우리는 국립 보건원 (R15 LB에 GM065444 - 03)과 건강 (NIH)과 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 국립 연구소 (KO)의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에서 자금을 인정하고 싶습니다. NSF 수상 (DBI - 0923402)는 LSM700 공촛점 현미경의 인수를 투자. 우리는 또한 일반적인 지원과 박사 앤디 황금의 원고에 대한 유용한 의견을 인정하고 싶습니다. 신용 공유 자원, 프로토콜 및 아이디어에 대한 전체 C. 엘레간스 커뮤니티로 이동합니다.

1. 선충류 문화 <ol><li> 해당 C.를 구합니다 엘레간스는 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료로부터 변형. </li><li> OP50 박테리아 론 (3) 씨앗 NGM 한천 플레이트에 nematodes 성장. 25 GFP 종자 성​​장의 분석 ° C 권장합니다. </li><li> 당신의 현미경 실험 전날는 씨앗을 품고 접시에 최소한 40 L4 유충을 선택하고 ° C 야간 25 접시를 놓습니다. 이 벌레는 실험을 위해 젊은 성인 것입니다. </li></ol> 2. 주사 이 같은 lysosomes이나 mitochondria와 같은 구조를 볼 수 바람직 경우, 성인 시각화하기 전에 형광 색소를 주입 수 있습니다. <ol><li> 마른 아가로 오스 사출 패드를 준비합니다. (이것은 사전에 많은 일을 할 수 있습니다) <ol><li> 물에 녹은 2% 아가로 오스를 준비합니다. 파스퇴르 피펫으로 22X54 mm의 coverglass에 2 방울을 넣어. 드롭 위에 교차 현명한 다른 coverglass를 놓습니다. 패드의 직경이 약 1.5 cm 때까지 적절한 두께를 달성하기 위해 상단 coverglass에서 누르십시오. 50~10분 위해 앉아 보자. </li><li> 최고 coverglass를 제거합니다. 1 시간 동안 80 ° C 오븐에 넣어하여 아가로 오스 패드를 탈수 또는 특급 benchtop 앉을 수 있습니다. </li></ol></li><li> Mitotracker 또는 Lysotracker 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 에그 버퍼에 형광 에이전트를 희석. 우리는 일반적으로 Mitotracker 또는 Lysotracker의 1시 10분 희석을 사용합니다. </li><li> 주사 바늘은 1.2 OD의 유리 모세관에서 이루어집니다. 바늘 풀러를 사용하여 주사 바늘을 당기세요. </li><li> 다시 희석 염료로 바늘을 채우기 위해 뽑아 Pastuer의 pipet을 사용합니다. </li><li> 사용까지 가벼운 무료, humidified 챔버에 넣어 바늘. </li></ol></li><li> 사전 사출 : 현미경과 주사 바늘을 설정합니다. <ol><li> 분사 장치에 마운트 주입 바늘. 우리기구는 DIC 이미징 기능을 갖춘 니콘 TE200 거꾸로 현미경의 무대에 탑재 Narishige 직접 드라이브 micromanipulator입니다. </li><li> 압력 조절기에 연결된 1.2 mm ID를 튜브에 바늘을 연결합니다. 압축 공기 또는 질소 중은 외부 압력 소스로 사용할 수 있습니다. 레귤레이터 20-25 PSI로 설정합니다. </li><li> 사출 패드에 무거운 광유 (Parafin 기름) 대신 2 방울. </li><li> 현미경에 사출 패드를 놓고 기름에 바늘을 낮추십시오. 압력이 적용되었을 때 바늘에서 자유롭게 있는지 유체 흐름을 확인합니다. 사출 압력을 적용하고 액체가 바늘 밖으로 흐르는지를 관찰합니다. 그렇지 않다면, 당신은 부드럽게 바늘의 끝을 휴식이 필요합니다. 주사 바늘을 부드럽게 사출 패드에 위치 깨진 coverglass의 작은 조금에 팁을 운전하여 고장 수 있습니다. 바늘이 흐르는되면 다음 단계로 이동하십시오. </li></ol></li><li> 사출. <ol><li> 이전보기 배아로 약 1 시간, 사출 패드에 오일 드롭으로 젊은 성인 벌레를 전송할 수 있습니다. 해부 현미경을 사용하여 전송을 수행합니다. 전송 벌레에 대한 뾰족한 팁있는 플래티넘 와이어 웜 선택을 사용합니다. </li><li> 그들은 패드에 직접 누워 수 있도록 10 웜 - 3 정렬. 사출 들어, 그것은 쉬운되는 웜은 서로 평행 줄지어하고 좀 덜 이상의 웜 길이 떨어져.