저자는 금융에 대한 MICINN (PTA 프로그램 몬트 세 라트 포르 드 라 Riva을 지원), AGAUR (로라 Fontrodona로 박사 원정대), Instituto 드 건배 카를로스 III (미구엘 Servet 프로그램 줄리안 Cerón을 지원), 그리고 마리 퀴리 IRG, ISCIII 및 IDIBELL을 인정하고 싶습니다 실험실.

1. 프로토콜 : 11 표백을위한 Culturing 웜 C의 대형 인구 elegans은 액체 언론이나 접시의 단단한 미디어 중 culturing 그들에 의해 얻을 수 있습니다. 그들은 일반적으로 E.으로 고체 NGM (선충류 성장 미디어)와 수사관에 재배되는 대장균의 (열에 13 또는 냉간 14에 의해, 자외선 12 시까지 사망) 생사 중 접시에 추가됩니다 세균. 가장 일반적인 절차는 라이브 OP50 E.을 사용합니다 uracil의 합성에 결함이 있고 벌레를 가리는 것이 두꺼운 레이어로 자라다 수 없습니다 대장균. <ol><li> NaCl 3 G, 한천의 17g 및 펩톤 2.5 g을 섞어서 H 2 O에의 975 ML에 추가 50 분 동안 압력솥. </li><li> 55 ° C.에 플라스크를 냉각 </li><li> 1 M CaCl 2 일 ML, 에탄올 5 MG / ML 콜레스테롤 1 ML, 1 M MgSO 4 개 중 1 개 ML과 1 M KPO 4 버퍼의 25 ML (그들 모두 있지만 콜레스테롤 이전 autoclav 추가ED). </li><li> 멸균 절차를 사용하여 페트리 접시에 NGM 솔루션을 분배, 그들의 부피의 2 / 3로 접시를 채우십시오. </li><li> 일단 건조, 그것은 오염 물질의 검출을위한 사용하기 전에 2-3 일동안은 실온에서 번호판을 떠날 것이 좋습니다. OP50 중에 행진을 준비한다 글리세롤 주식에서 대장균 (OP50이 Caenorhabditis 유전학 센터에서 구할 수 있습니다.) </li><li> 하나의 식민지를 선택하고 교반과 함께 37 ° C에서 하룻밤 LB에 들어라. </li><li> 층류에서 뚜껑을 제거하여 접시에서 증발하고 멸균 파스퇴르 피펫으로 접시의 중앙에 OP50를 추가하는 수분을 초과 허용합니다. </li><li> OP50 E. 허용 대장균의 잔디는 8 시간 동안 실온이나 37 ° C에서 하룻밤 사이에 성장합니다. </li><li> 접시 (37시 incubated 경우 ° C 플레이트를 사용하기 전에 룸 온도에서 냉각한다)에 웜의 원하는 금액을 추가합니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 미디어의 동일한 금액의 용탕 주입피펫이나 펌프 디스펜서와 함께 접시에 접시에 한천 같은 볼륨을 보장하고 stereomicroscope를 집중할 필요가없이 번호판 이동을 용이하게합니다. </li><li> 실온 또는 4 ° C.에서 컨테이너에 보관하면 플레이트 (씨앗을 품고 및 박테리아와 unseeded 모두) 몇 주 준비된 후 사용할 수 있습니다 </li><li> 접시의 가장자리에 박테리아를 도금하지 마십시오. 잔디 벌레들이 측면을 크롤 링하는 접시의 가장자리에 확장하면 밖으로 건조, 죽습니다. </li><li> 접시에 놓는 박테리아가 이미 15 사라졌으면 벌레가 더 오래 살고 있습니다. </li></ul> 2. 프로토콜 B : 알카라인 염소산 솔루션과 치료 ( &quot;표백&quot;) 11 표백 기술은 C를 동기화하는 데 사용됩니다 최초의 애벌레 단계에서 elegans 문화 (L1). 알 껍질은 전자를 보호하면서 방법의 원리는 벌레는 표백제에 민감있다는 사실에있다그것에서 mbryos. 알칼리 염소산 용액과 치료 후, 배아는 부화를 허용하지만, 앞으로의 개발을 방지 음식,하지 않고 액체 매체 incubated됩니다. <ol><li> 벌레가 성인 무대까지 성장하도록 허용합니다. </li><li> M9 버퍼로 접시를 씻는이 15 ML 튜브의 gravid 성인 복구할 수 있습니다. </li><li> 룸 온도 400xg (표준 테이블 원심 분리기에서 ~ 1,500 RPM)에서 2 분 동안 centrifuging와 뜨는 폐기하여 펠렛의 웜. </li><li> 버퍼가 박테리아의 맑은 나타날 때까지 1-3 세차장을 수행합니다. </li><li> 원하는 표백 솔루션 (표 I) 추가 (성인 조직의 파괴가 해부 현미경으로 모니터와 성인의 흔적이 아직도 볼 때 반응은 일반적으로 몇 가지에 따라 3시 사이에 9 분 정도 걸립있는 중단해야 몇 분 동안 선동 이러한 논의에 언급 웜 펠렛의 볼륨) (그림 3)과 같은 문제. </li><li> M9 buffe을 추가하여 반응을 정지R은 튜브를 기입합니다. </li><li> 신속하게 400 XG에서 1 분 (치료가 계속 활성화될 수 있기 때문에) 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> M9 버퍼와 함께 튜브를 작성하여 펠렛보다 세 번 씻는다. </li><li> 펠렛에 M9 버퍼 1 ML 추가하거나 unseeded NGM 접시에 계란을 배치하고, 부드러운 교반하여 원하는 온도에 부화. 