이 연구는 한국 정부가 후원하는 한국 연구 재단 (National Research Foundation for Korea) (No. 2015R1A2A1A10052663 및 No. 2014M1A3A3A02034698)의 지원을 받았다.

1. 안전 주의 :이 프로토콜은 [γ- 32 P] -ATP를 사용하여 AMPK의 활성을 평가합니다. Phosphorus-32는 방사성 동위 원소로 주로 베타 방사선을 방출합니다. 베타 입자의 크기가 매우 작기 때문에 쉽게 의류와 피부에 침투 할 수 있습니다. 베타 방사선에 대한 외부 및 내부 노출은 피부 화상과 조직 손상을 유발하는 것을 포함하여 인체 건강에 해로울 수 있습니다. <ol><li> 아크릴 차폐와 같은 적절한 보호 장치를 사용하여 [γ- 32 P] -ATP를 사용해야하는 모든 단계를 수행하십시오. </li><li> 모든 작업자가 모든 절차에서 유해한 방사선에 노출되는 정도를 모니터링하기 위해 전자 개인 선량계 (EPD)를 갖추고 있는지 확인하십시오. </li><li> 적절한 교육 및 규제 승인을받은 후에 만 ​​오픈 소스 방사선을 다루십시오. 참고 : 여기에서 모든 실험은 서울 대학교에서 오픈 소스 방사선 사용 교육을 마친 후에 수행되었습니다.한국 정부의 승인 및 승인 (nssc.go.kr/nssc/en). </li><li> 지역 규정에 따라 방사성 폐기물을 폐기하십시오. 참고 : 여기서는 서울 대학교 환경 안전 안전 연구소의 지침을 따랐습니다. 다음은 미국 및 유럽 국가의 규제 기관 목록입니다 : 미국, 미국 원자력 규제위원회 (http://www.nrc.gov/); 영국, 건강 및 안전 집행부 (HSE) (http://www.hse.gov.uk); 프랑스, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); 독일, 연방 환경부, 자연 보전, 건물 및 핵 안전국 (BMU) (http://www.bmu.de). </li></ol> 2. 생체 외 경쟁적 키니 아제 분석법 <ol><li> 경쟁 펩타이드의 구축 <ol><li> AMPK에 의해 인산화 된 컨센서스 모티프를 결정합니다. 참고 : AMPK는 컨센서스 모티프,- [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ이다. 컨센서스 순서에서 Φ는 소수성 아미노산 (valine [V], leucine [L], methionine [M], isoleucine [I])을 나타내며 β는 염기성 아미노산 ( 즉 라이신 [K], 아르기닌 [ R] 및 히스티딘 [H]) 1 . </li><li> 상기 컨센서스 모티프에 따라 표적 서열로부터 세린 또는 트레오닌 잔기를 선택한다. 인간 Nrf2 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330-339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553-562)의 3 개의 추정 사이트를 사용한다. </li><li> 추정 사이트를 모방 한 10 잔기의 펩타이드를 상업적으로 합성합니다. 합성 된 생성물을 각 펩티드에 대해 98 % 이상의 순도를 갖는 동결 건조 된 분말로서 수득한다. </li><li> 키나제 완충액을 사용하여 펩타이드를 용해시켜 71.667 g / L의 농도를 얻습니다. 펩타이드가 키나아제 완충액에 용해되지 않으면 20 % DMSO에 용해시킵니다. 그것이 불용성으로 남아 있다면, 펩티드를 모방 한 펩티드활성 부위가 용해도를 증가시키기 위해 확장 될 수있다. </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> 생체 외 경쟁 AMPK 키나아제 분석법 <ol><li> 다음과 같이 5 × 키나아제 버퍼를 준비 : 100 MM HEPES, 산도 7.4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β- 글리세로 포스페이트 (세린 / 트레오닌 포스파타제 억제제); 5 mM Na3 VO4 (티로신 포스 파타 아제 억제제); 0.5 % (v / v) 프로테아제 저해제 칵테일 세트 III, 1 mM 차가운 ATP; 및 500 μM AMP. 참고 : AMP는 AMPK 활동을 시험하기 위해 키나제 완충제의 필수 구성 요소입니다. 상기 완충액은 세린 / 트레오닌 키나아제 및 티로신 키나아제의 활성을 측정하는데 사용될 수있다. </li><li> 얼음에서 다음의 재조합 단백질과 합성 펩타이드를 녹입니다 : AMPK; Nrf2; 올리고 펩타이드 # 1, # 2 및 # 3을 포함한다. </li><li> 얼음에 반응 완충액을 준비하십시오 : AMPK 0.15 μg, Nrf2 (~ 4 pmol) 0.4 μg, 올리고 펩티드 (~ 300 nmol) 0.43 mg, 5 x 키나아제 완충액 6 μL. 에이멸균 증류수 (DW)로 최종 부피를 30 μL로 맞 춥니 다. 