중인 경우 벌레가 사출 패드에있는되면 신속하게 작업하고 웜은 탈수에서 멸망하기 전에 분사 과정을 완료하는 것이 중요합니다. </li><li> 사출 현미경의 현미경 단계에 벌레로 coverglass를 놓습니다. 말초 생식선 튜브의 중앙 부분 (rachis)에 중점을두고 있습니다. 그런 다음 동일한 초점 비행기로 바늘의 팁을 이동 micromanipulator를 사용합니다. 수평 그래서 벌레가 바늘로 구멍되는 단계로 이동합니다. 바늘 끝이 rachis 내부되면, 압력을 적용하고 생식선이 염료 혼합물로 작성하실 수 있습니다. 사출 패드에있는 모든 벌레의 생식선 무기를 모두 주사. </li><li> 주사 후, 벌레에 계란 버퍼의 0.5 ML를 제공하기 위해 가져온 파스퇴르 pipet을 사용합니다. 이것은 탈수의 죽음에서 그들을 유지하고 그들 사출 절차에서 복구하실 수 있습니다. </li><li> 벌레가 빛을 무료 humidified 챔버에서 실온에서 1~2시간에 대한 복구를 허용합니다. </li></ol></li></ol> 3. 배아를 볼 아가로 오스 패드 <ol><li> 에그 버퍼에서 용융 2% 아가로 오스를 준비합니다. </li><li> 파스퇴르 pipet으로 깨끗한 현미경 슬라이드에 용융 아가로 오스 3 방울을 넣어. </li><li> 그들을 취재 테이프를 라벨링 한 계층을 두 가지 다른 슬라이드 사이에 슬라이드. 다음은 아가로 오스의 패드가 올바른 두께 있는지 확인합니다 스페이서 역할을합니다. </li><li> 수직 아래로 아가로 오스 방울에 두 번째 깨끗한 현미경 슬라이드를 놓습니다. 상단 슬라이드 가이드 슬라이드에서 테이프에 달려 때까지 누르십시오. </li><li> 이 관찰을 위해 배아를 탑재 준비 직전에, 상단 슬라이드를 제거합니다. </li></ol><ol><li> 벌레가 주입되지 않은 경우, 다음 두 단계를 수행하십시오. 그렇지 않으면 그들을 건너 뛰십시오. <ol><li> 전날 준비했던 접시에서 젊은 성인 웜을 선택합니다. 당신은 젊은 성인 안에 배아를 볼 수 있어야합니다. </li><li> unseeded NGM 플레이트에 50-20 벌레를 선택하십시오. 벌레들에게 붙어있는 박테리아의 대부분을 잃게 될 수 있도록 벌레가 몇 분 동안 unseeded 접시 주위에 크롤 링을 허용합니다. </li></ol></li><li> 어른 벌레의 젊은 배아를 얻습니다 <ol><li> 18mm 2 글라스 coverglass (1.5 coverglass 두께가 바람직합니다)의 중간에 에그 버퍼의 5-20 μl 드롭 놓습니다. </li><li> 에그 버퍼의 드롭에 unseeded 판이나 사출 패드에서 벌레를 이동합니다. </li><li> 26 게이지 바늘로 피하 오픈 웜 컷. 외음부 근처의 벌레를 엽니다 컷. 이 배아는 웜의 흐르다가 나타납니다. </li></ol></li><li> 현미경 슬라이드에 마운트 <ol><li> 아가로 오스 패드와 함께 준비하고 태아와 coverglass에 그것을 낮은 현미경 슬라이드 반전. </li><li> 오랜 시간의 경과가 필요한 경우, dessication을 방지하기 위해 coverglass의 가장자리를 밀봉하기 위해 석유 젤리를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 5. 현미경 사용법 <ol><li> 해당 배아 찾기. <ol><li> 현미경 단계에 플레이스 슬라이드. 배아를 찾을 10X 렌즈와 스캔. </li><li> 초기 단계의 배아를 찾으려면, 산모 감수 분열을 작성하는 과정에있는 배아를 검색합니다. 그들이 단축 공사를하지 않았기 때문에 Meiotic 배아는 나중에 태아에서 구별하실 수 있습니다. (배아는 세포의 감수 분열을 마친 후 앞쪽에 끝에있는 세포막과 알 껍질 사이에 큰 차이를 볼 수 있습니다.) </li><li> 일단 확인이 적절하게 embryogenesis의 기록에 대한 높은 배율 렌즈 이동, 배아를 개최. </li></ol></li><li> 이미징 <ol><li> 이 예제에서, 우리는 mCherry을 표현 배아를 상상하고 있습니다 : H2B 및 GFP : UB 태그 단백질. 우리는 자이스 혈구 LSM700 기존의 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고 있습니다. </li><li> 이미지는 63X 1.4NA 렌즈를 사용하여 수집하고 있습니다. 488과 555 레이저는 최소한의 레이저 전원과 최대 이득과 함께 사용됩니다. AZ 스택은 모든 10-15초를 수집합니다. photobleaching의 범위에 따라 30-60 시간 포인트를 수집하고 있습니다. Z 스택 이미지는 최종 시간 경과 영상에 대한 최대 투사 이미지로 붕괴됩니다. </li></ol></li></ol> 6. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. C. 최초 유사 분열을 수정 엘레간스. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Microinjection 절차. 보충 비디오 1 GFP의 시간 저속 비디오 :.. meiotic 배아에서 ubiquitin 플러스 Lysotracker 블루 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">비디오를 보려면 여기를 누르십시오.</a>

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	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

정자와 융합 후, 접합자는 동적 이벤트의 시리즈를 겪습. 이러한 이벤트는 급속히 발전 배아에 상대적으로 정적 세포에서 oocyte를 변환. 많은 생물에서 세포질 rearrangements는 배아 극성을 수립 및 계란 활성화를 위해 중요하다. C. 엘레간스의 배아는 난자의 ​​활성화 및 embryogenesis 이러한 초기 이벤트를 관찰 수있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 수정 후 비교적 빠른 속도로 난자는 투명하고 초기 개발 이벤트가 발생합니다. C.가 엘레간스 연구팀은 찬란 초기 개발에 참여 표시된 단백질을 표현하는 많은 유용한 유전자 변형 종자를 생성합니다. RNAi 또는 돌연변이와 함께 이러한 변종을 사용하면 다세포 유기​​체의 개발 (5, 6, 7, 8) 기초 분자 경로를 해부위한 강력한 시스템을 제공합니다. 이 동영상이 문서에서는 C. 일찍 embryogenesis 동안에 이벤트를 기록하기 위해 이러한 도구와 기술을 사용하는 실용적인 접근 방식을 제시 엘레간스. 성숙 C. 엘레간스의 oocyte는 감수 분열 I의 prophase에서 체포되고 성인 남녀 추니의 spermatheca에 수정된 것입니다. 수정 후, oocyte는 감수 분열 I 및 II의 나머지 단계를 진행. 이러한 단계는 찬란 분류 히스톤 H2B (5)를 사용하여 볼 수 있습니다. 산모 감수 분열이 완료하는 동안 정자의 DNA는 (그림 1 참조) 응축 남아 있습니다. 감수 분열의 완성 후, 모자 아버지 DNA는 decondensed와 두 pronuclei 양식이됩니다. 산모 pronucleus은 그런 아버지 pronucleus 대한 마이 그 레이션 그리고 그들은 배아의 중앙 근처에 함께 참여합니다. 유사 분열 신속하게 pronuclear 회의 후 ensues. 이 모든 일들이 시간 안에 발생합니다. 따라서 이벤트의 순서의 시간 경과 현미경을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 기술을 수행하는 것은 공촛점 현미경에 대한 액세스 이외에 선충류의 culturing뿐만 아니라 기본적인 현미경 기술의 특정 시설이 필요합니다. 여기에 제시 예제는 유전자 변형 C.을 활용 : ubiquitin과 mCherry : : : H2B이 형광 단백질, GFP를 표현 엘레간스 변형. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경은 두 단백질의 역동적인 현지화을 관찰하는 데 사용됩니다. 또한, 우리는 찬란 분류 Lysotracker의 주입은 수정 후 배아의 lysosomes의 운명을 수행하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다. 라벨 추적 장치의 분사도 mitochondria 또는 지방 칼슘 농도 (9)의 시각화를 위해 수행할 수 있습니다. 이론적으로, 사출 프로토콜은 배아의 찬란 분류 분자의 모든 종류를 볼 사용할 수 있습니다. 이 표시된 작은 분자, 단백질, lipids 등 일부의 경우를 포함할 수 있습니다, 그것은 실제로 벌레가 쉽게 이해 등 mitotracker (10) 같은 염료를하므로 레이블 추적기를 주입 필요하지 않을 수 있습니다. 그러나, 우리는 몸으로 및 lysotracker의 주입을 모두 시도하고 배아의 시각화를 위해 사출과 함께 훨씬 더 나은 결과를 발견했다. 