적절한 폭기는 (그림 4)을 제공하여야한다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 다른 표백 해결책이 있습니다 (표 1, 그림. 1) 당신의 손에 더 잘 작동 하나를 선택합니다. </li><li> 이미 접시에 알을 낳았 같은 X 선 필름 조각 같은 부드러운 소재로 한천의 표면을 scrapping하여 복구할 수 있습니다. </li><li> 그들이 최근에 부화 유충에 대한 식량 공급을 구성으로 성인 동물의 너무 많은 유적들이 동기화를 손상 수 있습니다. </li><li> 높은 온도는 약간 불편 개발을 빠르게 전동기 및 비동기 웜 사이에 개발의 차이가 더 높은 온도에서 커야 때문에 F 어떠한 웜 생략 동기화. </li><li> 표백 용액은 그 사용 직전에 수행되어야합니다. 그것이 잠시 동안 오픈 이후 또한, 표백제는 photosensitivity로 인해 부분적으로 힘을 잃는. 우리는 이러한 손실을 방지하고 빛을에 대한 노출을 최소화하기 위해 작은 황색 병으로 나누어지는 각 새로운 병을 좋습니다. </li></ul> 3. 프로토콜 C : 웜 도금 <ol><li> 표백이 수행 후에 12 24 시간 (배아 개발을 완료하는 데 시간이 온도에 따라 다름) 사이에두고 원심 분리 (400 XG에서 2 분)에 의해 벌레를 복구합니다. </li><li> 필수 접시에 뜨는, 종자 웜을 무시하고 나머지 액체를 건조하게. </li><li> 필요한 온도에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> M9 버퍼에 L1의 애벌레는 ° C에서 1 주일 동안 적어도 출렁 WI 15 보관하실 수 있습니다명백한 변경을 thout. </li><li> 너무 많은 분들이 예상보다 빠르게 음식을 소진하고 실험을 망칠 수 있기 때문에 당신이 씨앗이됩니다 벌레를 계산할 때 조심하세요. 약 500 L1 음식이 다 실행하지 않고 55mm 판에서 성인기에 도달할 수 있습니다. </li></ul> 4. 프로토콜 D : C. elegans 관측 D.1 Nomarski 관찰 미분 간섭 대비 현미경은 흠없는 투명한 표본의 콘트라스트를 향상시키기 위해 사용되는 광학 현미경 조명 기술이다. 단어 Nomarski 그의 발명가의 이름을 따서 명명에 사용되는 프리즘,을 말합니다. 살아있는 동물을 관찰함으로써 우리는 고정에서 파생된 유일한 변경과 동물 생리학을 확인하실 수 있습니다. 더 정착액가 추가되지 않습니다로서뿐만 아니라, 형광 마커는 생체내에서 볼 수 있습니다. 이것은 사실과 흥미 유전자에 융합 형광 마커의 가능성은 가능 w에서 프로세스를 따르도록 할연구의 단백질이 관련되어있을 수도 hich. 이 프로토콜에 설명된 기술을 사용하여 라이브 벌레뿐만 아니라 관찰할 수 있지만 역시 다시 회수 및 도금 수 있습니다. 한천 패드 준비 (바로 사용 전) <ol><li> 물에 아가로 오스 2 % 준비하고 용융. 65 녹인 유지 ° C. </li><li> 셋째, 깨끗한 슬라이드의 양쪽에서 그들에 테이프 조각으로 두 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫 장소에게 깨끗한 표면 한천의 방울을 사용합니다. </li><li> 수직 세 슬라이드 위에 놓여 다른 깨끗한 슬라이드로 한천을 커버. </li><li> 그래서 한천 드롭이 테이프 스페이서의 두께로 평평하게되어 부드럽게 누르십시오. </li><li> 한천이 굳은 후 부드럽게 녹화 슬라이드를 당겨하고 다른 한 상대를 밀어서 남은 두 슬라이드를 구분합니다. </li></ol> 살아있는 동물 마운트 <ol start="7"><li> t쪽으로 놓으 levamisole 1mM의 방울 (10 μl) 또는 나트륨 azide 10-30 MM그는 패드의 중심지. </li><li> 웜 피크를 사용하여 드롭으로 동물을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 동물 위에 coverslip을 배치하고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 4 ° C.