이 프로토콜을 사용하여 샘플 간 변이를 제거하면 mRNA와 단백질 수준 간의 샘플 내 불일치에 기반한 거대 분자의 차동 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. DNA, RNA 및 단백질을 분리하기 위해 동일한 샘플을 사용하여 가변성을 줄이고 재현성을 향상시키고 해석을 용이하게하려는 시도입니다. 이점은 샘플 수집 시 저장된 시간과 리소스와 가치 있고 제한된 샘플의 단면 분석이 포함됩니다.
시작하려면, 시드 1, 000 적절한 성장 조건과 하나의 10 센티미터 플레이트에 벌레 계란. 72시간 동안 섭씨 20도에서 배양하십시오. 그런 다음, M9 버퍼의 5 밀리리터로 접시를 세척하고 튜브에 1, 000 성인 벌레를 전송합니다.
1분 동안 1, 000g의 벌레원심분리, 상류체를 버리고, M9 완충제 1밀리리터로 펠릿 웜을 1.5밀리리터 마이크로센시드분리기 튜브로 옮긴다. 원심 분리기는 다시 845 g에서 1 분 동안 대부분의 상류체를 폐기하십시오. 펠릿 벌레를 섭씨 영하 80도에서 4시간 이상 보관하십시오.
다음으로 해동 된 펠릿에서 상류체를 제거하십시오. 차가운 GTCP 시약 1밀리리터를 넣고, 위아래로 파이프를 섞고 샘플을 얼음 위에 10분 간 놓습니다. 그런 다음 200 마이크로리터의 차가운 클로로폼을 추가합니다.
튜브를 15초 동안 힘차게 흔들어 실온에서 3분간 둡니다. 다음으로, 13, 500g에서 15분 동안 4도에서 튜브를 원심분리합니다. 마이크로 파이펫을 사용하면 클리어 위층을 새로운 RNase 가없는 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
흐린 흰색 상 간 레이어를 B2로 표시한 새로운 튜브로 옮기고 나머지 펠릿에서 분홍색 층을 B라고 표시된 새로운 튜브로 옮기고 얼음 위에 둘 다 놓습니다. 세 개의 레이어를 명백하게 분리하는 것은 어려울 수 있습니다. 나는 유기, 또는 분홍색 층에서이 층에서 DNA를 침전하는 대신 자신의 튜브로 흐린 상 간 층을 전송하는 것이 좋습니다.
RNA를 분리하기 위하여는, RNA를 침전시키기 위하여 100%이소프로판올의 500 마이크로리터를 먼저 튜브 A에 추가합니다. 그런 다음 실온에서 튜브를 10 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 13, 500g에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.
다음으로, 상체를 버리고 75%에탄올1밀리리터를 튜브 A에 추가하여 펠릿을 세척합니다. 5, 300g에서 5분간 튜브를 원심분리합니다. 상체를 버리고 펠릿 공기가 5~10분 동안 건조하게 하십시오.
RNA의 펠릿을 재구성하고 10 분 동안 55 ~ 60도에서 펠릿을 배양하기 위해 RNase가없는 물 50 마이크로 리터를 추가하십시오. 마지막으로, 260 나노미터에서 절연 된 RNA의 농도를 측정하고 230 및 280 나노미터에서 임의의 불순물을 식별하기 위해 분광계를 사용합니다. DNA를 분리하기 위해 먼저 튜브 B의 유기 상에 100%에탄올300 마이크로리터를 추가하고 튜브 B2의 흐린 백색 층에 첨가하여 DNA를 침전시키고 반전하여 실내 온도에서 2~3분 동안 튜브를 둡니다.
그런 다음 원심분리관 B와 B2가 섭씨 4도에서 376g에서 DNA를 펠릿하는 데 5분 동안 합니다. 튜브 B와 B2의 상체를 C라고 표시된 새로운 2밀리리터 튜브에 결합하여 후속 단백질 절연을 위해 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 튜브 B2에서 DNA 펠릿을 0.1 의 어금니 나트륨 구연산나트륨 1밀리리터로 30분 동안 10%에탄올로 씻는다.
원심분리기 튜브 B2에서 376g에서 섭씨 4도에서 5분간. 세척 단계를 반복한 다음 펠릿을 75%에탄올의 1.5 밀리리터로 다시 정지시키고 20분 동안 실온에서 둡니다. 다음으로, 원심분리기 튜브 B2에서 376g에서 섭씨 4도에서 5분 동안, 그 후 상류체를 버리고 펠릿이 5~10분 동안 건조되도록 합니다.
8 밀리리터 수산화 나트륨의 150 마이크로 리터에 펠릿을 녹입니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 376g에서 5분간 원심분리합니다. 마지막으로, 마이크로 피펫으로 DNA를 포함하는 상체를 새로운 튜브로 옮기십시오.
