Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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이 연구는 한국 정부가 후원하는 한국 연구 재단 (National Research Foundation for Korea) (No. 2015R1A2A1A10052663 및 No. 2014M1A3A3A02034698)의 지원을 받았다.

1. 안전 주의 :이 프로토콜은 [γ- 32 P] -ATP를 사용하여 AMPK의 활성을 평가합니다. Phosphorus-32는 방사성 동위 원소로 주로 베타 방사선을 방출합니다. 베타 입자의 크기가 매우 작기 때문에 쉽게 의류와 피부에 침투 할 수 있습니다. 베타 방사선에 대한 외부 및 내부 노출은 피부 화상과 조직 손상을 유발하는 것을 포함하여 인체 건강에 해로울 수 있습니다. <ol><li> 아크릴 차폐와 같은 적절한 보호 장치를 사용하여 [γ- 32 P] -ATP를 사용해야하는 모든 단계를 수행하십시오. </li><li> 모든 작업자가 모든 절차에서 유해한 방사선에 노출되는 정도를 모니터링하기 위해 전자 개인 선량계 (EPD)를 갖추고 있는지 확인하십시오. </li><li> 적절한 교육 및 규제 승인을받은 후에 만 ​​오픈 소스 방사선을 다루십시오. 참고 : 여기에서 모든 실험은 서울 대학교에서 오픈 소스 방사선 사용 교육을 마친 후에 수행되었습니다.한국 정부의 승인 및 승인 (nssc.go.kr/nssc/en). </li><li> 지역 규정에 따라 방사성 폐기물을 폐기하십시오. 참고 : 여기서는 서울 대학교 환경 안전 안전 연구소의 지침을 따랐습니다. 다음은 미국 및 유럽 국가의 규제 기관 목록입니다 : 미국, 미국 원자력 규제위원회 (http://www.nrc.gov/); 영국, 건강 및 안전 집행부 (HSE) (http://www.hse.gov.uk); 프랑스, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); 독일, 연방 환경부, 자연 보전, 건물 및 핵 안전국 (BMU) (http://www.bmu.de). </li></ol> 2. 생체 외 경쟁적 키니 아제 분석법 <ol><li> 경쟁 펩타이드의 구축 <ol><li> AMPK에 의해 인산화 된 컨센서스 모티프를 결정합니다. 참고 : AMPK는 컨센서스 모티프,- [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ이다. 컨센서스 순서에서 Φ는 소수성 아미노산 (valine [V], leucine [L], methionine [M], isoleucine [I])을 나타내며 β는 염기성 아미노산 ( 즉 라이신 [K], 아르기닌 [ R] 및 히스티딘 [H]) 1 . </li><li> 상기 컨센서스 모티프에 따라 표적 서열로부터 세린 또는 트레오닌 잔기를 선택한다. 인간 Nrf2 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330-339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553-562)의 3 개의 추정 사이트를 사용한다. </li><li> 추정 사이트를 모방 한 10 잔기의 펩타이드를 상업적으로 합성합니다. 합성 된 생성물을 각 펩티드에 대해 98 % 이상의 순도를 갖는 동결 건조 된 분말로서 수득한다. </li><li> 키나제 완충액을 사용하여 펩타이드를 용해시켜 71.667 g / L의 농도를 얻습니다. 펩타이드가 키나아제 완충액에 용해되지 않으면 20 % DMSO에 용해시킵니다. 그것이 불용성으로 남아 있다면, 펩티드를 모방 한 펩티드활성 부위가 용해도를 증가시키기 위해 확장 될 수있다. </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> 생체 외 경쟁 AMPK 키나아제 분석법 <ol><li> 다음과 같이 5 × 키나아제 버퍼를 준비 : 100 MM HEPES, 산도 7.4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β- 글리세로 포스페이트 (세린 / 트레오닌 포스파타제 억제제); 5 mM Na3 VO4 (티로신 포스 파타 아제 억제제); 0.5 % (v / v) 프로테아제 저해제 칵테일 세트 III, 1 mM 차가운 ATP; 및 500 μM AMP. 참고 : AMP는 AMPK 활동을 시험하기 위해 키나제 완충제의 필수 구성 요소입니다. 상기 완충액은 세린 / 트레오닌 키나아제 및 티로신 키나아제의 활성을 측정하는데 사용될 수있다. </li><li> 얼음에서 다음의 재조합 단백질과 합성 펩타이드를 녹입니다 : AMPK; Nrf2; 올리고 펩타이드 # 1, # 2 및 # 3을 포함한다. </li><li> 얼음에 반응 완충액을 준비하십시오 : AMPK 0.15 μg, Nrf2 (~ 4 pmol) 0.4 μg, 올리고 펩티드 (~ 300 nmol) 0.43 mg, 5 x 키나아제 완충액 6 μL. 에이멸균 증류수 (DW)로 최종 부피를 30 μL로 맞 춥니 다. 