참고 : 반응 완충액을 준비한 후 [γ- 32 P] -ATP를 첨가하면 키나제자가 인산화로 인한 방사성 신호가 감소 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 반응물 실행하기 참고 : 아래의 모든 공정은 아크릴 보호막, 랙 또는 블록뿐만 아니라 적절한 개인 보호 장비로 보호해야합니다. <ol><li> 실험을 시작하기 전에 가열 블록을 30 ° C로 설정하십시오. </li><li> 얼음 상에 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다. 참고 : 32 P의 방사능은 약 14 일의 짧은 반감기를 갖는다. 반감기를 고려하여 부피를 조절하십시오 ( 예 : [γ- 32 P] -ATP의 생산으로부터 한 달 후 [γ- 32 P] -ATP 4 μL 첨가)-ATP로 1 μCi). </li><li> 샘플을 가열 블록에서 30 ° C로 15-30 분 동안 품어 낸다. 이 단계에서 7.5 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 겔을 준비하십시오. 표적 단백질의 크기에 따라 겔의 비율을 조정하십시오. </li><li> 10 % SDS 샘플 버퍼 (10 % (V / V) 글리세롤, 20 % (W / V) SDS, 15.42 % (W / V) 디티 오 트레이 톨, 90 % (V / V) 0.5 M 트리스 -HCl (pH 6.8), 및 0.02 % (w / v) 브로 모 페놀 블루). 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다. </li><li> 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간, 140V에서 1 시간 동안 연속적으로 시험한다. 참고 : 겔의 끝에있는 브로 모 페놀 블루 라인은 매우 높은 방사성 신호를 포함합니다. 배경 신호를 줄이기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 파란색 선 아래 젤을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> SDS-PAGE 후 캐스터에서 젤을 부드럽게 제거하십시오. 젤을 유리에 넣으십시오.다음 단계를 위해 ube. </li><li> 고정 버퍼와 20 분 (50 % 메탄올과 10 % 빙하 아세트산)에 대한 젤을 고정. </li><li> 부드럽게 젤을 여과지 위로 옮기고 투명한 포장지로 덮으십시오. 이 단계에서 젤이 쉽게 찢어 질 수 있습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다. </li></ol></li><li> 심상 <ol><li> 형광체 화면이나 X- 선 필름에 밤새 젤을 노출 시키십시오 (대개 약 16 시간 동안). 참고 : 형광체 화면은 매우 밝은 빛에 노출 된 후 다시 사용할 수 있습니다. X- 레이 필름을 사용하는 경우 젤을 2 일 동안 노출 시키십시오. X 선 필름은 형광체 스크린보다 낮은 감도를 가지고 있습니다. </li><li> 형광체 이미 저로 형광체 화면을 스캔하십시오. 이미지를 고해상도 TIFF 또는 비트 맵 파일로 내 보냅니다. </li><li> 시각화 후 젤을 유리 또는 플라스틱 용기에 옮겨 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) 염색을하십시오. </li><li> DW로 젤을 씻으십시오. DW를 버리고 th를 그어라.e 겔을 염색 시약과 1 시간 동안 섞는다. </li><li> 시약을 버리고 DW로 1 시간 또는 밤새 겔을 처치하십시오. 사무실 스캐너로 스캔하려면 투명 플라스틱 필름 (또는 동등한 것) 사이에 젤을 놓습니다. </li></ol></li></ol> 3. 사이트 특정 돌연변이를 사용 하여 체외 키나아제 분석 <ol><li> pGEX-Nrf2의 부위 유도 돌연변이 유발 <ol><li> 돌연변이 유발 프라이머 디자인 참고 : 적절한 돌연변이 유발 프라이머를 설계하는 것은 돌연변이 유발의 성공적인 결과에 중요합니다. 다음은 돌연변이 유발 프라이머를 설계하기위한 몇 가지 고려 사항입니다. 프라이머 중간에 원하는 돌연변이와 25 ~ 45 염기로 구성된 프라이머를 만듭니다. 프라이머는 40-60 % GC 함량을 가져야하며 하나 이상의 G 또는 C 염기로 종결되어야합니다. 프라이머의 Tm이 [Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / 염기 길이) - % 불일치]에 따라 78 ° C 이상인지 확인하십시오. 참고 :프라이머는 그 순도가 돌연변이 효율에 중요하기 때문이다. 돌연변이 유발 프라이머를 디자인하기위한 몇 가지 웹 사이트가 있습니다. <ol><li> &quot;사이트 지정 돌연변이 유발을위한 프라이머 디자인&quot;(http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)을위한 프라이머 디자인 프로그램을 엽니 다. </li><li> 인간 Nrf2 DNA 서열 (Access No. NM_006164.4)을 붙이고 &quot;번역 된 번역 업로드&quot;버튼을 선택하십시오. </li><li> 알라닌으로 변환 될 번역 된 아미노산 서열로부터의 세린 558 잔기를 선택한다. 