저자는 전문적인 기술 지원을 Amnis 공사 (EMD Milllipore의 일부)에서 신시내티 아동 병원 연구 재단과 리처드 마르코, Sherree 친구, 스콧 모르드개의 연구 유동 세포 계측법 코어 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08HL088126 및 R01HL116352 (TAK)를 부여하고 P30의 DK090971 (YZ).

체외 적혈구 문화 1. 장기 (예 생체 내 적혈구 분화 문화 프로토콜 Giarratana로 등. 8, 수정 및 마우스 세포에 대한 적응) 이 체외 적혈구 프로토콜의 3 단계 장기입니다. 우선 스텝 (일 0-4)은 2 × 105 세포 / ml의 줄기 세포 인자 (SCF), 인터루킨 -3 (IL-3), 및 에리트로 포이 에틴 (EPO)이 보충 된 적혈구 모세포 성장 배지에 배치된다. 두 번째 단계 (5-6 일)에서, 세포 × 10 2에서 재현 탁하는 5 세포 / 만 에뽀 보충 신선한 적혈구 모세포 성장 매체에 부착 기질 세포 (MS5)에 ML와 공동 배양 하였다. 세 번째 단계 (7-9 일)에, 세포는 최대 적출에 사이토 카인 (그림 1A)없이 신선한 적혈구 모세포 성장 매체에서 MS-5 세포의 층에 배양. 모든 동물 프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다신시내티 아동 병원 의료 센터. <ol><li> 뼈와 저밀도 골수 세포의 분리의 수확 <ol><li> 2 ML 15 ML 원뿔 튜브에 2 % 소 태아 혈청 (FBS)를 포함하는 멸균 IMDM을 추가하고 얼음에 보관. </li><li> (자궁 경부 전위 다음에 예를 들면 CO 2 흡입,) 기관 승인 프로토콜 다음 (또는 그 유전자 타겟 마우스없이 함께) 2-6 개월 된 야생형 C57/BL6 마우스를 안락사. </li><li> , 집게와 메스를 사용하여 골반 뼈, 대퇴골, 두 다리의 경골을 분리 IMDM 2 %의 FBS가 들어있는 튜브에 추가하고 얼음에 보관. </li><li> (25-G의 X 몇 번 부드럽게 뼈를 통해 5 / 8 &quot;바늘. 세척 IMDM 2 %의 FBS와 집게 및 투베르쿨린 주사기를 사용하여 멸균 유동 세포 계측법 튜브와 플러시 뼈에 1 ㎖ IMDM 2 %의 FBS 추가 세포 현탁액에서 ~ 500 μl를 흡입하고) 뼈를 통해 다시 세척하고, 유동 cytometr으로 골수 세포를 수집 바이Y 관. 뼈가 흰색으로 나타날 때 세척이 완료됩니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너 세트를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. IMDM 2 %의 FBS와 같은 매체가 5 ML에 세포 현탁액의 최종 볼륨을 조절 이용하여 셀 스트레이너를 씻으십시오. </li><li> 밀도 구배 원심 분리하여 저밀도 골수 세포 (LDBM)를 준비 :주의 깊게 매체 1.083 ㎍ / ㎖ 750 XG에 15 ML 튜브와 스핀에서 25 밀도 구배 세포 분리의 5 ML에 세포 현탁액의 5 ML 레이어 분없이 브레이크 / 낮은 가속 실온 (RT)에서. </li><li> 뜨는 전송 (모든 것을 최대 15 ML 튜브의 2-ML 마크 버피 코트를 얻기 위해 약) 새로운 15 ML 튜브에 5 분에서 525 XG에 IMDM 2 %의 FBS와 한 번 더 세척을 수행 RT. </li><li> 기음 뜨는 RT에서 5 분 3 ML RBC의 용해 버퍼에 펠렛을 일시 중단하여 남아있는 적혈구 (RBC)를 용해. 적혈구 모세포의 큰 순도는 경우(생화학 적 연구에 대한 예) 최종 단계에서 필요한, 자기 분리에 의해 린 NEG 세포에이 단계에서 더 LDBM 세포를 정화. </li></ol></li><li> LDBM 또는 린 NEG 세포에서 시작 생체 적혈구 분화 배양 프로토콜 (그림 1A) <ol><li> 추가 7 ㎖의 IMDM 2 %의 FBS, 5 RT에서 분 및 구성된 2 ㎖ 적혈구 모세포 성장 매체 (EGM)에서 펠렛 세포를 재현 탁 525 XG에 스핀 : . 함유 StemPro-34 배지, 나. 2.6 % StemPro-34 중간 보충, C. 20 % BIT-9500, D. 900 NG / ML 황산 철, 전자. 90 NG / ML 질산 철, 바. 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민 g. 10 -6 M 하이드로 코티손 아. 