안녕하세요, 저는 빈 렌입니다, 나는 알라바마 대학 버밍엄 의과 대학에서 수술 및 생물 의학 공학의 부교수입니다. 우리의 실험실은 이러한 일반적인 심장 혈관 질환과 암의 맥락에서 내피 세포 생물학 기능 혈관 신생 아큐오발생에 관심이 있습니다. 우리의 연구 중 하나는 내피 세포 전분 및 혈관 신생의 후성 유전학 및 전사 조절에 있습니다.
혈관 신생의 전사 메커니즘을 이해하기 위해, 우리는 자궁 내피 세포에서 혈관 신생과 관련된 특정 유전자를 삭제했을뿐만 아니라 향상된 GFP 프로브가 토착 내피 세포의 리보솜에 유전적으로 태그될 트랜스젠트 엔지니어링 마우스 라인을 확립했습니다. 이러한 방식으로, 우리는 형질전환 동물에서 직접 다른 조직 기관에서 내피 세포에서 관련 메신저 RNA의 루프를 분리하고 정화 할 수 있습니다. 그런 다음 정제 된 메신저 RNA를 사용하여 성적 증명서 및 전사의 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다.
RNA 시퀀싱 및 실시간 냉각 PCR에 의해. 이 비디오에서, 내 학생 패트릭 모란과 조던 파머와 연구 기술자 니콜라스 바네코프와 롱 위안당신에게 트랜스 제닉 동물의 내피에서 직접 지각 형생 마우스와 멸망 메신저 RNA를 유전자화 하는 방법을 보여줍니다. Genotyping은 얼음이 내피 세포의 리보솜에 GFP 태그를 가지고 있는지 확인하기 위해이 프로토콜에서 중요한 예비입니다.
모든 다운스트림 RNAi 절연 단계는 GFP 태그 리보솜의 존재에 의존하기 때문에 실험을 시작하기 전에 유전자형을 결정하는 것이 필수적입니다. RNA 격리를 시작하기 전에 몇 가지 준비 단계를 완료해야 합니다. 이들은 단백질 G dina 구슬에 항 GFP 항체를 완충 제제 및 결합을 포함한다.
완충제는 섭씨 4도에서 최대 1개월까지 지속될 수 있으며 항체 바인딩구슬은 섭씨 4도에서 최대 1주일까지 지속될 수 있습니다. 따라서 실험을 계획할 때 이러한 제한 사항을 고려하십시오. 어금니 구동 균질화제를 사용하는 것은 RNA 수율을 높이는 훌륭한 방법입니다.
RNA 분해를 줄이기 위해 낮은 주파수 설정 및 지속 시간을 사용해야 합니다. 앞서 언급했듯이, genotyping은 임상 시험 프로토콜에서 중요한 예비 단계입니다. TRAP 기술을 사용하여 RNA를 분리하는 마우스가 TRAP 유전자에 대해 양성이지만, 적어도 TRAP 유전자에 대한 이상적으로 동질화구는 GFP 태그가 리보솜에 있는지 확인하는 것이 항원 항체 반응 및 항 GFP 비드를 사용하여 아래로 당겨야 하기 때문에 중요한 단계입니다.
마우스에서 원하는 조직을 분리하고 밀리리터 사이클로헥사미드 용액당 100 마이크로그램으로 얼음 차가운 PBS에 즉시 넣습니다. 이렇게 하면 번역이 중지되고 전사체가 안락사 이전에 마우스를 정확하게 묘사할 수 있습니다. 모터 구동 균질화제를 사용하여 조직을 세포 현탁액으로 균질화하십시오.
이상적인 타이밍 과 주파수 설정은 당신이 사용할 것입니다 특정 모터 구동 균질화제에 따라 개별 실험실에 의해 결정되어야한다. 주파수 설정이 너무 높게 사용하면 RNA 가 분해되고 나머지 프로토콜이 중단될 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 준비해야 하는 리시스 버퍼 내에서 셀 펠릿을 일시 중단합니다.
프로토콜의 나머지 부분을 진행하기 전에 적절한 균질화를 보장하기 위해이 혼합물을 더 균질화해야합니다. 원심 분리는 섭씨 4도 원심분리기에서 2, 000배 G에서 10분 동안 동형포를 발사합니다. 이것은 다운스트림 면역 침전 반응을 방해할 수 있는 핵 및 큰 세포 파편을 펠렛할 것입니다.
이전 원심화 단계에서 상퍼에 DHPC 및 CA-630 지질을 추가합니다. 이 지질은 그밖 세포내 분대에서 단백질 위상을 분리하는 것을 도울 것입니다. 서스펜션을 얼음 위에 5분간 놓고 앉습니다.
