이 비디오에서는 인구에 미치는 영향을 최소화하고 과학적 가치를 극대화하기 위한 인도적인 방식으로 박쥐를 수집하는 단계별 가이드를 제공합니다. 우리의 접근 법의 장점은 우리가 각 박쥐에 대한 잠재적 인 분자 및 형태학적 데이터의 양을 극대화하고, 미래의 가치를 유지하기 위해 조직을 보존하고, 야생 개인수확을 최소화한다는 것입니다. 해부 프로토콜은 구두로 설명하기가 어렵습니다.
우리가 여기에서 제시하는 조직 준비 기술의 대부분은 다른 기관이 어떻게 확인되는지 시각화를 통해 가장 잘 전달되고, 그 때 제대로 해부되고 저장됩니다. 지연을 피하기 위해 해부를 시작하기 전에 모든 바이알을 준비합니다. RNA의 경우 각 시편에 필요한 바이알 수를 따로 둡니다.
수집될 조직 유형과 표준 시편 식별 정보로 각 튜브에 라벨을 부착합니다. RNA 안정화 용액으로 50%의 병을 채우고 섭씨 4도까지 식힙니다. 액체 질소에 배치할 때 튜브가 폭발할 수 있으므로 RNA 안정화 용액으로 바이알을 완전히 채우지 않도록 주의하십시오.
안락사 직후, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 박쥐 표본의 참수 작업을 수행한다. 코의 피부를 포함하여 모발, 근막 및 두개골 근육에서 두개골을 피부로 연결합니다. 코의 프런트 엔드를 부러뜨리지 않도록 주의하십시오.
시신경을 분리하기에 충분한 힘을 사용하여 집게로 눈을 제거하십시오. RNA 안정화 용액의 2 밀리리터 바이알에 눈을 놓습니다. 두개골의 등대 에서 목에서 시작하여 뇌를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
그런 다음, 부드럽게 뇌를 노출하기 위해 열어 금이 갈 때까지, 두개골의 양쪽을 다시 당겨 집게를 사용합니다. 두개골 끝의 두개골이 제거되었는지 확인하여 집게가 쉽게 뇌를 긁어 버릴 수 있도록 하십시오. 집게로 뇌를 부드럽게 긁어냅니다.
뇌는 매우 부드러질 것입니다. 후각 전구가 보이는 것으로, 두개골 내부의 복부 부분에 앉아 있을 것입니다. 후각 전구를 부착하여 보관하십시오.
가능하면 뇌 모양을 그대로 유지하고 즉시 드라이 아이스또는 RNA 안정화 용액의 5 밀리리터 바이알에 놓습니다. 두개골의 코골 끝에, 코클레이는 이제 머리의 양쪽에 측면으로 볼 수 있어야합니다. 집게를 사용하여 코클레이를 부드럽게 당깁니다.
그런 다음 RNA 안정화 용액의 2 밀리리터 바이알 1개에 넣습니다. 상단과 아래턱이 결합하는 두 개의 절개를 만들고 하악을 제거합니다. 크리브리폼 플레이트가 명백해질 것입니다.
이것은 연구원의 방향을 유지하는 중요한 뼈입니다. 그것은 여러 포먼, 그리고 후각 전구가 달려 두 개의 홈으로, 두개골의 가장 전방 영역으로 식별 할 수 있습니다. 하악이 제거되면 두개골의 나머지 부분에서 로스트럼을 제거하십시오.
턱에 크리브리폼 플레이트가 포함되어 있는지 확인합니다. RNA 안정화 용액에 코를 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 하악함에서 가위로 혀를 자르고 RNA 안정화 용액의 2 밀리리터 바이알에 놓습니다.
RNA 안정화 용액에 밤새 담그고 다음 액체 질소에 코 유리병을 놓습니다. 얼음이나 냉장고에 24시간 담근 후 샘플을 액체 질소에 넣습니다. 메스를 사용하여 복강을 관통하여 갈비뼈까지 세로 절개를 합니다.
이렇게 하면 골격 프레임이 몰수됩니다. 가슴을 드러내기 위해 피부를 제거하고 적어도 두 개의 근육을 섭취하십시오. RNA와 DNA 둘 다를 위한 조직은 이 해부 도중 집합됩니다.
고분자 DNA조직을 건조 극저온에 넣고 액체 질소에 플래시 동결을 넣습니다. RNA 안정화 용액에 RNA조직을 배치합니다. 흉골을 잘라 갈비뼈를 당깁니다.
이제 폐와 심장을 검색합니다. 메스와 집게를 사용하여 심장을 폐에서 분리하십시오. 메스를 사용하여 폐를 분해하고 RNA 안정화 용액에 배치하십시오.
전체를 취할 수 있지만 RNA 안정화 용액이 철저히 흡수되도록 반으로 단면되어야하는 심장을 수집합니다. 지금, 간에서 샘플을 가져 가라. 간 샘플을 적어도 두 개 복용하십시오.
1개의 견본을 높은 분자량 DNA를 위해 동결된 남아 있는 유리병에 놓고, RNA 안정화 용액에 그밖 견본을 놓습니다. 간 덕트를 따라 췌장과 담낭을 찾으십시오. 담낭을 RNA 안정화 용액의 병기로 옮는다.