갓 사이토 카인을 추가 : I) 100 NG / ML SCF, ⅱ) 5 NG / ml의 IL-3, ⅲ) 3 IU / ml의 에뽀. </li><li> 단을 사용하여 자동화 된 세포 계수기를 사용하여 수동으로 또는 현미경에서 세포를 세는ocytometer. </li><li> / 잘 EGM 2.5 ㎖ (2 × 10 5 LDBM의 세포 / ml)의 최종 부피를 37 ° C에서 배양 5 × 10 5 세포의 농도로 6 - 웰 세포 배양 접시 접시 (이 고려된다 문화의 날 # 0)입니다. </li><li> 상층 액 1.5 ㎖를 흡입 RT에서 5 분 525 XG에 회전, 3 사이토 카인을 포함하고 일 # 2에 다시 우물에 매일​​ 추가 새로운 배지 1.5 ㎖에 재현 탁하여 매체를 변경, 3, 4, 최적화 증식기. 3 일째에, 모든 세포를 제거 세고 ~ 2 × 105 세포 / ml의 웰 세포 농도를 유지하기 위해 웰 적절한 개수로 분할. 37 ° C / 5 % CO 2에서 문화를 유지한다. </li><li> 4 일에, 새로운 세포 배양 6 - 웰 플레이트의 우물 판 MS5 세포 (쥐 기질 세포 라인). MS5 세포 배양 배지는 20 % FBS를 함유하는, 100 단위 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 2 mM L-글루타민을 α-MEM된다. </li><li> 5 일에서 수를 계산자동 세포 계수기 또는 수동으로 혈구를 사용하여 현미경에서를 사용하여 원래 배양 플레이트의 각 웰에 세포 (지금은 크게 적혈구 모세포 농축). </li><li> 각 우물에서 모든 셀을 들어 올려 15 ML 원뿔 튜브로 전송, RT, 기음 상층 액에서 5 분 525 XG에 스핀 다운 및 2 × 10의 농도로 만 에뽀 (3 IU / ㎖)를 포함하는 신선한 EGM 펠릿을 용해 5 세포 / ㎖. </li><li> MS-5 세포는 전날 (공동 문화의 시간이 70 ~ 80 % 년 자랄를 대상으로) 도금 만 에뽀를 포함 EGM에있는이 우물의 적혈구 세포를 추가 한 우물에서 대기음 뜨는 (안 자신의 매체이지만 선택은, MS-5 세포는) 몇 일 동안 EGM에서 잘 남아있다. </li><li> 하루 # 6에 신선한 EPO를 추가 매체 변경합니다. </li><li> 더 추가 사이토 카인과 EGM를 사용하여, 하루 # 7 매체를 변경합니다. 일에서 9까지의 7, 세포 계측법 매일 안티 Ter119 및 SYTO-16로 염색 및 P 후 흐름을 적출에 대한 테스트 샘플멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법 (3 절에 설명 된대로)에 대한 샘플을 염색에 roceed. 참고 :. 하루에 2, 4, 6, 문화의 7에 도금하기 전에, 세포 계측법 크기 (FSC) 대 표면 마커 CD44와 Ter119을 평가하여 흐름과 적혈구 모세포 농축과 분화 배양 세포를 모니터 9 또는 CD71, Ter119 및 FSC 도 10, 11을 사용할 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 빠른 탈핵 분석, 요시다 등에 의해 기술 된 프로토콜에 따라. 수정 12 (그림 1B) <ol><li> 체외 적혈구 문화에 대한 스트레스 적혈구 유도와 기질 세포의 준비 <ol><li> IACUC의 지침에 따라 2-6 개월 된 야생형 C57/BL6 마우스 (예 : 이소 플루 란 솔루션을) 마취. 마우스가 충분히 부드러운 뒷발 핀치에 반사 반응의 부재과 확인하여 마취되었는지 확인절차를 수행하는 동안 정기적으로 호흡. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 안과 연고를 사용합니다. </li><li> 500 μL의 최종 볼륨에 출혈이 꼬리를 통해 스트레스 적혈구 생성을 유도한다. 인슐린 주사기를 사용하여 복강 동물의 유체 인공 호흡 (주입하기 전에 Trendelenburg 위치에 동물을 보유하고 내부 장기를 손상하지 않도록 낮은 복부에 주입) 보장하기 위해 생리 식염수 같은 양을 주입. </li><li> 새장을 이동하기 시작하고 떨어지지 않고 서서 걸을 수있는 동물로 표시된대로 모터 컨트롤을 회복 할 때까지 무인 마우스를 방치하지 마십시오. phlebotomized 마우스는 다른 마우스없이 케이지에 배치됩니다. </li><li> 이일 후, 24 웰 세포 배양 플레이트의 우물에서 MS-5 세포를 접시. MS5 세포 배지에서 37 ° C / 5 % CO 2에서 MS-5 세포를 품어 (-MEM 20 % FBS를 포함, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM의 