기술 고려 사항 : 이 절차가 나타 기술적 과제는 microinjection 기술뿐만 아니라 영상에 어려움을 아주 초기 배아를 포함합니다. microinjections에 대해서, 아가로 오스 분사 패드의 두께가 성공적으로 주사를 위해 중요합니다. 패드가 너무 두꺼운 경우 벌레가 dessicate 신속하게 죽을 것이다. 패드가 너무 얇은 경우에는 벌레가 사출 과정에서 패드에 집중하지 않습니다. 초기 배아는 온도와 버퍼 조건으로 환경 조건에 민감 수 있습니다. 와일드 타입 배아는 정자의 DNA와 세포의 감수 분열 II (4) 완성 분 정도 이내 pronuclear 이주 decondensation를 시작합니다. 20 분 내에, 첫번째 cytokinesis 시작한다. 배아가 매우 높은 레이저 강도에 노출되거나 과열되거나 설치 중에 깔린 경우,이 프로세스가 중단될 수 있습니다. 이러한 배아 개발을 체포합니다. 이 문제가 발생하면, 실험은 감소 레이저 전원 또는 두꺼운 아가로 오스 패드와 반복해야합니다. C. 엘레간스의 배아가 곧 수정이 끝날 때까지 자신의 알 껍질을 분비하지 않습니다. 수정 및 계란 껍질의 분비 사이의 짧은 시간 동안, 태아는 어머니 (11) 이외의 가능한되지 않습니다. 일부 실험실은. utero의 영상 배아 (5, 12)에 의해이 문제를 피할 수 있었을 utero에 이미지는 수정 중에 또는 이후에 발생하는 이벤트를 캡처하는 능력과 같은 특정 혜택을 제공합니다. 그러나,이 기술은 깊은 조직 이미징을 허용 현미경 시스템의 사용을 필요로합니다. 이러한 두 광자 또는 다중 광자와 같은 시스템은 특히이 (13, 14)에 적합합니다. 종래의 레이저가 - 스캔 또는 디스크 공촛점 현미경을 회전, 최고의 이미지는 배아에서 얻은 것을 헥타르를 사용할 때여기에 설명된하신 성인 웜 잘라되었습니다. 이미징 시스템 고려 사항 : 사용 공촛점 이미징 시스템의 유형은 사용자의 요구에 따라 달라집니다. 한 소원이 가능한 가장 높은 해상도의 이미지를 얻기위한 경우 일반적으로 레이저 스캔 시스템은 좋습니다. 이미지 수집가 비교적 신속하고 photobleaching / phototoxicity가 감소로 한편, 회전 디스크 시스템은 더 높은 동적 이미징 프로세스에 적합합니다. 특정 영상 매개 변수는 실험 설계 및 고용 공촛점 이미징 시스템에 따라 달라집니다. 다차원 영상에서, 하나는 수집 채널, 초점 비행기, 그리고 시간이 지점의 수를 고려해야합니다. photobleaching 및 phototoxicity의 제한 효과로 인해, 이미지의 유한 번호는 특정 실험에서 취득하실 수 있습니다. 당신이 취득하는 채널의 수를 늘리기 위해 선택하는 경우 따라서, 당신은 가능성이 초점 비행기 및 / 또는 시간 지점과 반대의 수를 줄이기 위해 필요합니다. 획득 수있는 이미지의 총수는 물론 사용중인 공촛점 현미경의 감도로 몇 군데되는 형광단의 강도에 의해 영향을받습니다. 더 강렬 fluorophores 더 민감한 악기 짧은 노출 시간을 필요로하기 때문에 적은 photobleaching 및 phototoxicity을 생산합니다. 다수 또는 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다. 우리는 우리 자신의 실험실에서 사용되고있는 시스템에 대한 자세한 내용을 제공할 것입니다. 디스크 공촛점 현미경을 회전하여 영상 웜 배아 위해, 우리는 계획 APO 목표를 NA 60X/1.4 장착된 니콘 TE2000U 거꾸로 현미경을 사용합니다. 현미경은 요코 CSU10 회전 디스크 장치, 하마 마츠 C9100 - 13 EM CCD 카메라, 그리고 스펙트럼 적용 연구 LMM5 레이저 병합 모듈 405에서 출력없이 네 고체 레이저를 포함, 491, 561 및 655 nm의 연결되어 있습니다. 이 시스템을 사용 우리는 하나 또는 두 개의 채널 6-12 초점 비행기, 그리고 25-50 timepoints을 (30~60초 간격) 캡처할 수 있습니다. 전형적인 노출 시간 100 200 밀리초입니다. 레이저 공촛점 현미경을 스캔 이미징 배아 위해, 우리는 2 채널과 네 개의 고체 레이저 (405 488, 555 및 635 nm의)이 장착된 자이스 혈구 LSM700을 사용합니다. 이 제도는 배아 이미징에 사용되는 계획 - APO 63X/1.4NA의 목적으로 자이스 혈구 Axio 관측기 거꾸로 현미경에 첨부되어 있습니다. 또한이 시스템은 제한된 영상 처리 및 분석 서비스를 제공합니다 이미지 수집을위한 자이스 혈구 선종 소프트웨어를 사용합니다. 이 fluorochromes과 이미징, 우리가 일반적으로 1-5 초점 비행기를 (따로 ~ 0.5 μm의) 수집 및 Z 스택에게 15 초마다를 수집할 경우. 