참고 : 반응 완충액을 준비한 후 [γ- 32 P] -ATP를 첨가하면 키나제자가 인산화로 인한 방사성 신호가 감소 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 반응물 실행하기 참고 : 아래의 모든 공정은 아크릴 보호막, 랙 또는 블록뿐만 아니라 적절한 개인 보호 장비로 보호해야합니다. <ol><li> 실험을 시작하기 전에 가열 블록을 30 ° C로 설정하십시오. </li><li> 얼음 상에 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다. 참고 : 32 P의 방사능은 약 14 일의 짧은 반감기를 갖는다. 반감기를 고려하여 부피를 조절하십시오 ( 예 : [γ- 32 P] -ATP의 생산으로부터 한 달 후 [γ- 32 P] -ATP 4 μL 첨가)-ATP로 1 μCi). </li><li> 샘플을 가열 블록에서 30 ° C로 15-30 분 동안 품어 낸다. 이 단계에서 7.5 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 겔을 준비하십시오. 표적 단백질의 크기에 따라 겔의 비율을 조정하십시오. </li><li> 10 % SDS 샘플 버퍼 (10 % (V / V) 글리세롤, 20 % (W / V) SDS, 15.42 % (W / V) 디티 오 트레이 톨, 90 % (V / V) 0.5 M 트리스 -HCl (pH 6.8), 및 0.02 % (w / v) 브로 모 페놀 블루). 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 섞는다. </li><li> 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간, 140V에서 1 시간 동안 연속적으로 시험한다. 참고 : 겔의 끝에있는 브로 모 페놀 블루 라인은 매우 높은 방사성 신호를 포함합니다. 배경 신호를 줄이기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 파란색 선 아래 젤을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> SDS-PAGE 후 캐스터에서 젤을 부드럽게 제거하십시오. 젤을 유리에 넣으십시오.다음 단계를 위해 ube. </li><li> 고정 버퍼와 20 분 (50 % 메탄올과 10 % 빙하 아세트산)에 대한 젤을 고정. </li><li> 부드럽게 젤을 여과지 위로 옮기고 투명한 포장지로 덮으십시오. 이 단계에서 젤이 쉽게 찢어 질 수 있습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다. </li></ol></li><li> 심상 <ol><li> 형광체 화면이나 X- 선 필름에 밤새 젤을 노출 시키십시오 (대개 약 16 시간 동안). 참고 : 형광체 화면은 매우 밝은 빛에 노출 된 후 다시 사용할 수 있습니다. X- 레이 필름을 사용하는 경우 젤을 2 일 동안 노출 시키십시오. X 선 필름은 형광체 스크린보다 낮은 감도를 가지고 있습니다. </li><li> 형광체 이미 저로 형광체 화면을 스캔하십시오. 이미지를 고해상도 TIFF 또는 비트 맵 파일로 내 보냅니다. </li><li> 시각화 후 젤을 유리 또는 플라스틱 용기에 옮겨 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) 염색을하십시오. </li><li> DW로 젤을 씻으십시오. DW를 버리고 th를 그어라.e 겔을 염색 시약과 1 시간 동안 섞는다. </li><li> 시약을 버리고 DW로 1 시간 또는 밤새 겔을 처치하십시오. 사무실 스캐너로 스캔하려면 투명 플라스틱 필름 (또는 동등한 것) 사이에 젤을 놓습니다. </li></ol></li></ol> 3. 사이트 특정 돌연변이를 사용 하여 체외 키나아제 분석 <ol><li> pGEX-Nrf2의 부위 유도 돌연변이 유발 <ol><li> 돌연변이 유발 프라이머 디자인 참고 : 적절한 돌연변이 유발 프라이머를 설계하는 것은 돌연변이 유발의 성공적인 결과에 중요합니다. 다음은 돌연변이 유발 프라이머를 설계하기위한 몇 가지 고려 사항입니다. 프라이머 중간에 원하는 돌연변이와 25 ~ 45 염기로 구성된 프라이머를 만듭니다. 프라이머는 40-60 % GC 함량을 가져야하며 하나 이상의 G 또는 C 염기로 종결되어야합니다. 프라이머의 Tm이 [Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / 염기 길이) - % 불일치]에 따라 78 ° C 이상인지 확인하십시오. 참고 :프라이머는 그 순도가 돌연변이 효율에 중요하기 때문이다. 돌연변이 유발 프라이머를 디자인하기위한 몇 가지 웹 사이트가 있습니다. <ol><li> &quot;사이트 지정 돌연변이 유발을위한 프라이머 디자인&quot;(http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)을위한 프라이머 디자인 프로그램을 엽니 다. </li><li> 인간 Nrf2 DNA 서열 (Access No. NM_006164.4)을 붙이고 &quot;번역 된 번역 업로드&quot;버튼을 선택하십시오. </li><li> 알라닌으로 변환 될 번역 된 아미노산 서열로부터의 세린 558 잔기를 선택한다. 