L-글루타민)을 목표로 70 ~ 80이어야합니다 %의 합류 전48 시간 후 N 판 우물. </li></ol></li><li> 비장과 비장 세포의 처리의 수확 <ol><li> 네 일 (96 시간) 스트레스 적혈구 유도 한 후, 이전에 IACUC 승인 프로토콜 (자궁 경부 전위 다음에 예를 들면 CO 2 흡입)을 통해 마우스를 출혈 안락사. </li><li> 수확 비장과 IMDM 2 % FBS를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 넣어 얼음에 보관. </li><li> 위로 실험실, 멸균 조건하에 조직 배양 후드에서, 50 ㎖의 튜브 위에 설정된 40 μm의 셀 스트레이너에 비장 함유 관을 반전. 5 ㎖의 플라스틱 주사기의 플런저를 사용하여 비장을 분쇄. </li><li> IMDM 2 %의 FBS와 셀 스트레이너를 세척하고 같은 매체를 이용하여, 5 ml의 세포 현탁액의 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 조심스럽게 5 ㎖의 밀도 구배 세포 분리에 5 ㎖의 비장 세포 현탁액 레이어 매체없이 브레이크 / 낮은 가속 RT에서 25 분 750 XG에 15 ML 튜브와 스핀에서 1.083 ㎍ / ㎖. </li><li> 이전새로운 15 ML 튜브 및 RT에서 5 분 525 XG에 IMDM 2 %의 FBS와 한 번 더 세척을 수행 상층 액 (버피 코트를 얻기 위해 15 ML 튜브의 2-ML 마크에 대한 아래로 용액) . </li><li> RT에서 5 분 3 ML RBC의 용해 버퍼에 펠렛을 일시 중단하여 기음 뜨는를 Lyse 적혈구. </li><li> 세포를 세척하고 희석하고 4 ℃에서 5 분 525 XG에서 RBC의 용해 버퍼와 스핀을 중화 7 ML의 IMDM에게 2 %의 FBS 추가 </li><li> 기음 뜨는 적혈구 모세포 성장 매체 (EGM) 2 ㎖에 펠렛 세포를 일시 중지합니다. </li></ol></li><li> 플라스틱에 적혈구 모세포 농축 분리 된 저밀도 비장,, (빨리 체외 적혈구 문화의 첫 번째 단계)의 문화 <ol><li> 자동 세포 계수기 또는 수동 혈구에 의해 세포를 계산합니다. 이 단계에서 비장 당 고립 된 세포의 수는 평소 ~ 15 × 10 6입니다. </li><li> F에 (사이토 카인을 포함하는 더 EGM에있는 세포를 일시 중지원고 판 농도) : SCF 50 겨 / ㎖, IL-5 NG / ML 및 에뽀 2 U / ㎖. </li><li> / 24 - 웰 세포 배양 접시에 1 ㎖ / 웰 (물론 세포의 총 수에 따라 당 세포의 같은 수의)의 최종 부피에서 37 ° C에서 O / N을 배양 플레이트 1-5 X 10 6 세포 5 % CO 2. </li></ol></li><li> MS5 세포에 적혈구 모세포 (빠른 체외 적혈구 문화의 두 번째 단계의 문화 <ol><li> 대기음 아니라 플라스틱 뜨는 아니라 각 얼음에 5 분 동안 PBS에서 차가운 10 mM의 EDTA 2 ㎖를 추가하여 (높은 적혈구 모세포 풍부한) 세포를 올립니다. </li><li> (사이토 카인없이) EGM에 한 번 세탁하고 동일한에 재현 탁, 신선한 튜브에 세포를 넣고. </li><li> 에 1 ~ 2 ㎖의 볼륨 접시 5 × 5 -1 X 10 6 세포 각 MS5 셀 코팅 된 24 웰 플레이트의 잘. 약리 억제제가 실험에 사용되는 경우, 현재 적절한 농도를 추가. </li><li> 인도를 6 ~ 8 시간 (시간을 품다치료 WT 샘플의 약 30 % -40 %의 안구 적출술)의 현미경 관찰. MS-5 세포에 적혈구 모세포의 바인딩은 자신의 핵의 제거를 가속화합니다. </li><li> 얼음에 5 분 동안 차가운 PBS + 10 mM의 EDTA 2 ㎖를 추가하여 각 우물에서 세포를 올립니다. 적혈구 모세포와 함께, MS-5 세포는 또한 수집하지만이 나중에 쉽게 FSC 하이 Ter119으로 유세포 분석에서 제외 할 수 있습니다 - 세포. </li><li> 이 단계에서 세포는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 분석을 위해 고정 및 염색 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 핵의 제거시 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 지역화를위한 적혈구 모세포의 염색 <ol><li> , PBS로 세포를 씻어 5 RT에서 분 대기음 뜨는 525 XG에 