 시간 간격 사이에 5 분 간격으로 키나아제 활동의 시간 경과를 수행하십시오. </li></ol> 3. 반응 종결 및 SDS-PAGE <ol><li> 얼음에 넣고 7.5 μL 5x Laemmli 샘플 버퍼 6 을 추가하여 반응을 중지하십시오. </li><li> 가열 블록에서 100 ° C에서 30 초에서 2 분간 가열하십시오. </li><li> 10-15 % SDS-PAGE 젤에서 스핀을 터치하고 웰 당 20 μL을로드하십시오. 겔을 키나아제와 기질을 분리 할 수있을만큼 충분히 길게하십시오 (일반적으로 5W의 일정한 출력에서 ​​1 시간). 겔 장치를 보호하여 32 노출을 제한하십시오 </sup&gt; P. <ol><li> 여기에는 수제 젤 장치를 사용하지만 표준 상업적으로 판매되는 미니 젤은 완벽하게 적합합니다. 다음과 같이 치수를 사용하십시오. 젤 : 폭 8 cm, 길이 5.5 cm (해상), 1.5 mm 두께. 콤브 : 15 개의 우물, 1.5mm 두께, 2.9mm 폭, 16mm 깊이 </li></ol></li></ol> 4. 젤 염색 및 건조 주의 : 모든 단계에서 방사성 차폐를 사용하고 개인 보호 장비를 착용하여 개인 피폭을 32 P로 줄이십시오. 특정 단계에 대한 자세한 내용은 유용한 참고 자료가 포함되어 있습니다. <ol><li> 유리 / 알루미나 판에서 겔을 제거하고 50 rpm으로 설정 한 궤도 진탕 기에서 1 시간 동안 50 mL의 쿠마시 스테인 (10 % 빙초산, 50 % 메탄올, 0.25 % R-250 염료)에 넣습니다. 이 단계에서는 젤 자체보다 약간 큰 용기를 사용하십시오. 8 </li><li> 젤을 얼룩에서 고정 용액 (10 % 빙초산d, 20 % 메탄올)를 사용하여 탈색시켰다. 50 rpm의 궤도 진탕 기에서 밤새 고형 용액 600-700 mL로 겔을 잠급니다. 쿠마시 염료 8 , 9 를 흡수하기 위해 젤이 들어있는 용기에 거품 조각 또는 매듭 된 실험용 물티슈를 놓습니다. </li><li> 정착액에서 겔을 제거하고 젤이 유백색으로 변할 때까지 약하게 흔들어 주면서 1-2 분 동안 메탄올 200 mL에 담급니다. 이렇게하면 건조 단계에서 균열을 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 14 cm x 14 cm 크기의 정성 여과지를 메탄올로 적셔 슬라브 젤 진공 건조기 위에 놓습니다. 젤을 필터 종이 앞면이 위로 향하게 놓으십시오. </li><li> 주름과 기포를 방지하기 위해 조심스럽게 플라스틱 랩으로 젤을 덮으십시오. 건조기를 80 ° C에서 1.5 시간 동안 작동시킨다. 진공이 이루어지면 뚜껑을 열고 필요하면 부드러운 고무 판을 사용하여 공기 방울을 굴립니다. </li></ol> 5. Autoradiogram 및 섬광 계수 <ol><li> dri 제거인 겔을 부착하고 자동 끈 마커, 인광 성 눈금자 또는 도트를 겔의 측면에있는 여과지에 붙이십시오. 도트를 사용하는 경우 점들이 비대칭 패턴으로되어 있는지 확인하십시오. 이것은 노광 및 현상 후 겔을 필름과 정렬시킵니다. </li><li> Geiger 카운터를 사용하여 신호의 강도를 확인하십시오. 강화 된 화면에서 약 -70 ° C ~ -80 ° C의 약한 신호 노출의 경우 필름 밴드 밀도가 증가합니다. </li><li> 어두운 방에서 젤, 필름, 강화 스크린을 위에서 아래로 순서대로 필름과 강화 스크린이있는 필름 카세트에 말린 젤을 넣습니다. </li><li> 카세트의 뚜껑에 강화 스크린을 부착하고이 단계를보다 쉽게하기 위해 젤을 테이프로 붙이십시오. 강화 스크린은 32P에서 베타 입자에 의해 조사 될 때 빛을 방출합니다. 이러한 빛 방출은 베타 입자보다 더 효율적으로 필름을 관통합니다. <ol><li> 강화 화면에서 방출되는 파장이필름이 가장 민감한 파장의 연못. </li><li> 가이거 계수기를 사용하여 노출 시간을 결정하십시오 : cpm 수가 ~ 100 이하이면 -70 ° C에서 하룻밤 시험하십시오. 카운트가 ~ 10,000이면 1 시간 노출로 시작하여 거기에서 최적화하십시오. </li></ol></li><li> 노출이 끝나면 필름을 제거하고 의료 / X- 레이 필름 프로세서로 현상합니다. 