에 아가로 오스 2 % aliquots 유지 </li><li> 녹은 아가로 오스는 적어도 하루에 65 ° C에 보관하실 수 있습니다. </li><li> 참고 : Levamisole이 경직 근육 마비에게 16 elicits nicotinic 수용체 작용제이다. </li><li> 주의, 나트륨 Azide은 매우 독성이 있습니다! </li></ul> D.2 에탄올 고정 및 DAPI의 염색법 여기에서 설명한 프로토콜은 그러나 때문에 웜 dissecation의 일부 구조가 일부 변경을 제시 수, DAPI로 벌레를 염색의 빠른 방법을 나타냅니다. 이러한 나은 웜 17 무결성을 보존 Carnoy의 솔루션이나 포름 알데히드와 고정 등 DAPI 염색법의 이전에 벌레를 해결하기 위해 여러 가지 다른 방법이 있습니다. 에탄올 고정 (18에서 수정) <ol><li> 장소 ~ 현미경 슬라이드에 M9 버퍼의 10 μl (또는 물). </li><li> 벌레를 이용하는 것은 신중하게 드롭으로 10-25 웜을 전송 선택하십시오. </li><li> 벌레를 제거하거나 건조시키는없이 여과지 또는 가능한 마이크로 피펫 제거할만큼 M9 버퍼를 사용합니다. </li><li> 90 % 에탄올의 ~ 10 μl를 추가하고 말리면. </li><li> 한두 번 4 단계를 반복합니다. </li></ol> 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색법 <ol start="6"><li> 이 NG / μl의 최종 농도로 원하는 설치 미디어와 DAPI를 섞습니다. </li><li> 장착 미디어 혼합물 : 에탄올이 완전히 증발되면, DAPI 7 μl를 추가합니다. </li><li> coverslip을 놓고 일부 매니큐어이나 실리콘과 양쪽에서 해결. 슬라이드는 DAPI의 추가 관찰 후에 약 5 분, 준비가 될 것입니다. </li></ol> 도움말 : <ul><li> 장착 의대IA는 글리세롤을 포함, 작은 금액은 전체 준비를 충당 충분하므로. </li><li> 상업 장착 미디어의 다양한 (Fluoromount 또는 연장, 예를 들어)이 존재의 품질 및 가격은 샘플을 저장할 얼마에 따라 달라집니다. </li><li> 조심해, DAPI DNA가 풍부한 지역 시에에 강력하게 바인딩 알려진 mutagen입니다. </li></ul> 조리법 선충류 성장 매체 (NGM) 1.7 % (W / V) 한천 50 MM NaCl 0.25 % (W / V) 펩톤 1 ㎜ CaCl 2 5 μg / ML 콜레스테롤 25 MM KPO 4 1 ㎜ MgSO 4 M9 버퍼 22mM KH 2 PO 4 42 MM 나 2 HPO 4 86 MM NaCl 1 ㎜ MgSO 4 표백 솔루션 테스트 <table border="1"><tbodY&gt; <tr><td></td><td> 제조법 # 1 </td><td> 제조법 # 2 </td><td> 제조법 # 3 </td><td> 제조법 # 4 </td><td> 제조법 # 5 </td></tr><tr><td> 물 (ML) </td><td> 2.75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 (ML) </td><td> 1.25 (1M) </td><td> 0.5 (5M) </td><td> 2.5 (1M) </td><td> 2.5 (2M) </td><td> 2.5 (1M) </td></tr><tr><td> 나트륨 차아 염소 산염은 4 % (ML)를 낙제야 </td><td> 일 </td><td> 일 </td><td> 일 </td><td> 2 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 총 (ML) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> 표 I. 다른 표백 솔루션 요리법이 기사에 대한 테스트. 조리법 # 3와 # 4 배이며, M9 같은 볼륨에 추가되어 있어야합니다. # 1, # 2와 # 5에 대한 조리법는 이전에 2, 11, 19보고되었습니다. 최종 농도 : # 1 NaOH 0.25M, NaOCl은 0.8 % 였죠<html> , # 2 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %, # 3 0.625M NaOH, NaOCl ~ 1 %, # 4 1 M NaOH, NaOCl ~ 1.6 %, # 5 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0.8 %. 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 두 개의 서로 다른 배양 시간에 다섯 가지의 표백 솔루션의 비교. N2 벌레는 M9와 함께 두 번 쓸려는 각 표백 용액을 포함하는 다섯 15 ML 원뿔 튜브로 분할되었다. 튜브는 적극적으로 떨면서 1 ML은 지정된 시간 후에 반응을 막을 M9로 새 튜브로 전송되었습니다. 