스핀. </li><li> (고정 시간이 항에 따라 다를 수 있습니다 15 분 동안 PBS 3.7 %의 포름 알데히드 500 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하여 세포를 수정세대 프로빙) 부드럽게 피펫 팅된다. </li><li> 1.5 ㎖의 플라스틱 원심 분리기 튜브로 전송하고 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 20 초, 대기음 뜨는 부드럽게 각 튜브 및 피펫 500 μL PBS를 추가하여 하나의 세척을 수행하기위한 벤치 마이크로 원심 2,000 XG에 스핀. </li><li> 20 초, 기음 뜨는에 대한 벤치 마이크로 원심 2,000 XG에 스핀 적어도 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지. Permeablization는 3.6-3.9 신속하고 효율적으로 수행되어야하고, RT에서 회전 / 포부 다음, 세포 펠렛은 바로 세포가 더 나은 자신의 무결성을 유지하기 위해서는, 얼음에 다시 넣어해야합니다 단계를 반복합니다. </li><li> -20 ° C 냉동고에서 아세톤 솔루션을 꺼내 얼음에 넣어. 부드럽게 500 μL 얼음처럼 차가운 50 % 아세톤 DH (2 O 1:1)과 피펫에서 첫 번째 셀 펠렛을 재현 탁하여 세포를 투과. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 스핀 500 μL에 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛 2,000 XG60; 부드럽게 피펫 팅하여 얼음처럼 차가운 100 % 아세톤. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 스핀 부드럽게 피펫 500 μL 얼음처럼 차가운 50 % 아세톤에 한 번 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛 2,000 XG. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 스핀 2,000 20 초 XG, 대기음 뜨는 부드럽게 피펫 팅에 의해 차가운​​ FACS 버퍼 (PBS + 0.5 % BSA)에 한 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 그 분자에 대한 항체 마커 라벨 칵테일을 준비 적혈구 세포 얼룩에 대한 F-액틴 염색 1 μl/100 μL Ter119-PECy7 0.1 U/100 μL의 AF488-phalloidin도 있습니다. 대체 또는 추가 염색은 (1시 50분), AF-594-복합 콜레라 독소 서브 유닛 B 지질 뗏목에 라벨 (1:200), 안티 pMRLC (Ser19) AF-488-항-β-tubulin에 항체를 사용하여 수행 할 수 있습니다 인산화 된 마이 오신 규제 라이트 안티 - 토끼 AF-488 - 복합 이차 항체 (1:400) 다음 체인 (1시 50분), 및 안티-γ-부르 돈 관에 대한 일차 항체린 차 토끼 항체 (1:100)는 안티 - 토끼 AF-555 - 복합 이차 항체 (1:300) 하였다. </li><li> 상층 액을 흡인 후, 부드럽게 마커 칵테일, 피펫 100 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 핵 얼룩 DRAQ5의 2.5 μM을 포함하는 FACS 버퍼를 준비합니다. </li><li> 벤치의 microcentrifuge에 DRAQ5를 포함하는 60 ㎕의 FACS 버퍼에 20 초, 기음 뜨는에 resuspend 2,000 XG에 스핀 다운, FACS 버퍼에 세포를 씻으십시오. </li><li> 촬상 실행할 샘플 촬상 특정 분석 소프트웨어의 유동 세포 계측기를 사용하여, 실험 당 적어도 10,000 이벤트를 수집 이전에 출판 (13)으로 원시 데이터 파일을 보정하고,도 2에 도시 된 바와 같이 결과를 분석하는 유동 세포 계측기. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 적혈구 생체 성공적, 대규모 생산을 달성하기 위해 효율적으로 재현하기 가장 어려운 시험 관내 적혈구 조혈 배양 단계이기 때문에 최근에는 적혈구 모세포 적출술의 연구는 운동량을 증가를 얻고있다. 최근까지, 적혈구 모세포 안구 적출술의 연구는 주로 형광 현미경을 이용하고 세포 계측법 방법을 흐른다. 형광 현미경 방법은, 참여 분자를 식별하는 데 도움이라도 특정 시점?...