노출을 -70 ~ -80 ° C에서 수행하는 경우 카세트를 실온으로 따뜻하게하여 응축이 발생하기 직전에 필름의 결로를 최소화하거나 필름을 제거하십시오. </li><li> 건조 된 젤 / 여과지 위에 필름을 놓고 마커 / 도트의 이미지를 마른 젤의 마커 / 점에 맞 춥니 다. 필름 표준에 해당하는 밴드를 표시하십시오. 단백질 기준에 라벨을 붙이고 나중에 참조 할 수 있도록 반응이 어떤 차선인지 표시하십시오. </li><li> 필름에서 관심있는 밴드에 해당하는 젤에서 밴드를 잘라내어 놓습니다.7 mL 신틸레이션 바이알에 넣었다. 신틸레이션 액 4 mL를 넣고 액체 섬광 계수기로 계산하십시오. 32P에 대한 올바른 에너지 스펙트럼 창을 모니터링하도록 카운터가 설정되어 있는지 확인하십시오. 참고 : 노 키네아제 대조 레인에서 기질에 해당하는 밴드도 반드시 제거해야합니다. 이 값은 모든 샘플 신틸레이션 카운트에서 뺄 배경 방사선을 계산하는 데 사용됩니다. </li></ol> 6. 결과 분석 참고 : 오토 라디오 그램은 결과를 질적으로 시각화합니다. 정확한 정량을 위해 32 P의 결합은 섬광 계수기로 측정 할 수 있습니다. 데이터는 일반적으로 그림 1B 와 같이 상대 활동으로 표시됩니다. 모든 샘플에 대해 균일 한 조건이 유지되는 한, 비 활동을 상대적으로 측정하면 치료를 비교할 수 있습니다. <ol><li> 절대 특정 활동 값을 계산할 때는 엄격함을 수행하십시오.시간 경과에 따른 선형 활성 범위 ( 예 : 2 x [kinase] = 2 x specific activity)를 보장하기 위해 키나제, 기질 및 콜드 ATP 농도를 포함한 모든 반응 조건의 최적화. 높은 비 활동성 키나아제의 경우 키나아제 활성이 기질의 양에 의해 제한되는 경우 증가 된 기질 농도로 분석을 수행하십시오. </li><li> kinase 1mg / min 당 인산염 나노 몰 단위의 특정 키나아제 활성을 계산하시오. <ol><li> 계산 된 대역의 cpm에서 공백을 뺍니다. </li><li> 뜨거운 ATP의 붕괴를 계산합니다 : [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 여기서 t 는 기준 날짜 이후의 일 수입니다 (공급 업체가 제공해야 함), t 1/2 는 32 P의 반감기는 14.3 일이며, 0.95는 섬광 계수기의 효율을 반영합니다. 예 : 28 일 된 고온 ATP를 사용하는 경우, 감소 값은 0.245 여야합니다. </li><li> Calc(일반적으로 이것은 반응에서 감기 ATP의 양과 동일하다) : 분석 용적 (μL) × [냉 ATP] (μM) = 전체 ATP (pmols). 예 : 30 μL x 50 μM = 1500 pmol </li><li> cpm / pmol ATP를 계산하시오 : [cold ATP x (2.2 x 107) x decay factor] / cold ATP의 pmol. 참고 : 2.2 x 10 7 값은 0.01 mCi / μL의 ATP를 cpm으로 변환합니다. </li><li> 분석에서 키나아제의 양을 mg 단위로 계산하십시오. 재조합 키나아제 및 면역 침전 된 키나아제 모두, BCA 분석법과 같은 표준 방법이 출발 농도를 결정하는 데 적합하다. 예 : 50μL 키나아제 반응에서 wtERK2 0.0002 μg / μL은 0.01 μg 또는 1 x 10-5 mg입니다. </li><li> 분석에서 총 cpm을 계산하십시오. 30 μL 반응을 조립하고 젤의 각 반응에서 20 μL를 실행하십시오. 계산 된 cpm (공백 빼기 후)에 총 분석 용적 / 적재량 계수를 곱하십시오. 위의 계속하기예를 들어 모든 계수에 1.5를 곱하거나 30/20을 곱합니다. </li><li> 분석 된 키나아제의 특정 활성을 계산하십시오 : 분석에서 총 cpm) / (cpm / pmol ATP) / (분석 시간 (분)) / (키나아제의 양) 참고 : 위의 값을 1,000으로 나눈 값은 나노 몰 / 분 / mg </li></ol></li><li> 기질에 얼마나 많은 인산이 포함되어 있는지 계산합니다 (분자량이 알려진 한). 이것은 일단 반응이 완료되면 특정 단백질의 포스 포 사이트 수를 결정하는 데 사용됩니다. 분석에서 총 cpm) / (cpm / pmol ATP)] / (pmole에서 기질의 양) </li></ol>