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 알라닌에 대해 agc에서 gcc까지의 세린을 코돈으로 대체하십시오. </li><li> 프라이머 길이, Tm 및 GC 함량을 고려하십시오. 참고 : 돌연변이 유발 프라이머는 최종적으로 5&#39;-ctactgaaaaaacaactc gccaccttatatctcgaag-3 &#39;로 설계됩니다. </li></ol></li><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용한 돌 연변이 합성 반응 <ol><li> 얼음에 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오 : 10X 반응 완충액, 50ngpGEX-GST-Nrf2, 정방향 프라이머 125 ng, 리버스 프라이머 125 ng, dNTP 믹스 (각각 10 mM) 1 μL, Pfu DNA 폴리머 라 아제 2.5 U 및 멸균 DW를 50 μL로 첨가 하였다. </li><li> 다음 순환 프로그램으로 pGEX-GST-Nrf2 돌연변이 가닥 합성을위한 PCR을 실행하십시오 : 95 ℃에서 30 초 동안 1 사이클; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 1 분, 및 68 ℃에서 90 초의 18 사이클; 68 ℃에서 5 분 동안 1 사이클. 참고 : 플라스미드 길이에 따라 순환 매개 변수가 변경 될 수 있습니다. </li><li> 다음 단계를 위해 반응물을 식히기 위해 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다. 또는 4 ° C에서 밤새 보관하십시오. </li></ol></li><li> Dpn I 소화 및 변이 형 플라스미드의 선택 <ol><li> Dpn I 제한 효소 (10 U / μL) 1 μL를 냉각 후 반응물 각각에 첨가한다. 피펫 팅하고 1 분간 원심 분리하여 철저히 섞는다. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하여 부모를 소화시킨다 pGEX-GST-Nrf2 double-가닥 DNA. </li><li> DH5 α supercompetent 세포를 얼음 위에서 부드럽게 녹입니다. </li><li> 미리 냉각 DH5 α supercompetent 세포 150 μL에 반응물 50 μL를 추가하고 적어도 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 42 ° C로 예열 된 가열 블록에 튜브를 옮기고 90 초 동안 그대로 두십시오. 그들을 얼음에 2 분 동안 놓습니다. </li><li> 형질 전환 된 DH5α 세포에 예열 된 용 영돈 배양액 (LB)을 첨가하고 180 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> LB - 암피실린 한천 플레이트에 변형 세포를 퍼 뜨리고 37 ° C에서 밤새 품어. 참고 : 플라스미드 GEX-GST-Nrf2는 암피실린 내성 마커를 가지고 있기 때문에 암피실린은 선택에 사용됩니다. mutagenized 플라스미드의 저항 마커에 따라 적절한 항생제를 사용하십시오. </li><li> 접시에서 단일 식민지를 선택, 5 ML의 LB - 암피실린에 전송하고, 180 rpm으로 떨고와 함께 37에서 하룻밤 그것을 품어.돌연변이 유발 서열의 확인을 위해 적어도 세 개의 콜로니를 평가하십시오. </li><li> DNA 서열 분석을 위해 DNA miniprep kit를 사용하여 DNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 제조자의 프로토콜에 따라 자동 DNA 서열 분석기를 사용하여 돌연변이 유발 DNA 서열을 확인한다. 돌연변이 체 시퀀스의 확인을 위해 최소한 200 ng의 DNA 구조체를 사용하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제 <ol><li> 대장균에서 돌연변이 유발 GST-Nrf2 융합 단백질의 발현 <ol><li> mutagenic pGEX-GST-Nrf2 플라스미드를 BL21 세포로 형질 전환시킨다. 암피실린 (100 μg / ML)가 들어있는 LB 배지 25 mL에 단일 식민지를 접종하고 밤새 37 ℃에서 배양하십시오. </li><li> 배양 된 세포를 1 : 100 희석 비율로 암피실린 (100 μg / mL)을 함유 한 LB 브로 쓰 100 mL에 접종한다. </li><li> 37 ℃에서 배양하십시오.