저자는 금융에 대한 MICINN (PTA 프로그램 몬트 세 라트 포르 드 라 Riva을 지원), AGAUR (로라 Fontrodona로 박사 원정대), Instituto 드 건배 카를로스 III (미구엘 Servet 프로그램 줄리안 Cerón을 지원), 그리고 마리 퀴리 IRG, ISCIII 및 IDIBELL을 인정하고 싶습니다 실험실.

1. 프로토콜 : 11 표백을위한 Culturing 웜 C의 대형 인구 elegans은 액체 언론이나 접시의 단단한 미디어 중 culturing 그들에 의해 얻을 수 있습니다. 그들은 일반적으로 E.으로 고체 NGM (선충류 성장 미디어)와 수사관에 재배되는 대장균의 (열에 13 또는 냉간 14에 의해, 자외선 12 시까지 사망) 생사 중 접시에 추가됩니다 세균. 가장 일반적인 절차는 라이브 OP50 E.을 사용합니다 uracil의 합성에 결함이 있고 벌레를 가리는 것이 두꺼운 레이어로 자라다 수 없습니다 대장균. <ol><li> NaCl 3 G, 한천의 17g 및 펩톤 2.5 g을 섞어서 H 2 O에의 975 ML에 추가 50 분 동안 압력솥. </li><li> 55 ° C.에 플라스크를 냉각 </li><li> 1 M CaCl 2 일 ML, 에탄올 5 MG / ML 콜레스테롤 1 ML, 1 M MgSO 4 개 중 1 개 ML과 1 M KPO 4 버퍼의 25 ML (그들 모두 있지만 콜레스테롤 이전 autoclav 추가ED). </li><li> 멸균 절차를 사용하여 페트리 접시에 NGM 솔루션을 분배, 그들의 부피의 2 / 3로 접시를 채우십시오. </li><li> 일단 건조, 그것은 오염 물질의 검출을위한 사용하기 전에 2-3 일동안은 실온에서 번호판을 떠날 것이 좋습니다. OP50 중에 행진을 준비한다 글리세롤 주식에서 대장균 (OP50이 Caenorhabditis 유전학 센터에서 구할 수 있습니다.) </li><li> 하나의 식민지를 선택하고 교반과 함께 37 ° C에서 하룻밤 LB에 들어라. </li><li> 층류에서 뚜껑을 제거하여 접시에서 증발하고 멸균 파스퇴르 피펫으로 접시의 중앙에 OP50를 추가하는 수분을 초과 허용합니다. </li><li> OP50 E. 허용 대장균의 잔디는 8 시간 동안 실온이나 37 ° C에서 하룻밤 사이에 성장합니다. </li><li> 접시 (37시 incubated 경우 ° C 플레이트를 사용하기 전에 룸 온도에서 냉각한다)에 웜의 원하는 금액을 추가합니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 미디어의 동일한 금액의 용탕 주입피펫이나 펌프 디스펜서와 함께 접시에 접시에 한천 같은 볼륨을 보장하고 stereomicroscope를 집중할 필요가없이 번호판 이동을 용이하게합니다. </li><li> 실온 또는 4 ° C.에서 컨테이너에 보관하면 플레이트 (씨앗을 품고 및 박테리아와 unseeded 모두) 몇 주 준비된 후 사용할 수 있습니다 </li><li> 접시의 가장자리에 박테리아를 도금하지 마십시오. 잔디 벌레들이 측면을 크롤 링하는 접시의 가장자리에 확장하면 밖으로 건조, 죽습니다. </li><li> 접시에 놓는 박테리아가 이미 15 사라졌으면 벌레가 더 오래 살고 있습니다. </li></ul> 2. 프로토콜 B : 알카라인 염소산 솔루션과 치료 ( &quot;표백&quot;) 11 표백 기술은 C를 동기화하는 데 사용됩니다 최초의 애벌레 단계에서 elegans 문화 (L1). 알 껍질은 전자를 보호하면서 방법의 원리는 벌레는 표백제에 민감있다는 사실에있다그것에서 mbryos. 알칼리 염소산 용액과 치료 후, 배아는 부화를 허용하지만, 앞으로의 개발을 방지 음식,하지 않고 액체 매체 incubated됩니다. <ol><li> 벌레가 성인 무대까지 성장하도록 허용합니다. </li><li> M9 버퍼로 접시를 씻는이 15 ML 튜브의 gravid 성인 복구할 수 있습니다. </li><li> 룸 온도 400xg (표준 테이블 원심 분리기에서 ~ 1,500 RPM)에서 2 분 동안 centrifuging와 뜨는 폐기하여 펠렛의 웜. </li><li> 버퍼가 박테리아의 맑은 나타날 때까지 1-3 세차장을 수행합니다. </li><li> 원하는 표백 솔루션 (표 I) 추가 (성인 조직의 파괴가 해부 현미경으로 모니터와 성인의 흔적이 아직도 볼 때 반응은 일반적으로 몇 가지에 따라 3시 사이에 9 분 정도 걸립있는 중단해야 몇 분 동안 선동 이러한 논의에 언급 웜 펠렛의 볼륨) (그림 3)과 같은 문제. </li><li> M9 buffe을 추가하여 반응을 정지R은 튜브를 기입합니다. </li><li> 신속하게 400 XG에서 1 분 (치료가 계속 활성화될 수 있기 때문에) 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> M9 버퍼와 함께 튜브를 작성하여 펠렛보다 세 번 씻는다. </li><li> 펠렛에 M9 버퍼 1 ML 추가하거나 unseeded NGM 접시에 계란을 배치하고, 부드러운 교반하여 원하는 온도에 부화. 