다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

이미지 스트림 기반 미세 핵 분석법은 낮은 처리량 및 이벤트의 시각적 확인 부족을 포함하여 자동화된 현미경 검사법과 종래의 유동 세포측정과 같은 방법의 몇 가지 한계를 극복할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지독성과 세포 독성을 결정하는 데 필요한 모든 이벤트가 현미경 슬라이드를 만들 필요없이 자동으로 이미지, 식별 및 득점 될 수 있다는 것입니다. 클라스토겐 및/또는 무균에 세포 노출을 위해, T25 플라스크에서 적절한 세포 배양 배지의 9밀리리터에서 실험 세포의 5분의 1에 7~8회 10에 관심 있는 화학 물질의 1밀리미터를 대조군 배양에 넣고 1밀리리터의 물을 대조문화에 추가한다.

플라스크당 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 세포를 옮기기 전에 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3시간 동안 배양합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 새로운 T25 배양 플라스크에서 파종하기 위한 튜브 당 신선한 배양 배지의 10 밀리리터에서 펠릿을 재보종한다. 그런 다음 각 플라스크에 150 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 3마이크로그램의 최종 농도를 달성합니다.

경제협력개발기구(OECD)가 권고한 대로 1.5~2배의 회복시간을 인큐베이터에 반환한다. 회복 기간이 끝나면 원심분리를 위해 개별 15 밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 배양을 옮기고 75밀리머 칼륨염의 5밀리리터로 펠릿을 재보종한다. 반전으로 부드럽게 섞어서 샘플을 섭씨 4도에서 7분간 배양합니다.

인큐베이션이 끝나면 각 샘플에 4퍼센트 포르말린의 밀리리터 2개를 추가하고 3개의 반전과 부드럽게 섞습니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하기 전에 샘플을 섭씨 4도로 10분 간 반품합니다. 20 분 동안 신선한 4 % 포르말린의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.

인큐베이션이 끝나면 고정 된 세포를 튜브 당 세척 버퍼 5 밀리리터로 원심 분리에 의해 세척하고 튜브 당 세척 버퍼 100 마이크로 리터로 펠릿을 다시 분리하십시오. 다음으로, 혈혈계에 계산하기 위한 개별 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 샘플을 전송합니다. 밀리리터 당 1.0 x 10당 100 마이크로그램의 마이크로리터 5개, 밀리리터당 6개 세포에 1.0 x 10마이크로리터, 튜브당 100마이크로리터당 500마이크로리터를 밀리리터 RNase당 500마이크로리터를 첨가한다.

섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 이산화탄소 5%를 인큐베이션한 후, 미세원심분리기에서 샘플을 원심분리하고 각 튜브에서 30마이크로리터를 제외한 모든 것을 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 시료를 다시 중단하여 거품 형성을 유도하지 않도록주의하십시오. 재서스펜션 시 거품이 나타나면 튜브를 부드럽게 쓸어 제거합니다.

다중 스펙트럼 이미징 흐름 세포측정에 의해 샘플을 실행하려면 먼저 405 나노미터 레이저를 켜고 레이저 전력을 10 밀리와트로 설정합니다. 측면 분산 레이저를 포함한 다른 모든 레이저를 사용하지 않도록 설정하고 밝은 필드를 채널 1및 9로 설정합니다. 배율 슬라이더가 60배로 설정되어 있고, 고감도 모드가 선택되고, 채널 1, 7, 9만 이미지 갤러리에 표시되는지 확인합니다.

분산 플롯을 클릭하고 X 축의 모든 모집단 및 면적 M01을 선택합니다. Y 축에서 종횡비 M01을 선택하고 사각형 영역을 클릭하여 단일 셀 주위에 영역을 그립니다. 이 영역의 단일 셀이름을 지정하고 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 지역을 선택합니다.

단일 셀 영역을 강조 표시하고 X 좌표를 100 및 900으로 변경하고 Y 좌표를 0.75 및 1로 변경합니다. 획득 매개 변수를 설정하고 파일 이름과 대상 폴더를 지정합니다. 그런 다음 이벤트 수를 20, 000으로 변경하고 DNA 양성 집단을 선택하고 첫 번째 샘플을 실행합니다.

IDEA에서 데이터 파일을 열려면 분석 시작을 클릭하여 파일 마법사 열기를 시작하고 원하는 원시 이미지 파일을 선택하려면 찾아봅합니다. 그런 다음을 클릭하고 이미지 갤러리에서 이중 핵세포를 찾아봅누를 수 있습니다. 마스크를 만들려면 클릭하여 관심 이미지를 선택하고 분석 탭을 엽니다.

마스크, 새 기능 및 함수를 클릭하여 LevelSet을 선택합니다. 마스크 에서 M07 및 중간 레벨 마스크를 선택하고 등고선 세부 크기 조정을 3으로 설정합니다. 그런 다음 확인을 두 번 클릭합니다.

이중 핵셀 피처 수를 발견하려면 분석 탭을 열고 피처 및 새 기능을 선택합니다. 피처 유형의 경우 스팟 카운트를 선택합니다. 마스크의 경우 최종 이중 핵이 있는 마스크를 선택하고 결합을 4개로 설정한 다음 이름을 스팟 카운트 BNC로 변경하고 확인을 클릭하고 닫기하여 피처 값을 계산합니다.

스팟 카운트 바이뉴클레아드 세포 히스토그램을 보려면 히스토그램을 클릭하고 비아포토픽을 부모 집단으로 선택하십시오. X 축 피쳐의 경우 스팟 카운트 BNC를 선택하고 확인 및 선형 영역을 클릭한 다음 Bim Two에서 영역을 그리고 이 영역 2N이름을 지정합니다. 마이크로핵 마스크를 만들려면 이미지 갤러리에서 미세 핵을 포함하는 이중 핵세포를 선택하고 분석 탭에서 마스크를 엽니다.