또는 600 nm에서 흡광도가 0.4-0.8 (약 4 시간)에 도달 할 때까지. </li><li> 1 MM IPTG의 최종 농도를 준비하기 위해 100 ML의 배양 세포에 1 M IPTG 100 μL를 추가합니다. </li><li> 단백질을 발현시키기 위해 6 시간 동안 또는 밤새 로테 리터에서 30 ° C로 세포를 인큐하십시오. </li><li> 20 분 동안 5,000 xg에서 세포를 원심 분리하고 세균 용해 버퍼 (25 MM HEPES, 5 MM EDTA, 2 MM DTT, 0.1 % CHAPS, 1 μg / ML pepstatin, 0.5 μg / ML leupeptin의 1 ML로 세포 알약을 resuspend, 및 1 mM PMSF)를 첨가 하였다. </li><li> 최대 전력 출력의 50 %에서 2 분 간격으로 초음파 호 모지 나이저를 사용하여 세포 펠릿을 녹입니다. </li><li> 4 분 15 분 12,000 × g에서 세포를 원심 분리기와 뜨는를 수집합니다. </li></ol></li><li> 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제 <ol><li> 50 % (V / V) 글루타티온 - 아가로 오스 비즈 200 μL를 준비하고 1 ML PBS (산도 7.3; 140 MM NaCl, 2.7 MM KCl, 10 MM Na 2 </sub&gt; HPO 4 및 1.8 mM KH 2 PO 4 ). 500 × g에서 1 분간 원심 분리하여 비드를 수집합니다. 세 번 씻으십시오. </li><li> 50 % (브이 / 브이) 글루타티온 - 아가로 오스 구슬의 준비 200 μL에 세포 lysate를 추가하고 4에서 품어 ° C 2 H를위한 끝 오버 회전 장치. </li><li> 500 xg에서 1 분간 원심 분리하여 GST-Nrf2 단백질과 결합 된 glutathione-agarose beads를 수집합니다. 31G 바늘과 1 ML 주사기를 사용하여 뜨는을 제거합니다. </li><li> 1 단계에서와 같이 구슬을 PBS (산도 7.3) 1 ML로 씻으십시오. </li><li> GST - Nrf2와 결합 glutathione - 아가로 오스 구슬에 용리 버퍼 (50 MM 트리스 - HCl 및 10 MM 감소 글루타티온, 산도 8.0) 500 μL를 추가합니다. 30 분 동안 끝 오버 로테이터에서 4 ° C로 품어 낸다. </li><li> 1 분 500 XG에서 원심 분리기 및 뜨는를 수집합니다. </li><li> 다시 구슬에 용리 버퍼 300 μL를 추가하고 3.2.2.5-3.2.2.6 단계를 두 번 반복하십시오. </li></ol></li><li> 정제 된 GST-Nrf2 단백질의 확인 <ol><li> 표준 단백질 BSA 0.5 μg로 단백질 양의 시각화를 위해 시료 5 μL를 준비하십시오. </li><li> 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간,이어서 140V에서 60 분간 실시한다. </li><li> 겔을 2 시간 동안 0.1 % CBB 염색 용액 (CBB R250 0.1g, 99 % 메탄올 40mL, 빙초산 10mL 및 증류수 50mL)로 염색하고 탈염시킨다 (메탄올 30mL, 10 mL의 빙초산, 60 mL의 증류수)로 뚜껑을 덮는다. </li><li> destained 젤을 필터 용지에 놓고 투명한 래퍼로 덮습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다. </li><li> 시험 관내 AMPK 키나아제 분석을 위해 농도계로 돌연변이 GST-Nrf2 단백질의 양을 결정하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 사이트 특이 돌연변이 체를 이용한 In Vitro AMPK Activity Assay 아니E : 시험 관내 AMPK 키나아제 분석은 정제 된 야생형 GST-Nrf2 또는 펩타이드 억제제가없는 GST-Nrf2-S558A 돌연변이 체 0.4 μg을 사용하여 단계 2.2 내지 2.4에 따라 수행 하였다. 1 단계에서 설명한 모든 방사선 안전 지침을 따르십시오. <ol><li> 0.15 μg의 AMPK, 0.4 μg의 돌연변이 체 또는 야생형 GST-Nrf2 및 5 개의 키나아제 완충액 6 μL로 얼음 상에 반응 완충액을 준비한다. 멸균 DW로 최대 30 μL를 채 웁니다. </li><li> 얼음 위에서 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 혼합하고 원심 분리기. </li><li> 30 분 30 ° C 가열 블록에서 샘플을 품어. </li><li> 10 × SDS 샘플 버퍼 3 μL를 추가하여 키나아제 반응을 중지하십시오. </li><li> 70 % V에서 20 분 동안 7.5 % SDS-PAGE 젤에서 실행하고 1 시간 동안 140V에서 실행하십시오. </li><li> 고정 버퍼와 겔을 20 분간 고정하고, 여과지 위로 옮기고, 투명 젤로 덮는다.ent 포장지. </li><li> 진공 젤 건조기로 80 ° C에서 1 시간 동안 젤을 건조시킨 다음 형광 막 또는 X 선 필름에 밤새 노출시킵니다. </li><li> 형광 물질 이미 저로 형광체 화면을 스캔하고 2.4 단계에 따라 시각화 후 CBB 염색을위한 유리 튜브로 젤을 이동합니다. </li></ol></li></ol>