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	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

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키나아제는 다양한 환경에서 광범위한 기능을 발휘하는 다양한 단백질 군으로 키나아제 분석법은 여러 가지 신호 전달 단백질을 연구하는데 매우 유용하며 세포 통신에 대한 현재의 이해에 크게 기여했습니다. 특히, 구조 및 활성의 주요한 차이에도 불구하고 2 개의 상이한 키나아제를 특성화하는데 동일한 기본 분석이 사용되었다. WNK1 키나아제는 중요한 리신이 독특한 위치로 이동 한 비정형 ?...

단백질 키나아제는 세포 신호를 적절한 반응으로 전달하는 데 중요한 정교한 효소입니다 1 . 항상성 유지와 질병 상태의 예방 또는 증진에있어 역할을 감안할 때, 키나아제 활성을 평가하는 생화학 적 방법은 진핵 세포 신호 전달의 세부 사항을 묘사하기위한 강력한 도구가되고있다. 포스 포 - 특이 적 항체를 이용하는 전략이 세포 신호 상태 4 에 대한 상이한 처리 조건의 영향을 측정하는 관점에서 매우 유익 하였지만, 키나아제 분석은 상이한 처리 조건의 영향을 직접적으로 다른 키나아제의 효소 활성의 관점에서 측정 할 수있게한다 관심. 방사성 물질을 사용하지 않는 유사한 분석법에 대한 몇 가지 옵션이 있지만, 우리는 결과의 견고한 정량화를 위해이 방법을 계속 사용합니다. 그곳에면역 침전 된 (IP) 키나아제 분석 ( 그림 1 )과 재조합 단백질 키나아제 ( 그림 2 )의 두 가지 일반적인 용도로 사용됩니다. IP 키니 아제 분석은 특정 단백질 키나아제를 활성화 할 수있는 요인을 확인하고 측정 억제 조건을 측정하는 데 매우 유용합니다. 간단히 말하면, 관심있는 에피토프 - 표지 된 키나아제를 배양 된 진핵 세포에 형질 감염시키고, 다양한 처리를 실시하고, 면역 침강시키고, 방사성 표지 된 인산염을 모델 기질 ( 예를 들어, 미엘린 염기성 단백질 (MBP))에 혼입시키는 능력에 대해 분석한다. IP 키나아제 분석은 또한 내인성 단백질의 면역 침전 또는 임의의 수의 게놈 편집 기술에 의한 과발현에 의하지 않고 수행 될 수있다. 처리가 배양 물에서 수행되기 때문에,이 방법은 다수의 상류 인자를 통해 전달 된 자극을 검출 할 수있다또는 평행 경로 에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 한 가지 주요 이점은 직접 상류 ​​또는 하류의 인자 또는 인산화 부위에 대한 사전 지식이 필요 없다는 것이다. 또한 관심 키나아제에 대한 특정 기질이 확인되면 동일한 키나아제 분석 프로토콜을 재조합 성분과 함께 사용하여 천연 기질에 대한 특정 활성을 측정하고 질량 분석기와 결합 할 때 특정 인산화 부위를 식별 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 동정 된 부위는 기질 돌연변이 체를 이용하는 키나아제 검정으로 더 검증 될 수있다. 마지막으로,이 방법은 또한자가 인산화를 검출하고 측정하는데 사용될 수있다. 여기서 제공된 프로토콜은 배양 된 세포에서 관심있는 친 화성 태그 키나아제를 발현하기위한 최적화 된 단백질 정제 방법 또는 형질 감염 방법을 가정한다. 형질 감염, 용해, 면역 침전 및 단백질 정제에 대한보다 자세한 설명은ocols, 우리는 콜드 스프링 하버 프로토콜 6 을 추천하는 것이 좋습니다. 