적절한 폭기는 (그림 4)을 제공하여야한다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 다른 표백 해결책이 있습니다 (표 1, 그림. 1) 당신의 손에 더 잘 작동 하나를 선택합니다. </li><li> 이미 접시에 알을 낳았 같은 X 선 필름 조각 같은 부드러운 소재로 한천의 표면을 scrapping하여 복구할 수 있습니다. </li><li> 그들이 최근에 부화 유충에 대한 식량 공급을 구성으로 성인 동물의 너무 많은 유적들이 동기화를 손상 수 있습니다. </li><li> 높은 온도는 약간 불편 개발을 빠르게 전동기 및 비동기 웜 사이에 개발의 차이가 더 높은 온도에서 커야 때문에 F 어떠한 웜 생략 동기화. </li><li> 표백 용액은 그 사용 직전에 수행되어야합니다. 그것이 잠시 동안 오픈 이후 또한, 표백제는 photosensitivity로 인해 부분적으로 힘을 잃는. 우리는 이러한 손실을 방지하고 빛을에 대한 노출을 최소화하기 위해 작은 황색 병으로 나누어지는 각 새로운 병을 좋습니다. </li></ul> 3. 프로토콜 C : 웜 도금 <ol><li> 표백이 수행 후에 12 24 시간 (배아 개발을 완료하는 데 시간이 온도에 따라 다름) 사이에두고 원심 분리 (400 XG에서 2 분)에 의해 벌레를 복구합니다. </li><li> 필수 접시에 뜨는, 종자 웜을 무시하고 나머지 액체를 건조하게. </li><li> 필요한 온도에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> M9 버퍼에 L1의 애벌레는 ° C에서 1 주일 동안 적어도 출렁 WI 15 보관하실 수 있습니다명백한 변경을 thout. </li><li> 너무 많은 분들이 예상보다 빠르게 음식을 소진하고 실험을 망칠 수 있기 때문에 당신이 씨앗이됩니다 벌레를 계산할 때 조심하세요. 약 500 L1 음식이 다 실행하지 않고 55mm 판에서 성인기에 도달할 수 있습니다. </li></ul> 4. 프로토콜 D : C. elegans 관측 D.1 Nomarski 관찰 미분 간섭 대비 현미경은 흠없는 투명한 표본의 콘트라스트를 향상시키기 위해 사용되는 광학 현미경 조명 기술이다. 단어 Nomarski 그의 발명가의 이름을 따서 명명에 사용되는 프리즘,을 말합니다. 살아있는 동물을 관찰함으로써 우리는 고정에서 파생된 유일한 변경과 동물 생리학을 확인하실 수 있습니다. 더 정착액가 추가되지 않습니다로서뿐만 아니라, 형광 마커는 생체내에서 볼 수 있습니다. 이것은 사실과 흥미 유전자에 융합 형광 마커의 가능성은 가능 w에서 프로세스를 따르도록 할연구의 단백질이 관련되어있을 수도 hich. 이 프로토콜에 설명된 기술을 사용하여 라이브 벌레뿐만 아니라 관찰할 수 있지만 역시 다시 회수 및 도금 수 있습니다. 한천 패드 준비 (바로 사용 전) <ol><li> 물에 아가로 오스 2 % 준비하고 용융. 65 녹인 유지 ° C. </li><li> 셋째, 깨끗한 슬라이드의 양쪽에서 그들에 테이프 조각으로 두 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫 장소에게 깨끗한 표면 한천의 방울을 사용합니다. </li><li> 수직 세 슬라이드 위에 놓여 다른 깨끗한 슬라이드로 한천을 커버. </li><li> 그래서 한천 드롭이 테이프 스페이서의 두께로 평평하게되어 부드럽게 누르십시오. </li><li> 한천이 굳은 후 부드럽게 녹화 슬라이드를 당겨하고 다른 한 상대를 밀어서 남은 두 슬라이드를 구분합니다. </li></ol> 살아있는 동물 마운트 <ol start="7"><li> t쪽으로 놓으 levamisole 1mM의 방울 (10 μl) 또는 나트륨 azide 10-30 MM그는 패드의 중심지. </li><li> 웜 피크를 사용하여 드롭으로 동물을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 동물 위에 coverslip을 배치하고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 4 ° C.에 아가로 오스 2 % aliquots 유지 </li><li> 녹은 아가로 오스는 적어도 하루에 65 ° C에 보관하실 수 있습니다. </li><li> 참고 : Levamisole이 경직 근육 마비에게 16 elicits nicotinic 수용체 작용제이다. </li><li> 주의, 나트륨 Azide은 매우 독성이 있습니다! </li></ul> D.2 에탄올 고정 및 DAPI의 염색법 여기에서 설명한 프로토콜은 그러나 때문에 웜 dissecation의 일부 구조가 일부 변경을 제시 수, DAPI로 벌레를 염색의 빠른 방법을 나타냅니다. 