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AMPK에 의해 매개되는 예측 된 인산화 부위의 신뢰성을 평가할 수있는 간단하고 편리한 방법으로 경쟁 펩타이드를 사용하여 특정 인산화 부위를 발견하고 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여이를 검증 할 수있는 in vitro 키나아제 분석 에 대해 설명합니다 . 시험관 내 경쟁 AMPK 활성 분석 에서 얻은 대표적인 데이터는 펩타이드 경쟁 분석이 인산화 부위를 결정하는 유용...

특정 잔기에서의 단백질 인산화는 광범위한 세포 과정에서 중요한 역할을합니다. 따라서, 신호 전달 네트워크의 이해는 특정 인산화 부위의 확인을 필요로한다. 또한, 인산화 부위는 단백질 내의 개별 도메인이 상이한 구조 및 기능을 보유하기 때문에 단백질 기능에 대한 효과를 결정한다. 주요 항산화 인자 인 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2)의 활성은 다른 부위의 인산화를 통해 양방향으로 조절된다. 우리의 연구는 Nrf2의 인산화를 촉매하는 키나아제에 초점을 맞추었다. 산화 적 공격에 대한 Nrf2의 스트레스 반응은 주로 세린 40에서의 인산화와 Nrf2를 활성화시키는 protein kinase C (PKC) -δ를 통해 빠르게 일어난다. 반대로, Fyn은 티로신 5에서 Nrf2의 억제 성 인산화를 촉매한다활동의 긴밀한 통제를 위해 68. 인산화 부위를 발견하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 신속하고 매우 민감한 인산화 부위 맵핑 데이터는 이러한 방식으로 생성 될 수있다. 그러나 몇 가지 기술적 인 한계가 있으며 가끔 잘못된 신호를 생성합니다. 열악한 서열 범위는 종종 LC / MS 분석에서 발생합니다. 인산화 부위를 확인하기 위해서는 단백질의 최대 아미노산 범위에 대한 정보가 필요합니다 6 . 소화 단계에서 여러 단백질 분해 효소로 단백질을 단백질 분해하면 서열 범위를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인산화 잔기의 확인에 대한 또 다른 장애는 세린 및 트레오닌 인산화 된 펩타이드 6 , 7에서 자주 관찰되는 인산의 손 상 손실입니다. 불안정한 인산염 잔기는 종종단편화 과정에서 인산 펩타이드로부터 방출된다. 인산화 부위를 검색 할 때 두 번째 옵션은 펩타이드 마이크로 어레이 방법을 사용하는 것입니다. 목적 단백질로부터 유래 된 펩티드 단편을 함유하는 마이크로 어레이 칩을 사용하여 키나아제 표적 부위를 스크리닝하는 것이 가능하다. 그러나, 마이크로 어레이 칩의 생산 및 검출을위한 장비 요건으로 인해, 펩타이드 마이크로 어레이 방법은 시간 소모적이고 고비용으로 고려된다. 이러한 과제를 극복하기 위해, 시험 관내 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석은 공지 된 인식 모티프를 갖는 단백질 키나아제에 사용될 수있다. 키나아제의 공통 인식 모티프가 확립되면, 후보 기질의 추정 인산화 부위가 예측 될 수 있고, 그 부위의 진위가 확인 될 수있다. 이 과정에서 가장 설득력있는 방법은 돌연변이 단백질에서 인산화의 폐지를 보여주는 것이다.d 잔기는 비 - 인산화 가능한 아미노산 ( 즉, 세린 또는 트레오닌 내지 알라닌; 티로신 내지 페닐알라닌)으로 치환된다. 그러나, 돌연변이 단백질의 생산 및 분리는 시간 소모적이다. 연구 초기 단계의 대안으로 경쟁 펩타이드 키나아제 분석은 간단하고 편리합니다. 여기, 우리 는 체외 펩티드 경쟁 분석 및 인산화 사이트의 검증을위한 프로토콜을 설명합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem, Nottingham, UK</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK</td>
			<td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td>
			<td>14-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2 (WT)</td>
			<td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td>
			<td>H00004780-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-ATP</td>
			<td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZblue staining reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu turbo DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>600250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>L1704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td>
			<td>11259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td>
			<td>32034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td>
			<td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td>
			<td>QDF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td>
			<td>BSA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid glacial</td>
			<td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol</td>
			<td>Daejung Chemicals &#38; Metals, Siheung, South Korea</td>
			<td>5558-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-1746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dancing shaker</td>
			<td>FINEPCR, Seoul, Korea</td>
			<td>CR300</td>
			<td>The machine is needed for washing step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shakers</td>
			<td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td>
			<td>NB-205L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>LABOGENE, Seoul, Korea</td>
			<td>1730R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>732-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