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 알라닌에 대해 agc에서 gcc까지의 세린을 코돈으로 대체하십시오. </li><li> 프라이머 길이, Tm 및 GC 함량을 고려하십시오. 참고 : 돌연변이 유발 프라이머는 최종적으로 5&#39;-ctactgaaaaaacaactc gccaccttatatctcgaag-3 &#39;로 설계됩니다. </li></ol></li><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용한 돌 연변이 합성 반응 <ol><li> 얼음에 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오 : 10X 반응 완충액, 50ngpGEX-GST-Nrf2, 정방향 프라이머 125 ng, 리버스 프라이머 125 ng, dNTP 믹스 (각각 10 mM) 1 μL, Pfu DNA 폴리머 라 아제 2.5 U 및 멸균 DW를 50 μL로 첨가 하였다. </li><li> 다음 순환 프로그램으로 pGEX-GST-Nrf2 돌연변이 가닥 합성을위한 PCR을 실행하십시오 : 95 ℃에서 30 초 동안 1 사이클; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 1 분, 및 68 ℃에서 90 초의 18 사이클; 68 ℃에서 5 분 동안 1 사이클. 참고 : 플라스미드 길이에 따라 순환 매개 변수가 변경 될 수 있습니다. </li><li> 다음 단계를 위해 반응물을 식히기 위해 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다. 또는 4 ° C에서 밤새 보관하십시오. </li></ol></li><li> Dpn I 소화 및 변이 형 플라스미드의 선택 <ol><li> Dpn I 제한 효소 (10 U / μL) 1 μL를 냉각 후 반응물 각각에 첨가한다. 피펫 팅하고 1 분간 원심 분리하여 철저히 섞는다. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하여 부모를 소화시킨다 pGEX-GST-Nrf2 double-가닥 DNA. </li><li> DH5 α supercompetent 세포를 얼음 위에서 부드럽게 녹입니다. </li><li> 미리 냉각 DH5 α supercompetent 세포 150 μL에 반응물 50 μL를 추가하고 적어도 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 42 ° C로 예열 된 가열 블록에 튜브를 옮기고 90 초 동안 그대로 두십시오. 그들을 얼음에 2 분 동안 놓습니다. </li><li> 형질 전환 된 DH5α 세포에 예열 된 용 영돈 배양액 (LB)을 첨가하고 180 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> LB - 암피실린 한천 플레이트에 변형 세포를 퍼 뜨리고 37 ° C에서 밤새 품어. 참고 : 플라스미드 GEX-GST-Nrf2는 암피실린 내성 마커를 가지고 있기 때문에 암피실린은 선택에 사용됩니다. mutagenized 플라스미드의 저항 마커에 따라 적절한 항생제를 사용하십시오. </li><li> 접시에서 단일 식민지를 선택, 5 ML의 LB - 암피실린에 전송하고, 180 rpm으로 떨고와 함께 37에서 하룻밤 그것을 품어.돌연변이 유발 서열의 확인을 위해 적어도 세 개의 콜로니를 평가하십시오. </li><li> DNA 서열 분석을 위해 DNA miniprep kit를 사용하여 DNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 제조자의 프로토콜에 따라 자동 DNA 서열 분석기를 사용하여 돌연변이 유발 DNA 서열을 확인한다. 돌연변이 체 시퀀스의 확인을 위해 최소한 200 ng의 DNA 구조체를 사용하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제 <ol><li> 대장균에서 돌연변이 유발 GST-Nrf2 융합 단백질의 발현 <ol><li> mutagenic pGEX-GST-Nrf2 플라스미드를 BL21 세포로 형질 전환시킨다. 암피실린 (100 μg / ML)가 들어있는 LB 배지 25 mL에 단일 식민지를 접종하고 밤새 37 ℃에서 배양하십시오. </li><li> 배양 된 세포를 1 : 100 희석 비율로 암피실린 (100 μg / mL)을 함유 한 LB 브로 쓰 100 mL에 접종한다. </li><li> 37 ℃에서 배양하십시오.