분석법 개발 및 변형에 관한 더 자세한 정보는 단백질 인산화 : 효소학의 선정 된 방법 7 을 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled [&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 dye (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Slab gel vacuum dryer</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Gel Dryer #1651745&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad marker</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent ruler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorescent dots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 with 44-9 detector</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Intensifying Screen 8&quot; x 10&quot;</td><td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Medical/X-ray film processor</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vials</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation fluid</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

단백질 키나아제는 복잡한 자극 배열에 반응하여 대규모 세포 변화를 조절할 수 있으며, 조절에 대한 알로 스테 릭 세부 사항을 밝히기 위해 많은 노력이 기울여왔다. 키나아제는 결함이 종종 여러 형태의 암 및 관련 질병의 특징 인 신호 전달 네트워크를 포함하여 상향 조절 인자의 조작 및 개선 된 치료법을 찾는 데 필수적인 반응 요구 사항의 확인에 적합한 분석 플랫폼을 만든다. 여기서 우리는 생화학 및 약리학 적 약제의 영향, 돌연변이 및 결실과 같은 유전 조작, 세포 배양 조건 및 프로브에 대한 처리를 시험하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 실험 문제에 쉽게 적응할 수있는 기본적인 키나아제 분석을 기술한다 세포 신호 메커니즘. 이 분석법은 방사성 표지 된 [γ- 32 P] ATP를 사용하여 정량적 비교와 결과의 명확한 가시화가 가능하며 mod광범위한 반응 조건에 걸쳐 면역 침전 또는 재조합 키나아제, 특이 적 또는 전형적 기질과 함께 사용하기에 적합하다.

WNK1 IP 키나제 검정 Myc- 표지 된 WNK1을 HEK293 세포로 형질 감염시키고 항 -IcC 항체 11로 면역 침전시켰다. 면역 침전물은 모델 기질 MBP뿐만 아니라 그 자체로 키나아제 활성을 나타내었다 ( 도 1A ). WNK1 돌연변이 체는 MBP에 대한 키나아제 활성을 동일한 방법으로 시험하였고, 이번에는 GST- 태깅 된 구조?...

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

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18.3K 조회수.  University of Texas Southwestern Medical Center.  단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 

비디오: Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

연구

생화학

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

생물학

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...