특정 부위의 단백질 인산화가 다른 분자와의 형태 및 상호 작용을 결정합니다. 따라서 단백질 인산화는 세포의 생물학적 기능과 특성에 영향을 미친다. 현재, 인산화 부위를 발견하는 가장 일반적인 방법은 신속하고 민감한 방법 인 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 그러나, 상대적으로 불안정한 인산염 잔기는 단편화 단계에서 종종 포스 포 펩타이드로부터 방출되며, 이는 종종 거짓 음성 신호를 생성한다. 그러한 경우, 부위 특이 적 돌연변이 체를 이용한 전통적인 in vitro 키나아제 분석이 더 정확할 수 있지만,이 방법은 힘들고 시간 소모적이다. 따라서, 펩티드 경쟁을 이용하는 대안적인 방법이 유리할 수있다. 5 &#39;아데노신 모노 포스페이트 - 활성화 단백질 키나아제 (AMPK)의 컨센서스 인식 모티프가 확립되었고, 위치 스캐닝 펩타이드 라이브러리 엉덩이를 사용하여 확인되었다ay 2 . 따라서, 새로운 기질에 대한 AMPK 인산화 부위는 펩티드 경쟁 분석에 의해 예측되고 확인 될 수있다. 이 보고서에서 우리는 AMPK 매개 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2) 인산화를 설명함으로써 시험 관내 올리고 펩타이드 경쟁 키나아제 분석을위한 상세한 단계 및 절차를 기술한다. 인산화 부위를 인증하기 위해, 우리는 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여 순차적 인 in vitro 키나아제 분석을 수행했다. 전반적으로, 펩티드 경쟁 분석은 다수의 잠재적 인 인산화 부위를 스크리닝하고 인산화 부위 돌연변이 체에 의한 확인을위한 부위를 확인하는 방법을 제공한다.