스팟 식별 마스크 하나를 만들려면 새 기능 및 함수를 클릭하고 스팟을 선택합니다. 밝은 라디오 버튼이 선택되어 있는지 확인하고 마스크 에서 M07을 선택합니다. 스팟을 셀 배경 비율과 최소 반지름을 두 개로 설정하고 최대 반지름을 6으로 설정합니다.

확인을 클릭하고 확인을 클릭하여 왼쪽의 목록에 마스크를 추가한 다음 새 마스크를 클릭하여 다른 마스크를 만듭니다. 스팟 M07 채널 7 브라이트 두 개의 두 개의 두 개의 마스크를 클릭하고 마스크 정의에 추가하고 And 및 Not 연산자를 클릭다운 화살표를 클릭합니다. 아래쪽 화살표를 클릭하여 마스크 정의에 확장 된 범위 마스크를 추가합니다.

폴리핵형 인구 마스크를 만들려면 분석, 마스크, 새 및 기능을 클릭합니다. 함수에서 범위를 선택합니다. 마스크에서 유역 증류수 세트 M07 채널07, 중간, 3, 2를 선택하고 채널을 07에 표시하도록 이미지를 설정합니다.

최소 면적 및 최대 면적 값을 각각 135 및 5000으로 설정하고 최소 및 최대 종횡비 값을 각각 0.4와 1로 설정합니다. 확인을 클릭하고 이름 필드에서 텍스트를 변경하여 POLY 마스크를 읽은 다음 확인 및 닫기를 클릭합니다. 사용자 지정 보기를 만들려면 이미지 갤러리 속성 단추를 클릭하고 복합 정보 탭을 열고 새 뷰를 클릭합니다.

이름 아래에 채널 01을 채널 07로 입력합니다. 이미지 추가를 클릭하고 이미지 아래에서 채널 01을 선택하고 백분율을 100으로 설정합니다. 이미지 추가를 클릭하고 이미지 아래에서 채널 07을 선택하고 백분율을 100으로 설정합니다.

보기 탭을 클릭하고 새 탭을 클릭하고 이름 아래BNC 및 MN 마스크를 입력합니다. 그런 다음 열 추가를 클릭하고 이미지 유형 에서 채널 01과 마스크 아래에서 선택하여 없음을 선택합니다. 열 추가를 클릭하고 이미지 유형 아래에서 채널 07을 선택하고 마스크 아래에서 없음을 선택합니다.

열을 클릭하고 복합 라디오 버튼을 클릭한 다음 Okay를 클릭하여 사용자 지정 보기를 완료합니다. 풀다운 보기 메뉴를 클릭하고 BNC 및 MN 마스크 보기를 클릭합니다. 숨기기 마스크 표시 버튼을 클릭합니다.

주요 이벤트를 열거하려면 보고서 탭을 열고 통계 정의 보고서를 클릭한 다음 새 창에서 열 추가를 클릭합니다. 통계에서 이중 핵으로 된 셀 카운트 통계를 추가하려면 BNC 채우기를 선택한 다음 통계 추가를 클릭하여 목록에 통계를 추가하고 템플릿을 저장합니다. 모든 통계가 목록에 추가되면 닫기를 클릭한 다음 확인을 클릭한 다음 데이터 분석 템플릿을 저장합니다.

도구 메뉴에서 실험 파일을 일괄 처리하려면 일괄 처리 데이터 파일을 클릭하고 새 창에서 일괄 처리 추가를 클릭합니다. 파일 추가를 클릭하여 실험 파일을 선택하여 일괄 처리에 추가하고 템플릿 또는 데이터 분석 파일 선택 옵션 에서 열린 폴더 단추를 클릭합니다. 방금 저장된 템플릿을 찾아보고 엽니다.

확인을 클릭하여 현재 창을 닫습니다. 그런 다음 일괄 처리 제출을 클릭하여 모든 파일의 일괄 처리를 시작합니다. 여기서, 이중핵세포를 식별하기 위한 4개의 선택된 패널이 도시된다.

이러한 편변량 플롯 및 히스토그램은 이중 핵 세포의 선택뿐만 아니라 유사한 원형, 영역 및 강도와 함께 두 개의 핵을 가지고 있고 서로 잘 분리되는 세포의 식별을 가능하게합니다. 이 브라이트필드 와 Hoechst 심상은 양핵 세포 및 미세 핵 마스크뿐만 아니라 이중 핵세포 및 미세 핵의 식별 및 열거를 용이하게합니다. 현물 카운트 피쳐의 적용은 폴리핵 마스크를 사용하여 단일핵, 삼핵 및 사분핵 세포를 식별합니다.

그런 다음 삼중 핵 세포의 수를 합산하여 세포 독성 계산에 필요한 폴리핵 세포의 최종 수를 얻을 수 있다. 여기서, 대표적인 게놈 독성 및 세포독성 값은 프로토콜의 유효성을 입증하기 위해 내균 콜시친, 클로스토겐 미토마이신 C 및 음의 대조군, 매니톨에 대해 도시된다. DNA 얼룩의 적절 한 농도 세포를 레이블링은 높은 품질의 이미지 캡처를 보장 하기 위해 중요 하다, 모든 주요 이벤트를 쉽게 식별 하 고 득점 할 수 있도록.

이러한 기술은 또한 방사선 생물도시메트리에 대한 미세 핵 분석법에 적용되며, 이는 방사선에 노출되었을 수 있는 개인의 투여량 추정을 허용합니다.