포유류의 적혈구 계보 내의 터미널 차별화 정색 적혈구 모세포는 망상 2를 생성, 그 막 쌌다 핵 (pyrenocyte)를 1 추방 통해 적출의 극적인 과정으로칩니다. 또한 성공의 속도 - 제한 단계가이 프로세스의 실기구는, 대규모는 체외에서 적혈구의 생산은 아직 완전히 해명되지 않는다. 탈핵의 적혈구 모세포 내 주요 단백질 구조의 지역화는 형광과 전자 현미경 3-5의 사용에 의존한다. 이 지루한 과정은 일반적으로 안구 적출술 이벤트의 제한된 수의 확인 결과 항상 의미있는 통계 분석을 허용하지 않습니다. 맥그래스 등. (6)에 의해 이전에 설명 적혈구 모세포 식별하는 방법에 확장, 우리는 멀티 스펙트럼 이마에 의해 적출 이벤트를 확인하고 연구의 새로운 접근 방식을 개발했습니다측정 값을 구하는 통계 분석을 수행하는 관측 충분한 수를 제공 할 수 ging를 유동 세포 계측법 (유체의 다 항목의 고속 이미징 셀, 유동 세포 계측법, 형광 현미경으로 결합 법) 07. 여기서, 우리는 적혈구 모세포를 동기화하고 평가시에 적출 캡처 가능성을 증가시키기 위해 사용되는 우선이 시험 관내 적혈구 조혈의 배양 방법을 설명한다. 그 다음 우리는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 적출 동안 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 현지화를 연구하기 위해 세부 사항에 고정 및 permeabilization 후 적혈구 모세포의 염색에 대해 설명합니다. 샘플은 사이토 촬상 흐름에서 실행하고 수집 된 세포는 적혈구 모세포 정색 6 식별 적절 게이팅된다. IMA 시야에서 측정 한 정색 적혈구 모세포이어서 그들의 애스펙트 비에 기초 분석ging를 각각 Ter119 및 DNA 스테인드 영역의 중심 간의 거리로 정의되는 파라미터 델타 중심 XY Ter119-DNA, 그들의 값 대. 낮은 화면 비율과 델타의 중심 XY Ter119/DNA와 세포의 인구는 고도의 세포를 탈핵에 충실. / - - 또는 결합 RAC2 - / - 야생형 (WT)를 사용하여 RAC2에 RAC1의 MX-크레 매개 조건부 삭제와 적혈구 모세포 대 적혈구 모세포; Rac3 - / - 유전 적 배경 및 다중 분광 영상의 흐름이 소설 분석 프로토콜은 세포 계측법, 우리는 최근 적출 비대칭 세포질 분열을 닮아 라 세미 GTPases에 의해 부분적으로 규제 actomyosin 링의 형성이 탈핵의 진행 7 중요하다는 것을 보여 주었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