위장을 찾아, 보라색의 다른 그늘로 나타나는 그것의 기지에서 깃털 같은 비장. 췌장은 또한 무게 구조로 여기에서 볼 수 있어야 합니다. RNA 안정화 용액의 각각 바이알에서 위, 비장 및 췌장을 수집합니다.
소장과 소장의 작은 샘플을 수집합니다. RNA 안정화 용액의 각 바이알에 배치합니다. 신장 중 하나를 가지고 방광에 자신의 덕트를 따라, 다음 RNA 안정화 용액의 각각의 바이알에 배치.
다른 신장을 가이드로 사용하여 여성이 있는 경우 남성, 자궁 및 난소의 고환을 찾으십시오. 가능하면 하나 또는 두 개의 생식구를 수집합니다. 또한 날개의 피부의 다양한 부분의 샘플을 가지고, 별도의 바이알에 보관.
우리의 접근의 주요 이점은 우리가 아직도 게놈 연구 결과, 기능적인 분자 연구 결과를 위한 충분한 물질을 생성하는 동안, 비 치명적인 방식으로 동물을 샘플링하는 것을 허용한다는 것입니다. 우리의 프로토콜은 날개 조직에서 기본 섬유 아세포의 준비를 허용합니다. 세포는 유전 물질의 귀중한 재생 가능한 근원을, 뿐만 아니라 박쥐에 있는 기능및 분자 탐사를 위한 모형을 나타냅니다.
필기 프로토콜의 섹션 6에 따라 성장 매체에 보존된 날개 클립은 조직 배양 시설로 옮겨져야 한다. 튜브의 내용을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 날개 막 생검은이 데모에 사용됩니다.
조심스럽게 성장 매체를 제거합니다. 멸균 PBS의 500 마이크로 리터로 생검을 두 번 부드럽게 씻으십시오. 튜브에 밀리리터 콜라게나아제 4당 1밀리그램의 500 마이크로리터를 추가합니다.
이것은 개별적인 세포로 조직의 소화를 일으키는 원인이 될 것입니다. 교반없이 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양하십시오. 둘째 날에는 신선한 성장 매체를 만들고 섭씨 37도까지 예열하십시오.
사용할 플레이트의 각 웰에 신선한 예온 성장 배지의 2 밀리리터를 추가하여 6개의 잘 조직 배양 판을 준비한다. 이 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 필요할 때까지 보관하십시오. 인큐베이터로부터 세포를 함유하는 15밀리리터 튜브를 제거하고, 신선한 성장 배지의 1밀리리터를 첨가하여 소화 반응을 담금질한다.
단일 셀 서스펜션을 달성하기 위해 P1000 파이펫 팁으로 용액을 신중하게 세트리튜레이션하여 세포를 다시 중단합니다. P1000 파이펫으로 액체의 80~90%를 부드럽게 제거하여 300배 G.에서 3분간 탁상 원심분리기에서 셀을 부드럽게 회전시다. 미리 따뜻해진 성장 매체의 500 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
펠릿이 더 이상 보이지 않도록 서스펜션을 부드럽게 세트리에트하여 세포가 충분히 일시 중단되어 벽에 여전히 볼 수 있는 작은 조직을 피하십시오. 셀 서스펜션의 전체 부피를 미리 준비한 6개의 웰 플레이트의 단일 웰로 부드럽게 피펫하여 사전 웜 성장 매체를 함유하고 있다. 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 서 두 세 번 뒤로 흔들어 세포가 단일 층의 우물 표면에 분배할 수 있도록 돕습니다.
현미경으로 도금된 세포를 확인하십시오. 그(것)들은 공과 떠있는 것처럼 보이는 단 하나 세포이어야 합니다, 그러나 아주 조밀합니다. 조심스럽게 37섭씨와 5%의 이산화탄소를 선셋한 인큐베이터에 접시를 넣습니다.
약 24 시간 후, 배양의 건강을 결정하기 위해 현미경의 밑에 세포를 관찰한다. 이제 셀을 플레이트 표면에 부착하고 평평하게 나타납니다. 가습 된 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %로 미리 설정하여 유지하십시오.
세포는 미디어 다과 또는 분할의 필요성을 결정하기 위해 정기적으로 현미경으로 관찰되어야합니다. 필요할 때마다, 조심스럽게 우물에서 매체의 약 50 %를 흡인하고, 부드럽게 세포를 방해하지 않도록, 잘의 측면에 미리 따뜻해지는 성장 매체의 1 밀리리터를 추가합니다. 세포를 통과 할 필요가있을 때, 조심스럽게 성장 매체의 약 90 %를 흡인.
세포를 방해하지 않도록 멸균 PBS의 1 밀리리터를 벽에 추가하여 세포를 매우 부드럽게 씻으십시오. 접시를 앞뒤로 좌우로 2~3번 부드럽게 흔들어 놓습니다. 조심스럽게 다시 세포를 세척하기 전에 접시에서 PBS의 모든을 흡인.