분광광계를 사용하여 260 나노미터에서 격리 된 DNA의 농도를 측정하고 230 및 280 나노미터에서 불순물을 식별하십시오. 단백질을 침전시키기 위해 먼저 튜브 C의 분홍색 상류체에 100%의 이소프로파놀1.5 밀리리터를 넣고 여러 번 반전하여 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 원심분리기 튜브 C는 섭씨 4도에서 13, 500g에서 10 분 동안.
상체를 버리고 0.3 개의 어금니딘 염산염 2 밀리리터로 펠릿을 실온에서 20 분 동안 95 %에탄올로 씻으십시오. 5분간 섭씨 4도에서 5, 300g의 원심분리기를 다시 한 번 하고 이전과 같이 세척 단계를 반복합니다. 단백질 펠릿을 C2로 표시된 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 최대 1.5밀리리터의 95%에탄올, 소용돌이를 추가하고 20분 동안 실온에 앉게 합니다.
5, 300g에서 5분간 튜브를 원심분리합니다. 상체를 버리고 펠릿이 실온에서 10 분 동안 건조하게하십시오. 그런 다음 펠릿을 섭씨 50도에서 50°C로 300마이크로리터에 60분간 녹입니다.
마지막으로, 10 분 동안 17섭씨에서 13, 500g의 튜브원심분리. 그리고 단백질을 함유하는 상체를 새로운 튜브로 전달한다. 정량적 역전사 PCR을 수행한다.
먼저, 분리된 RNA의 1나노그램을 사용하여 역전사에 의해 cDNA를 준비한다. cDNA의 스톡 플레이트를 만들기 위해 각 cDNA 샘플의 1~100희석제 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 우물에 추가하고, 각 유전자에 대한 프라이머 효율을 확립하기 위해 수성 우물 및 직렬 희석 시료와 같은 적절한 제어를 포함한다. 프라이머의 각 세트에 대한 마스터 믹스를 만들려면 최대 7 개의 마이크로 리터의 물, DNA 상호 작용 시안화 염료 및 5 개의 마이크로 어금니를 추가합니다.
RT-qPCR 플레이트의 적절한 웰에 마스터 믹스의 7마이크로리터를 추가합니다. 이어서, 스톡 플레이트에서 cDNA의 마이크로리터 3개를 추가하고 사용되는 프라이머에 적합한 RT-qPCR 프로토콜을 사용하여 플레이트를 실행한다. 3개의 벌레 균주의 4개의 독립적인 견본에서 격리된 mRNA의 RT-qPCR 분석은 RNA seq 분석에 의해 확인된 표적을 확인하기 위하여 행하였다.
F07C4.12 유전자는 eat-2 벌레에 있는 둘 다 분석에서 강화되었습니다, 그러나 rsks-1 벌레에 있는 그것의 강화 규정은 RT-qPCR 분석에 의해 검출되지 않았습니다. 또한, RNA seq는 EAT-2 및 rsks-1 웜에서 mrp-1의 발현 변화를 검출하여 RT-qPCR. 돌연변이 웜내의 세포구 마커 유전자의 하향 조절 또는 하향 조절을 통해 확인되었다.
SDS 페이지에 의해 분리되고 coomassie 파란색으로 염색된 벌레에서 RIPA 추출 단백질대 GTCp를 비교하면 GTCp 추출 단백질에 대한 더 큰 단백질의 더 나은 해상도와 유사한 품질을 보였습니다. 서양 얼룩 분석은 대부분의 경우에 유사한 단백질 수준을 보여주었습니다;그러나, 75 킬로달톤 보다는 더 큰 단백질은 RIPA 추출한 단백질에 있는 더 낮은 수준을 보여주었습니다. 3개의 벌레 긴장의 4개의 개별적인 견본에서 표적 mRNA및 단백질 수준 사이 비교는 단백질 수준에서 더 중대한 가변성을 가진 mRNA 수준의 낮은 가변성을 보여주었습니다.
DNA 절연의 맥락에서, 수율은 유기, 또는 분홍색, 층에서 흐린 상 간 층을 복구하는 능력에 크게 의존한다. 펠릿으로부터 단백질의 용용화를 개선하여 재용성 완충제의 부피를 증가시키거나 SDS 외에 다른 세제를 추가하는 것이 필요할 수 있다. 이 방법을 사용하면 mRNA를 단백질로 변환하는 것이 상대적이지 않고 다양한 조건하에서 전사 후 및 번역 후 규제 메커니즘에 대한 심층적인 조사로 이어질 수 있는 경우를 정확하게 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 귀중한 제한된 시간 코어 샘플을 보존하는 데 사용되었습니다. 또한, 나는 이것이 circadian 리듬 필드에서 채택하는 유용한 프로토콜이 될 것이라고 상상할 수 있습니다. RNA 절연에 사용되는 GCTP 시약 및 용매는 위험하며 주의해서 사용해야 합니다.