포유류의 적혈구는 망상 적혈구 형성에 결과 적출의 극적인 과정을 마칩니다. 안구 적출술의 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 현미경으로 탈핵의 적혈구 모세포 내 주요 단백질 구조의 지역화를 연구 할 때 발생하는 일반적인 문제는 안구 적출술을받은 세포의 충분한 수를 관찰하는 어려움이있다. 우리는 흐름의 다중 매개 고속 세포 이미징 (멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법), 효율적으로 탈핵 이벤트의 상당 수를 파악하기 위해, 유동 세포 계측법과 면역 형광 현미경을 결합하는 방법을 사용하여 새로운 분석 프로토콜을 개발, 그것은 할 수 있습니다 측정을 획득하고 통계 분석을 수행합니다. 우리는 먼저 여기 뮤린 적혈구 모세포를 동기화 번째에서 적출 캡처 가능성을 증가시키기 위해 사용되는 두 개의 체외 적혈구의 배양 방법을 설명평가의 전자 시간. 다음, 우리는 멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의해 적출 동안 세포 내 단백질이나 지질 뗏목의 현지화를 연구하기 위해 세부 사항에 고정 및 permeabilization 후 적혈구 모세포의 염색에 대해 설명합니다. 크기 및 정색 적혈구 모세포를 식별하는 데 사용되는 DNA/Ter119 염색법과 함께, 우리는 기다란 세포와 &quot;델타 중심 XY Ter119/Draq5의 인식에 도움 시야 채널 내의 셀의 파라미터&quot;종횡비 &quot;를 활용 &quot;그 Ter119 염색 (초기 망상)의 중심이 멀리 떨어져 DRAQ5 염색 (핵 겪고 압출)의 중심에서있는 세포 사건의 식별 따라서 명백히하다에 대한 셀을 표시 할 수 있습니다. 높은 델타의 중심과 낮은 화면 비율 정색 적혈구 모세포 인구의 일부는 매우 세포를 탈핵에 충실.

첫째, 세포는 자신의 브라이트 화면 비율 (자신의 장축 대 자신의 미성년자의 길이의 비율)와 자신의 명 시야 영역 (자신의 크기를 나타내는)를 기반으로 분석된다. 명 시야 영역 값 (20)보다 낮은 200보다 높은과 이벤트는 각각 주로 파편과 세포 집계하고, 분석 (그림 2A)에서 제외됩니다. 하나의 셀 (게이트 &quot;R1&quot;)는 다음 이미지의 선명도를 나타내는 그라데이션 RMS 매개 변수에 대?...

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Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법에 의한 탈핵 이벤트에 쥐의 적혈구 모세포 모집단 인리 치드의 확인

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K 조회수.  University of Cincinnati College of Medicine.  이 의정서는 세포 계측법, 다중 분광 영상의 흐름에 의해 정색 적혈구 모세포를 탈핵 적혈구 모세포의 핵의 제거 프로세스의 시각화를 제공하는 인구를 식별하는 새로운 방법을 설명합니다. 

비디오: Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

연구

생물학

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

격리 된 괴 경 Protoplasts의 Cytometry에 의해 측정 Endoreduplication

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.