표백 후 절차 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML 함께 incubated되었다. 각각의 경우에 더 낮은 그림 단지, 24 시간 후에 상위 사진을 표백 후 찍은. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;고도 =&quot;그림 2 &quot;/&gt; 그림 2. 표백 용액의 온도는 치료의 효과에 영향을 미칩니다. N2 벌레의 평등 볼륨 중 이전에 20 분 동안 얼음으로 차게하거나 같은 시간 ° C ~ 25 살에 계속 같은 표백 솔루션을 표백했다. 단 표백 후 왼쪽 그림 표시에있는 두 개의 기둥. 치료 웜은 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 1 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated 있었다 후에. 24 시간 후에 바로 디스플레이 사진에 대한 열. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 비율 벌레 펠릿 : 알칼리성 염소산 보육 시간은 치료의 효과에 영향을 미치는 웜 펠렛의 50, 100, 250, 500 μl가 3, 6 및 9 분 동안 해결책 # 3을 표백 2 ML 함께 incubated되었다.. 부화 L1, 죽은 태아와 성인 파편의 유적은 2 20 ° C에서 배양 후 계량되었습니다<html> 4 M9 버퍼 1 ML과 15 ML 원뿔 튜브의 시간. 어른 벌레로 약 세 합류 55mm 판은 100 μl 벌레 펠렛을 얻을 필요합니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 적절한 폭기는 부화와 C의 생존을 위해 필요합니다 elegans의 배아. N2의 웜의 100 μl 펠릿는 6 분 동안 표백 및 24 시간 동안 20 ° C에서 M9 중에 지정된, 1, 5 또는 10 ML로 15 ML 원뿔 튜브에 incubated했다. 화살표가 부화하지 않은 알을을 나타낼 위치를 그림의 상단 부분은 24 시간 후에 문화 사진을 표시합니다. 맨 아래에 명시된 조건에 표백 후 유충 (밝은 회색)과 죽은 태아 (어두운 회색) 48 시간의 금액을 묘사한 그래프가있다. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;고도 =&quot;그림 5 &quot;/&gt; 그림 5. C의 라이프 사이클 elegans. . 다른 단계에서 웜의 대략 길이. 시간 온도 (20에서 수정) 지정된 발달 단계에서의 서로 다른 웜니다. 나. Nomarski (최대) 및 DAPI (아래) 사진에 따라 각 단계에 도달하는 데 필요합니다. 각 단계에서 가장 중요한 기능은 확대되고 L1 : 화살표는 체세포의 생식선과 배아 라인의 엽 성의 전구 물질을 나타냅니다 L4 상순 : 검은 화살표 (Nomarski)은 개발 소문을 나타냅니다; 흰색 화살표 (DAPI)는 두 gonadal 무기를 나타냅니다 중순... L4 후반 : 화살표가 소위 크리스마스 트리 단계에서 개발 외음부를 나타냅니다 젊은 성인 :. 검은색 화살표가 자궁 안에 배아를 나타냅니다, 화살촉은 포인트가 spermatheca에, 흰 화살표 oocyte를 나타냅니다 Gravid 성인 :. 화살촉 (DAPI) 포인트 아웃은 수정된 배아. DAPI 이미지의 화살표가 spermatheca을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="그림 6" /> 6 그림. L3, L4와 성인 단계에 벌버의 형태학. L3 단계에서는 외음부가 형성되는 경우에만 작은 루멘을 볼 수 있습니다. L4에서는이 루멘은 소위 &quot;크리스마스 트리&quot;를 형성 확장합니다. 성인에서는 외음부가 이미 닫힙니다. 옐로우 라인이 세 단계에 산문의 위치를​​ 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. L3에서 DAPI의 염색법, 초기 L4, L4 지각하고 성인 단계. L3에서는 배아 라인은 늘어나지 않습니다. L4에, 생식선은 팔 현재 U-모양의 형태를. 늦은 L4 단계 정자에서 생식선의 말초 부분에서 볼 수 있습니다. 젊은 성인 oocytes을 제시. 성인 배아 라인 oocytes과 배아를 제공합니다. 옐로우 라인 회에서 배아 라인 경계를 정하다전자 다르게 명시된 단계. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="그림 8" /> 그림 8. C. 15 25 ° C. N2의 웜에서 elegans 개발 15시 M9와 교반 ° C, 접시에 양도하고 명시된 온도에서 지정된 시간을 성장에서 하룻밤 incubated, 표백되었다.