트립신 EDTA를 우물에 넣고 접시를 부드럽게 흔들어 트립신 EDTA로 우물의 전체 표면을 덮고 실온에서 1 분 반 동안 배양하십시오. 신선한 예온 성장 매체의 1 밀리리터를 추가하여 반응을 담급니다. 파이펫은 약 5배 아래로 내려가 면으로부터 세포를 세척하고 세포가 현탁액에 있는지 확인합니다.
셀 서스펜션을 15 밀리리터 튜브에 놓고, P1000 파이펫으로 액체의 80~90%를 부드럽게 제거하여 300배 G.에서 3분간 탁상 원심분리기에서 셀을 회전시다. 미리 따뜻진 성장 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 서스펜션을 부드럽게 세타게 합니다. 펠릿의 펠릿 또는 큰 조각이 더 이상 보이지 않고 세포가 단일 세포 현탁액에 있는지 확인합니다.
자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하려면, 실행 가능한 세포를 검출하기 위해 trypan blue와 1 대 1로 일시 중단 된 세포의 10 마이크로 리터 알리쿼트를 혼합합니다. 1분 동안 배양하고, 파이펫 10 마이크로리터의 용액을 계산 슬라이드에 제공합니다. 카운트 슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 삽입하여 적절한 설정을 사용하여 셀을 계산합니다.
성장 배지와 DMSO를 결합하여 10%DMSO의 최종 농도를 확보하여 동결 매체를 준비한다. 펠릿은 6 개의 웰 플레이트의 80 ~ 90 %의 컨실수 우물에서 준비해야합니다. 동결 매체의 하나 반 밀리리터에 펠릿을 다시 중단.
각각 2개의 분리된 극저온에 약 750마이크로리터의 세포 현탁액을 놓습니다. 세포가 세포 활력을 유지하기 위해 천천히 얼도록 극저온 냉동 용기에 바이알을 놓습니다. 즉시 영하 80도에 놓습니다.
냉동 된 세포를 해동하려면, 사용될 각 우물에서 예온 성장 배지의 두 밀리리터를 포함하는 여섯 개의 우물 판을 준비합니다. 필요한 때까지 섭씨 37도 및 이산화탄소 인큐베이터 5%로 플레이트를 유지합니다. 액체 질소에서 세포의 한 유리병을 가지고, 빠르게 세포를 해동따뜻한 물 목욕에 배치.
이 경우 2~3분정도 소요됩니다. 바이알의 용액이 해동하자마자 부드럽게 피펫위아래로 어플렛하여 용액을 균질화하고, 즉시 전체 용액을 6개의 웰 플레이트 중 한 웰에 놓습니다. 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 서 두 세 번 뒤로 흔들어 세포가 단일 층의 우물 표면에 분배할 수 있도록 돕습니다.
인큐베이터에 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소5%를 24~48시간 동안 배치합니다. 입증 된 대로 세포를 모니터링하고 통과합니다. DNA 추출의 대표적인 결과는 3개의 박쥐 종에서 표준 DNA 분석을 위해 표시됩니다.
단일 큰 대역은 각각의 추출에서 최소한의 단편화, 그리고 유사한 크기의 DNA 조각을 나타낸다. RNA 추출을 위한 성공의 일반적인 표시기는 RNA 무결성 수, 또는 RIN입니다, 전술 RNA에 있는 높은 질을 나타내는 8 위의 값을 가진. 여기에 4개의 다른 지방에서 샘플링된 신열대 박쥐 종의 13개의 다른 조직 모형에서 RNA 추출의 RIN 값이 있습니다.
안데스, 코스타리카 및 도미니카 공화국의 종에서 샘플링된 조직은 RNA 안정화 용액에 하룻밤 사이에 4도 떨어진 후 액체 질소에 직접 배치되었다. 아마존에서 종에서 샘플링 된 조직은 RNA 안정화 용액을 배치 한 후 약 1 주일 동안 액체 질소에 배치되었고, 4도에서 지속적으로 보관하였다. 이러한 경우에도 RIN 값은 RNA 안정화 용액에 즉시 배치되고 액체 질소로 직접 배치된 값과 유사했습니다.
조직 배양에 따라 박쥐 세포 배양은 플레이트 표면의 80 ~90 %를 커버하고 원래 형태를 유지해야합니다. 이는 분할에 대한 최적의 단계를 나타냅니다. 6개 이상의 구절 후에, 세포는 그들의 형태가 더 크고 더 길어지기 위하여 바꾸고, 세포는 노화를 입력합니다.
밝은 볼링 세포는 죽은 세포를 나타냅니다. 배양에 있는 세포는 DNA, RNA 및 단백질같이 물질의 재생 가능한 근원을 나타냅니다. 이러한 세포주는 동결 될 수 있습니다., 따라서 연구의 많은 년 동안 사용할 수 있는 자원을 제공.
이것은 1 차조직을 사용하여 도전할 게놈, 전사 및 기능적인 연구 결과를 허용합니다. 예를 들어, 세포는 세포 표현형에 대한 효과를 관찰하기 위해 유전자 또는 화학적으로 변형될 수 있다.