또는 600 nm에서 흡광도가 0.4-0.8 (약 4 시간)에 도달 할 때까지. </li><li> 1 MM IPTG의 최종 농도를 준비하기 위해 100 ML의 배양 세포에 1 M IPTG 100 μL를 추가합니다. </li><li> 단백질을 발현시키기 위해 6 시간 동안 또는 밤새 로테 리터에서 30 ° C로 세포를 인큐하십시오. </li><li> 20 분 동안 5,000 xg에서 세포를 원심 분리하고 세균 용해 버퍼 (25 MM HEPES, 5 MM EDTA, 2 MM DTT, 0.1 % CHAPS, 1 μg / ML pepstatin, 0.5 μg / ML leupeptin의 1 ML로 세포 알약을 resuspend, 및 1 mM PMSF)를 첨가 하였다. </li><li> 최대 전력 출력의 50 %에서 2 분 간격으로 초음파 호 모지 나이저를 사용하여 세포 펠릿을 녹입니다. </li><li> 4 분 15 분 12,000 × g에서 세포를 원심 분리기와 뜨는를 수집합니다. </li></ol></li><li> 재조합 GST-Nrf2 단백질의 정제 <ol><li> 50 % (V / V) 글루타티온 - 아가로 오스 비즈 200 μL를 준비하고 1 ML PBS (산도 7.3; 140 MM NaCl, 2.7 MM KCl, 10 MM Na 2 </sub&gt; HPO 4 및 1.8 mM KH 2 PO 4 ). 500 × g에서 1 분간 원심 분리하여 비드를 수집합니다. 세 번 씻으십시오. </li><li> 50 % (브이 / 브이) 글루타티온 - 아가로 오스 구슬의 준비 200 μL에 세포 lysate를 추가하고 4에서 품어 ° C 2 H를위한 끝 오버 회전 장치. </li><li> 500 xg에서 1 분간 원심 분리하여 GST-Nrf2 단백질과 결합 된 glutathione-agarose beads를 수집합니다. 31G 바늘과 1 ML 주사기를 사용하여 뜨는을 제거합니다. </li><li> 1 단계에서와 같이 구슬을 PBS (산도 7.3) 1 ML로 씻으십시오. </li><li> GST - Nrf2와 결합 glutathione - 아가로 오스 구슬에 용리 버퍼 (50 MM 트리스 - HCl 및 10 MM 감소 글루타티온, 산도 8.0) 500 μL를 추가합니다. 30 분 동안 끝 오버 로테이터에서 4 ° C로 품어 낸다. </li><li> 1 분 500 XG에서 원심 분리기 및 뜨는를 수집합니다. </li><li> 다시 구슬에 용리 버퍼 300 μL를 추가하고 3.2.2.5-3.2.2.6 단계를 두 번 반복하십시오. </li></ol></li><li> 정제 된 GST-Nrf2 단백질의 확인 <ol><li> 표준 단백질 BSA 0.5 μg로 단백질 양의 시각화를 위해 시료 5 μL를 준비하십시오. </li><li> 샘플을 7.5 % SDS-PAGE 겔에서 70V에서 20 분간,이어서 140V에서 60 분간 실시한다. </li><li> 겔을 2 시간 동안 0.1 % CBB 염색 용액 (CBB R250 0.1g, 99 % 메탄올 40mL, 빙초산 10mL 및 증류수 50mL)로 염색하고 탈염시킨다 (메탄올 30mL, 10 mL의 빙초산, 60 mL의 증류수)로 뚜껑을 덮는다. </li><li> destained 젤을 필터 용지에 놓고 투명한 래퍼로 덮습니다. 진공 젤 건조기로 80 ℃에서 1 시간 동안 겔을 건조시킨다. </li><li> 시험 관내 AMPK 키나아제 분석을 위해 농도계로 돌연변이 GST-Nrf2 단백질의 양을 결정하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 사이트 특이 돌연변이 체를 이용한 In Vitro AMPK Activity Assay 아니E : 시험 관내 AMPK 키나아제 분석은 정제 된 야생형 GST-Nrf2 또는 펩타이드 억제제가없는 GST-Nrf2-S558A 돌연변이 체 0.4 μg을 사용하여 단계 2.2 내지 2.4에 따라 수행 하였다. 1 단계에서 설명한 모든 방사선 안전 지침을 따르십시오. <ol><li> 0.15 μg의 AMPK, 0.4 μg의 돌연변이 체 또는 야생형 GST-Nrf2 및 5 개의 키나아제 완충액 6 μL로 얼음 상에 반응 완충액을 준비한다. 멸균 DW로 최대 30 μL를 채 웁니다. </li><li> 얼음 위에서 반응 튜브에 [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) 1 μL를 넣는다. 여러 번 위아래로 pipetting하여 반응 버퍼를 혼합하고 원심 분리기. </li><li> 30 분 30 ° C 가열 블록에서 샘플을 품어. </li><li> 10 × SDS 샘플 버퍼 3 μL를 추가하여 키나아제 반응을 중지하십시오. </li><li> 70 % V에서 20 분 동안 7.5 % SDS-PAGE 젤에서 실행하고 1 시간 동안 140V에서 실행하십시오. </li><li> 고정 버퍼와 겔을 20 분간 고정하고, 여과지 위로 옮기고, 투명 젤로 덮는다.ent 포장지. </li><li> 진공 젤 건조기로 80 ° C에서 1 시간 동안 젤을 건조시킨 다음 형광 막 또는 X 선 필름에 밤새 노출시킵니다. </li><li> 형광 물질 이미 저로 형광체 화면을 스캔하고 2.4 단계에 따라 시각화 후 CBB 염색을위한 유리 튜브로 젤을 이동합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