중요한 photobleaching가 발생되기 전에 컬렉션이 계속됩니다. 최종 시간 경과 비디오를 생성하려면, Z 스택 이미지는 선 소프트웨어의 최대 투영 도구를 사용하여 통합하고 있습니다. 동영상은 AVI 파일과 소프트웨어 수출하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 구성 </th></tr><tr><td> 에그 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 5mM Hepes의 산도 7.2, 110mM NaCl, 4mm짜리 KCl, 5mM MG 아세테이트, 5mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M - 7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L - 7525 </td><td></td></tr><tr><td> 사출 모세관 Pipet </td><td> 하버드 장치, 켄트, 영국 </td><td> GC120F - 10 </td><td></td></tr><tr><td> 니들 풀러 </td><td> Kopf </td><td> 모델 700C </td><td></td></tr><tr><td> Microinjector 장치 </td><td> Tritech 연구 </td><td> MINJ - 1 microinjection 조절기 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis 엘레간스은 종종 초기 발달 과정 연구의 모델 시스템으로 사용되고 있습니다. 배아, 유전 자원, 그리고 변화의 상대적 용이성의 투명성 C. 만들 자질 아르 조기 embryogenesis을위한 훌륭한 모델을 엘레간스. 레이저 기반 공촛점 현미경과 찬란 라벨 태그는 연구자가 개발 배아의 특정 세포 구조와 단백질을 따르십시오 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 찬란 표시된 염료를 사용하여 같은 lysosomes 또는 mitochondria 같은 특정 organelles을 따를 수 있습니다. 이러한 염료는 성인 생식선에 microinjection에 의해 초기 배아에 전달할 수 있습니다. 또한, 특정 단백질의 지방화는 형광 단백질의 태그를 사용하여 다음 수 있습니다. 예제는 여기에 형광 염료를 사용 lysosomal뿐만 아니라 찬란 태그 히스톤 및 ubiquitin 단백질을 입증 제공됩니다. 분류 히스톤는 DNA를 시각화하기 때문에 세포주기의 단계를 식별하는 데 사용됩니다. GFP - ubiquitin 태그는 초기 배아에서 ubiquitinated vesicles의 역학을 나타낸다. 라벨 lysosomes 및 GFP의 관찰 : ubiquitin는 ubiquitinated vesicles과 lysosomes 사이 colocalization가 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. lysosomal 염료의 microinjection에 대한 기술이 제공됩니다. transgenenic 변종을 생성하기위한 기법 (1, 2) 다른 제공됩니다. 공촛점 현미경이나 회전 디스크 공촛점 현미경 표준 레이저에 시간 경과 현미경 다음 이미징 경우, 태아는 성인 남녀 추니의 nematodes 밖으로 절단되고 2퍼센트 아가로 오스 패드에 장착. 이 방법론은 일찍 embryogenesis의 높은 해상도 시각화를 위해 제공합니다.

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을 설명합니다<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em&gt;.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

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Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.8K 조회수.  University of Alabama in Huntsville. 이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을 설명합니다 Caenorhabditis 엘레간스.

비디오: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...