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우리는 공개 할게 없다.

선충류 동기화 여러 표백 솔루션은 설명했습니다. 우리는 다섯 가지 요리법 (표 I)하려하고, 우리의 손에, 그들은 웜 인구의 동기화에 큰 차이 (그림 1)을 표시하지 않았다. 벌레의 부피 (그림 3)과 배아는 (그림 4) 부화를 위해 incubated하고있는 M9의 볼륨에 영향을 수행하지만, 우리의 실험은 온도 (그림 2)의 비율 표백...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

선충류의 Caenorhabditis elegans의의 분자 및 발달 생물학에 대한 연구는 시드니 브레너에 의해 초기 70 년대 시작되었고 이것은 이후 모델 생물 1로 광범위하게 사용되었습니다. C.는 elegans은 그것 수년 2에 대한 기초 생물 학적 연구에 적합한 실험적인 시스템을 만들어 단순, 투명성과 짧은 수명주기와 같은 주요 특성을 가지고 있습니다. 많은 세포와 분자 프로세스 제어 동물 개발 진화 보존되어 세는 것을 때문에이 선충류에서 발견 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다. 동물들이 성인기에 도달하기 전에 C. elegans 수명주기는 배아 단계 넷 애벌레 단계를 진행합니다. 개발은 온도에 따라 2-4일 소요될 수 있습니다. 단계의 각에는 몇 가지 특징적인 특성을 볼 수 있습니다. 깊은 annotat과 함께 4,5의 완전한 세포 혈통의 지식그 게놈의 이온 7,8를 노화 신경 생물학 6,, 줄기 세포 생물학 9, 배아 라인 생물학 10 다양한으로 분야에서 훌륭한 모델에이 선충류를 켜십시오. C를 만들어 부가 기능 와 일할 수있는 매력적인 모델을 elegans 것은 비교적 쉬운 프로토콜을 통해 특정 단계에서 동기화된 웜의 인구를 얻기의 가능성이다. 이 선충류을 유지하고 전파의 용이성은 이러한 RNAi 스크린, microarrays, 대규모 시퀀싱 작게하거나 높은 처리량 실험의 다양한 사용될 수 웜은 대량의를 얻기 위해 강력한 도구를 제공 동기화의 가능성에 추가 타인 간의 immunoblot 또는 원위치 하이브리드화에서. 의 투명성, C. 때문에 elegans 구조도 Nomarski 마이크로로 알려진, 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 현미경으로 구분할 수복사합니다. 형광 유전자 바인더, DAPI (4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole)의 사용은 예를 들어, 특정 식별 및 현지화 개별 세포뿐만 아니라, subcellular 구조 / 그들에게 관련된 결함을 초래할 수 있습니다.

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

선충류을 유지하고 증식의 아마<em&gt; C. elegans</em&gt; 그것으로 일하기 좋은 모델 생물하십시오. 동기화 웜의 가능성이 많은 동물에서 하나의 특정 프로세스의 연구를 용이하게 무엇 동일한 발달 단계에서 주제들을 상당히로 작업이 가능합니다.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

46.1K 조회수.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. 선충류을 유지하고 증식의 아마 C. elegans 그것으로 일하기 좋은 모델 생물하십시오. 동기화 웜의 가능성이 많은 동물에서 하나의 특정 프로세스의 연구를 용이하게 무엇 동일한 발달 단계에서 주제들을 상당히로 작업이 가능합니다.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

연구

생물학

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em&gt; 현장에서</emPNA 프로브에와&gt; 하이브리드 (FISH)<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

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A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...