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AMPK에 의해 매개되는 예측 된 인산화 부위의 신뢰성을 평가할 수있는 간단하고 편리한 방법으로 경쟁 펩타이드를 사용하여 특정 인산화 부위를 발견하고 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여이를 검증 할 수있는 in vitro 키나아제 분석 에 대해 설명합니다 . 시험관 내 경쟁 AMPK 활성 분석 에서 얻은 대표적인 데이터는 펩타이드 경쟁 분석이 인산화 부위를 결정하는 유용...

특정 잔기에서의 단백질 인산화는 광범위한 세포 과정에서 중요한 역할을합니다. 따라서, 신호 전달 네트워크의 이해는 특정 인산화 부위의 확인을 필요로한다. 또한, 인산화 부위는 단백질 내의 개별 도메인이 상이한 구조 및 기능을 보유하기 때문에 단백질 기능에 대한 효과를 결정한다. 주요 항산화 인자 인 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2)의 활성은 다른 부위의 인산화를 통해 양방향으로 조절된다. 우리의 연구는 Nrf2의 인산화를 촉매하는 키나아제에 초점을 맞추었다. 산화 적 공격에 대한 Nrf2의 스트레스 반응은 주로 세린 40에서의 인산화와 Nrf2를 활성화시키는 protein kinase C (PKC) -δ를 통해 빠르게 일어난다. 반대로, Fyn은 티로신 5에서 Nrf2의 억제 성 인산화를 촉매한다활동의 긴밀한 통제를 위해 68. 인산화 부위를 발견하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 신속하고 매우 민감한 인산화 부위 맵핑 데이터는 이러한 방식으로 생성 될 수있다. 그러나 몇 가지 기술적 인 한계가 있으며 가끔 잘못된 신호를 생성합니다. 열악한 서열 범위는 종종 LC / MS 분석에서 발생합니다. 인산화 부위를 확인하기 위해서는 단백질의 최대 아미노산 범위에 대한 정보가 필요합니다 6 . 소화 단계에서 여러 단백질 분해 효소로 단백질을 단백질 분해하면 서열 범위를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인산화 잔기의 확인에 대한 또 다른 장애는 세린 및 트레오닌 인산화 된 펩타이드 6 , 7에서 자주 관찰되는 인산의 손 상 손실입니다. 불안정한 인산염 잔기는 종종단편화 과정에서 인산 펩타이드로부터 방출된다. 인산화 부위를 검색 할 때 두 번째 옵션은 펩타이드 마이크로 어레이 방법을 사용하는 것입니다. 목적 단백질로부터 유래 된 펩티드 단편을 함유하는 마이크로 어레이 칩을 사용하여 키나아제 표적 부위를 스크리닝하는 것이 가능하다. 그러나, 마이크로 어레이 칩의 생산 및 검출을위한 장비 요건으로 인해, 펩타이드 마이크로 어레이 방법은 시간 소모적이고 고비용으로 고려된다. 이러한 과제를 극복하기 위해, 시험 관내 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석은 공지 된 인식 모티프를 갖는 단백질 키나아제에 사용될 수있다. 키나아제의 공통 인식 모티프가 확립되면, 후보 기질의 추정 인산화 부위가 예측 될 수 있고, 그 부위의 진위가 확인 될 수있다. 이 과정에서 가장 설득력있는 방법은 돌연변이 단백질에서 인산화의 폐지를 보여주는 것이다.d 잔기는 비 - 인산화 가능한 아미노산 ( 즉, 세린 또는 트레오닌 내지 알라닌; 티로신 내지 페닐알라닌)으로 치환된다. 그러나, 돌연변이 단백질의 생산 및 분리는 시간 소모적이다. 연구 초기 단계의 대안으로 경쟁 펩타이드 키나아제 분석은 간단하고 편리합니다. 여기, 우리 는 체외 펩티드 경쟁 분석 및 인산화 사이트의 검증을위한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Calbiochem, Nottingham, UK</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>AMPK</td><td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>EZblue staining reagent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu turbo DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>200415-51</td><td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td><td>32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid glacial</td><td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyl alcohol&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td><td>Daejung Chemicals &amp;amp; Metals, Siheung, South Korea</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>Dancing shaker</td><td>FINEPCR, Seoul, Korea</td><td>CR300</td><td>The machine is needed for washing step</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Incubator/shakers</td><td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>LABOGENE, Seoul, Korea</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography columns</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