이러한 나은 웜 17 무결성을 보존 Carnoy의 솔루션이나 포름 알데히드와 고정 등 DAPI 염색법의 이전에 벌레를 해결하기 위해 여러 가지 다른 방법이 있습니다. 에탄올 고정 (18에서 수정) <ol><li> 장소 ~ 현미경 슬라이드에 M9 버퍼의 10 μl (또는 물). </li><li> 벌레를 이용하는 것은 신중하게 드롭으로 10-25 웜을 전송 선택하십시오. </li><li> 벌레를 제거하거나 건조시키는없이 여과지 또는 가능한 마이크로 피펫 제거할만큼 M9 버퍼를 사용합니다. </li><li> 90 % 에탄올의 ~ 10 μl를 추가하고 말리면. </li><li> 한두 번 4 단계를 반복합니다. </li></ol> 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색법 <ol start="6"><li> 이 NG / μl의 최종 농도로 원하는 설치 미디어와 DAPI를 섞습니다. </li><li> 장착 미디어 혼합물 : 에탄올이 완전히 증발되면, DAPI 7 μl를 추가합니다. </li><li> coverslip을 놓고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결. 슬라이드는 DAPI의 추가 관찰 후에 약 5 분, 준비가 될 것입니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 장착 의대IA는 글리세롤을 포함, 작은 금액은 전체 준비를 충당 충분하므로. </li><li> 상업 장착 미디어의 다양한 (Fluoromount 또는 연장, 예를 들어)이 존재의 품질 및 가격은 샘플을 저장할 얼마에 따라 달라집니다. </li><li> 조심해, DAPI DNA가 풍부한 지역 시에에 강력하게 바인딩 알려진 mutagen입니다. </li></ul> 조리법 선충류 성장 매체 (NGM) 1.7 % (W / V) 한천 50 MM NaCl 0.25 % (W / V) 펩톤 1 ㎜ CaCl 2 5 μg / ML 콜레스테롤 25 MM KPO 4 1 ㎜ MgSO 4 M9 버퍼 22mM KH 2 PO 4 42 MM 나 2 HPO 4 86 MM NaCl 1 ㎜ MgSO 4 표백 솔루션 테스트 <table border="1"><tbodY&gt; <tr><td></td><td> 제조법 # 1 </td><td> 제조법 # 2 </td><td> 제조법 # 3 </td><td> 제조법 # 4 </td><td> 제조법 # 5 </td></tr><tr><td> 물 (ML) </td><td> 2.75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 (ML) </td><td> 1.25 (1M) </td><td> 0.5 (5M) </td><td> 2.5 (1M) </td><td> 2.5 (2M) </td><td> 2.5 (1M) </td></tr><tr><td> 나트륨 차아 염소 산염은 4 % (ML)를 낙제야 </td><td> 일 </td><td> 일 </td><td> 일 </td><td> 2 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 총 (ML) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> 표 I. 다른 표백 솔루션 요리법이 기사에 대한 테스트. 조리법 # 3와 # 4 배이며, M9 같은 볼륨에 추가되어 있어야합니다. # 1, # 2와 # 5에 대한 조리법는 이전에 2, 11, 19보고되었습니다. 최종 농도 : # 1 NaOH 0.25M, NaOCl은 0.8 % 였죠<html> , # 2 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %, # 3 0.625M NaOH, NaOCl ~ 1 %, # 4 1 M NaOH, NaOCl ~ 1.6 %, # 5 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %. 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 두 개의 서로 다른 배양 시간에 다섯 가지의 표백 솔루션의 비교. N2 벌레는 M9와 함께 두 번 쓸려는 각 표백 용액을 포함하는 다섯 15 ML 원뿔 튜브로 분할되었다. 튜브는 적극적으로 떨면서 1 ML은 지정된 시간 후에 반응을 막을 M9로 새 튜브로 전송되었습니다. 표백 후 절차 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML 함께 incubated되었다. 