13, 000배 G에서 10분 동안 용해성 물질을 원심분리합니다. 향후 단계를 위해 명확한 lysate의 15%를 보관하십시오. 세포용액에 항-GFP 항체 바운드 구슬을 추가하고 30분 동안 엔드 오버 엔드 회전으로 4°C에서 혼합물을 배양한다.
이것은 항 GFP 항체가 GFP 태그리보솜을 결합하여 이러한 리보솜으로부터 RNA를 더 격리할 수 있는 곳입니다. 마그네틱 랙에 구슬을 모으고 격리를 시작하기 전에 준비한 높은 소금 폴리섬 워시 버퍼를 사용하여 구슬을 5회 세척합니다. 즉시 RLT 버퍼에 구슬을 배치하는 다음 단계로 진행합니다.
최대 속도로 3 분 동안 lysate원심을 원심 분리하고 상체를 조심스럽게 제거하고 새로운 미세 분리 튜브로 옮킵니다. 클리어된 용액에 70%에탄올 1부부로 넣고 파이펫팅으로 즉시 섞습니다. 형성되었을 수 있는 침전수를 포함하여 시료의 최대 700마이크로리터를 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 즉시 전송하는 다음 단계로 진행합니다.
스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8, 000배 G보다 15초 동안 리세스를 원심분리합니다. 흐름을 버리고 다음 단계로 진행합니다. 스핀 컬럼에 버퍼 RW1 350 마이크로리터를 추가합니다.
원심분리기는 8, 000배 G이상으로 15초 동안 스핀 컬럼 멤브레인을 세척하고 흐름을 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 버퍼 RW1의 또 다른 350 마이크로리터를 사용하여 이 단계를 반복합니다. 스핀 컬럼에 500마이크로리터의 버퍼 RPE를 추가합니다.
스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8, 000 배 G보다 15 초 동안 원심 분리기. 흐름을 버리고 스핀 컬럼에 버퍼 RPE의 500 마이크로리터를 추가하여 이 단계를 반복합니다. 이번에는 스핀 컬럼 멤브레인을 세척하기 위해 8.000 배 G보다 큰 2 분 동안 원심 분리기를 합니다.
흐름을 버리고 스핀 컬럼을 새로운 2 밀리리터 수집 튜브에 놓고 1분 동안 최대 속도로 원심분리기로 진행하여 스핀 컬럼에 존재할 수 있는 잔류 버퍼를 제거합니다. 흐름을 버리고 스핀 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브에 배치합니다. 스핀 컬럼 멤브레인에 직접 RNase 프리 워터30~50마이크로리터를 추가합니다.
스핀 컬럼 멤브레인에서 RNA를 엘로우기 위해 8, 000배 G보다 1분 동안 원심분리기. 이 시점에서 RNA는 RNase 무료 물에 용해되며 최대 1 년 동안 영하 80도에서 보관 할 수 있습니다. 분광광계를 사용하여 격리한 RNA의 순도를 정량화하고 확인하십시오.
RNA를 포함한 핵산인 260 나노미터에서 최대 흡수를 찾고 있습니다. 양은 마이크로리터 당 나노그램으로 이미지의 오른쪽 아래 부분에 묘사된다. 품질은 260 230 비율로 추론될 수 있으며, 이는 화면의 오른쪽 아래 부분의 수량 보다 높은 한 항목을 나타내고 있다.
우리의 접근은 우리가 심장 조직에서 또는 이전에 동결된 조직에서 mRNA를 정제할 때 특히 낮은 RNA 수율을 보여주었습니다. 따라서 우리는 수율을 높이기 위해 조건을 최적화해야합니다. 그러나, 우리는 EC 특이CD-36 결핍 마우스에서 관찰했었으며, 에프린 B2 와 DLL4의 수준은 대조군과 비교했을 때 폐와 심내도 모두에서 현저히 증가하였다.
이러한 결과는 RNA 품질이 다운스트림 분석을 위해 충분하다는 것을 건의하는 우리의 이전 체외 연구 결과와 일치했습니다. 작업 영역의 엄격한 조건으로 인해 수율이 낮았습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해서는 RNase 무료 작업 영역을 설정하고 RNase로 오염되고 장갑을 자주 교체하여 품질 RNA를 추출하고 수율을 높일 수 있는 작업 표면 및 장비를 오염 제거하는 것이 중요합니다.
또한 친화성 매트릭스에서 GFP 항체의 적절한 농도를 찾고 조직 용해 완충제에서 RNase 억제제의 적절한 농도를 사용하고 표적 조직의 내피성 리보솜에서 RNA 추출을 위한 RNase 무료 플라스틱 도자기 및 시약을 사용하는 것이 중요합니다.