특정 부위의 단백질 인산화가 다른 분자와의 형태 및 상호 작용을 결정합니다. 따라서 단백질 인산화는 세포의 생물학적 기능과 특성에 영향을 미친다. 현재, 인산화 부위를 발견하는 가장 일반적인 방법은 신속하고 민감한 방법 인 액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 (LC / MS) 분석입니다. 그러나, 상대적으로 불안정한 인산염 잔기는 단편화 단계에서 종종 포스 포 펩타이드로부터 방출되며, 이는 종종 거짓 음성 신호를 생성한다. 그러한 경우, 부위 특이 적 돌연변이 체를 이용한 전통적인 in vitro 키나아제 분석이 더 정확할 수 있지만,이 방법은 힘들고 시간 소모적이다. 따라서, 펩티드 경쟁을 이용하는 대안적인 방법이 유리할 수있다. 5 &#39;아데노신 모노 포스페이트 - 활성화 단백질 키나아제 (AMPK)의 컨센서스 인식 모티프가 확립되었고, 위치 스캐닝 펩타이드 라이브러리 엉덩이를 사용하여 확인되었다ay 2 . 따라서, 새로운 기질에 대한 AMPK 인산화 부위는 펩티드 경쟁 분석에 의해 예측되고 확인 될 수있다. 이 보고서에서 우리는 AMPK 매개 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2) 인산화를 설명함으로써 시험 관내 올리고 펩타이드 경쟁 키나아제 분석을위한 상세한 단계 및 절차를 기술한다. 인산화 부위를 인증하기 위해, 우리는 부위 특이 적 돌연변이 체를 사용하여 순차적 인 in vitro 키나아제 분석을 수행했다. 전반적으로, 펩티드 경쟁 분석은 다수의 잠재적 인 인산화 부위를 스크리닝하고 인산화 부위 돌연변이 체에 의한 확인을위한 부위를 확인하는 방법을 제공한다.

그림 1 과 그림 2 는 이전에보고 된 논문 8 에서 반복 된 실험 결과를 보여줍니다. 상응하는 AMPK 표적 부위를 모방 한 3 개의 상이한 10 잔기 올리고 펩타이드 (Ser153을 포함하는 # 1, 148-157; Ser335를 포함하는 # 2, 330 내지 339 및 Ser558을 포함하는 # 3, 553 내지 562)가 합성되어 in 시험 관내 키나아제 분석. AMPK에 의...

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K 조회수.  Seoul National University.  펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다. 

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

연구

생화학

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

면역학 및 감염병학

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

생물학

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...