각각의 경우에 더 낮은 그림 단지, 24 시간 후에 상위 사진을 표백 후 찍은. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;고도 =&quot;그림 2 &quot;/&gt; 그림 2. 표백 용액의 온도는 치료의 효과에 영향을 미칩니다. N2 벌레의 평등 볼륨 중 이전에 20 분 동안 얼음으로 차게하거나 같은 시간 ° C ~ 25 살에 계속 같은 표백 솔루션을 표백했다. 단 표백 후 왼쪽 그림 표시에있는 두 개의 기둥. 치료 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated 있었다 후에. 24 시간 후에 바로 디스플레이 사진에 대한 열. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 비율 벌레 펠릿 : 알칼리성 염소산 보육 시간은 치료의 효과에 영향을 미치는 웜 펠렛의 50, 100, 250, 500 μl가 3, 6 및 9 분 동안 해결책 # 3을 표백 2 ML 함께 incubated되었다.. 부화 L1, 죽은 태아와 성인 파편의 유적은 2 20 ° C에서 배양 후 계량되었습니다<html> 4 M9 버퍼 1 ML과 15 ML 원뿔 튜브의 시간. 어른 벌레로 약 세 합류 55mm 판은 100 μl 벌레 펠렛을 얻을 필요합니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 적절한 폭기는 부화와 C의 생존을 위해 필요합니다 elegans의 배아. N2의 웜의 100 μl 펠릿는 6 분 동안 표백 및 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 중에 지정된, 1, 5 또는 10 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated했다. 화살표가 부화하지 않은 알을을 나타낼 위치를 그림의 상단 부분은 24 시간 후에 문화 사진을 표시합니다. 맨 아래에 명시된 조건에 표백 후 유충 (밝은 회색)과 죽은 태아 (어두운 회색) 48 시간의 금액을 묘사한 그래프가있다. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;고도 =&quot;그림 5 &quot;/&gt; 그림 5. C의 라이프 사이클 elegans. . 다른 단계에서 웜의 대략 길이. 시간 온도 (20에서 수정) 지정된 발달 단계에서의 서로 다른 웜니다. 나. Nomarski (최대) 및 DAPI (아래) 사진에 따라 각 단계에 도달하는 데 필요합니다. 각 단계에서 가장 중요한 기능은 확대되고 L1 : 화살표는 체세포의 생식선과 배아 라인의 엽 성의 전구 물질을 나타냅니다 L4 상순 : 검은 화살표 (Nomarski)은 개발 소문을 나타냅니다; 흰색 화살표 (DAPI)는 두 gonadal 무기를 나타냅니다 중순... L4 후반 : 화살표가 소위 크리스마스 트리 단계에서 개발 외음부를 나타냅니다 젊은 성인 :. 검은색 화살표가 자궁 안에 배아를 나타냅니다, 화살촉은 포인트가 spermatheca에, 흰 화살표 oocyte를 나타냅니다 Gravid 성인 :. 화살촉 (DAPI) 포인트 아웃은 수정된 배아. DAPI 이미지의 화살표가 spermatheca을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="그림 6" /> 6 그림. L3, L4와 성인 단계에 벌버의 형태학. L3 단계에서는 외음부가 형성되는 경우에만 작은 루멘을 볼 수 있습니다. L4에서는이 루멘은 소위 &quot;크리스마스 트리&quot;를 형성 확장합니다. 성인에서는 외음부가 이미 닫힙니다. 옐로우 라인이 세 단계에 산문의 위치를​​ 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. L3에서 DAPI의 염색법, 초기 L4, L4 지각하고 성인 단계. L3에서는 배아 라인은 늘어나지 않습니다. L4에, 생식선은 팔 현재 U-모양의 형태를. 늦은 L4 단계 정자에서 생식선의 말초 부분에서 볼 수 있습니다. 젊은 성인 oocytes을 제시. 성인 배아 라인 oocytes과 배아를 제공합니다. 옐로우 라인 회에서 배아 라인 경계를 정하다전자 다르게 명시된 단계. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="그림 8" /> 그림 8. C. 15 25 ° C. N2의 웜에서 elegans 개발 15시 M9와 교반 ° C, 접시에 양도하고 명시된 온도에서 지정된 시간을 성장에서 하룻밤 incubated, 표백되었다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