그림 1 과 그림 2 는 이전에보고 된 논문 8 에서 반복 된 실험 결과를 보여줍니다. 상응하는 AMPK 표적 부위를 모방 한 3 개의 상이한 10 잔기 올리고 펩타이드 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330 내지 339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553 내지 562)가 합성되어 in 시험 관내 키나아제 분석. AMPK에 의...

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

oligopeptide-competition-assay-for-phosphorylation-site-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.3K 조회수.  Seoul National University.  펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다. 

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Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

연구

생화학

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning because it is involved in microtubule assembly and stabilization. Besides neurons, tau is expressed in human breast, prostate, gastric, colorectal, and pancreatic cancers where it shows nearly similar structure and exerts similar functions as the neuronal tau. The amount of tau and its phosphorylation can change its function as a stabilizer of microtubules, and lead to the development of paired helical filaments in different neurodegenerative disorders, such as Alzheimer&#39;s disease. Determining the phosphorylation state of tau and its microtubule-binding characteristics is important. In addition, examining the intracellular localization of tau is important in different diseases. This manuscript details standard protocols for measuring tau phosphorylation and tau binding to microtubules in colorectal cancer cells with or without curcumin and LiCl treatment. These treatments can be used to stop cancer cell proliferation and development. Intracellular localization of tau is examined by using immunohistochemistry and confocal microscopy while using low amounts of antibodies. These assays can be used repetitively for screening compounds that affect tau hyperphosphorylation or microtubule binding. Novel therapeutics used for different tauopathies or related anticancer agents can potentially be characterized using these protocols.

This manuscript describes standard protocols for measuring tau hyperphosphorylation, measuring tau binding to microtubules, and localization of intracellular tau following drug treatments. These protocols can be used repetitively for screening drugs or other compounds that target tau hyperphosphorylation or microtubule binding.

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.

Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular mechanism for learning and memory. Palmitoylation regulates localization and function of many synaptic proteins including AMPA-Rs, auxiliary factors and synaptic scaffolds in an activity-dependent manner. We identified the synapse differentiation induced gene (SynDIG) family of four genes (SynDIG1-4) encoding brain-specific transmembrane proteins that associate with AMPARs and regulate synapse strength. SynDIG1 is palmitoylated at two cysteine residues located at positions 191 and 192 in the juxta-transmembrane region important for activity-dependent excitatory synapse development. Here, we describe an innovative biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest and demonstrate its utility with the SynDIG family of proteins in mouse brain lysates.

Palmitoylation entails the incorporation of a 16-carbon palmitate moiety to cysteine residues of target proteins in a reversible manner. Here, we describe a biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest in mouse brain lysates.

아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) and its cognate tRNA (tRNAPyl) to assemble reconstituted mononucleosomes with site specific acetylated histones. MmAcKRS1 and tRNAPyl deliver AcK at an amber mutation site in the mRNA of choice during translation in Escherichia coli. This technique has been used extensively to incorporate AcK at H3 lysine sites. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) can also be easily evolved to incorporate other noncanonical amino acids (ncAAs) for site specific protein modification or functionalization. Here we detail a method to incorporate AcK using the MmAcKRS1 system into histone H3 and integrate acetylated H3 proteins into reconstituted mononucleosomes. Acetylated reconstituted mononucleosomes can be used in biochemical and binding assays, structure determination, and more. Obtaining modified mononucleosomes is crucial for designing experiments related to discovering new interactions and understanding epigenetics.

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Here we present a method to express acetylated histone proteins using genetic code expansion and assemble reconstituted nucleosomes in vitro.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...