선충류 동기화 여러 표백 솔루션은 설명했습니다. 우리는 다섯 가지 요리법 (표 I)하려하고, 우리의 손에, 그들은 웜 인구의 동기화에 큰 차이 (그림 1)을 표시하지 않았다. 벌레의 부피 (그림 3)과 배아는 (그림 4) 부화를 위해 incubated하고있는 M9의 볼륨에 영향을 수행하지만, 우리의 실험은 온도 (그림 2)의 비율 표백...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

선충류의 Caenorhabditis elegans의의 분자 및 발달 생물학에 대한 연구는 시드니 브레너에 의해 초기 70 년대 시작되었고 이것은 이후 모델 생물 1로 광범위하게 사용되었습니다. C.는 elegans은 그것 수년 2에 대한 기초 생물 학적 연구에 적합한 실험적인 시스템을 만들어 단순, 투명성과 짧은 수명주기와 같은 주요 특성을 가지고 있습니다. 많은 세포와 분자 프로세스 제어 동물 개발 진화 보존되어 세는 것을 때문에이 선충류에서 발견 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다. 동물들이 성인기에 도달하기 전에 C. elegans 수명주기는 배아 단계 넷 애벌레 단계를 진행합니다. 개발은 온도에 따라 2-4일 소요될 수 있습니다. 단계의 각에는 몇 가지 특징적인 특성을 볼 수 있습니다. 깊은 annotat과 함께 4,5의 완전한 세포 혈통의 지식그 게놈의 이온 7,8를 노화 신경 생물학 6,, 줄기 세포 생물학 9, 배아 라인 생물학 10 다양한으로 분야에서 훌륭한 모델에이 선충류를 켜십시오. C를 만들어 부가 기능 와 일할 수있는 매력적인 모델을 elegans 것은 비교적 쉬운 프로토콜을 통해 특정 단계에서 동기화된 웜의 인구를 얻기의 가능성이다. 이 선충류을 유지하고 전파의 용이성은 이러한 RNAi 스크린, microarrays, 대규모 시퀀싱 작게하거나 높은 처리량 실험의 다양한 사용될 수 웜은 대량의를 얻기 위해 강력한 도구를 제공 동기화의 가능성에 추가 타인 간의 immunoblot 또는 원위치 하이브리드화에서. 의 투명성, C. 때문에 elegans 구조도 Nomarski 마이크로로 알려진, 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 현미경으로 구분할 수복사합니다. 형광 유전자 바인더, DAPI (4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole)의 사용은 예를 들어, 특정 식별 및 현지화 개별 세포뿐만 아니라, subcellular 구조 / 그들에게 관련된 결함을 초래할 수 있습니다.

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

선충류을 유지하고 증식의 아마<em&gt; C. elegans</em&gt; 그것으로 일하기 좋은 모델 생물하십시오. 동기화 웜의 가능성이 많은 동물에서 하나의 특정 프로세스의 연구를 용이하게 무엇 동일한 발달 단계에서 주제들을 상당히로 작업이 가능합니다.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

46.5K 조회수.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. 선충류을 유지하고 증식의 아마 C. elegans 그것으로 일하기 좋은 모델 생물하십시오. 동기화 웜의 가능성이 많은 동물에서 하나의 특정 프로세스의 연구를 용이하게 무엇 동일한 발달 단계에서 주제들을 상당히로 작업이 가능합니다.

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Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

연구

환경과학

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

유전학

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

행동분석학

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

생화학

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

신경과학

<meta charset="utf8"></head><body>예쁜꼬마선충(C. elegans)의 초기 발달 단계에서 칼슘 추적

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

발생학

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

기본

요약

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의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