쿠 BK와 Mustata RC는 의학 연구위원회 (MRC)가 지원하는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 및 앤더슨 - 롤프에서 헨리 데일 원정대에 의해 지원된다. 핑크 J는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 4 년 박사 - 프로그램에 의해 지원됩니다.

다음 프로토콜에 사용 된 모든 마우스는 무균 상태를 유지하고, 모든 절차는 영국 홈 오피스 규정에 따라 수행되었다. 1 준비 <ol><li> 사용에 앞서 미디어 1 시간을 준비 적어도 10 분 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 사전 따뜻한 (표 1 및 재료 목록 자세한 내용 참조). </li></ol> 2 배양 소장 (SI) Organoids 참고 : 달리 명시되지 않는 한, 모든 인큐베이션은 가습 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 수행됩니다. 살아있는 세포와 접촉 장비 및 시약은 멸균해야합니다. 사전 예열이 지하 매트릭스 (마트 리겔 또는 BME)이 시드 때 퍼지는에서 드랍 방지로 조직 배양 플레이트 것이 중요합니다. 또한, 지하 행렬은 항상 얼음에 보관해야합니다. -20 ° C와 해동에서 보관사용하기 전에 얼음에. <ol><li> 납골당을 분리 <ol><li> 소장의 격리를 위해 그 때, 국가 규칙 및 규정에 따라 마우스를 희생의 뒷면에 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 복부를 씻는다. 흉골에 사타구니에서 길이 중간 선 절개를 수행합니다. 먼저, 피부 후 피하 조직을 잘라. 위장 맹장에서 소장을 제거합니다. 십이지장, 소장 및 회장에서 분리 된 납골당은 organoid 문화에 사용할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 또는 마그네슘 (PBS0)없이 미리 냉각 된 인산염 완충 식염수와 격리 소장을 씻으십시오. </li><li> 3~5cm 긴 조각으로 조직을 절단하고 길이 방향으로 자르면 가위를 사용합니다. 집게를 사용하여 조직을 확산. </li><li> 커버 슬립을 사용하여 융모를 다 쳤어요. 주의, 너무 많은 힘이 찢어 조직의 원인이됩니다 및 단계는 다음의 지하실의 수율을 감소시킬 것이다. </li><li> 미리 냉각 된 PBS0 날기를 함유 50ml를 튜브에 조직을 이동시켜g 집게. 격렬 통해 조직 조각을 씻고 PBS0을 변경합니다. 2 ~ 3 배를 반복하거나 PBS0 덜 흐린 꺼질 때까지. </li><li> 튜브 롤러에 4 ° C에서 30 분 동안 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 PBS0의 30 ML을 포함하는 50 ML 튜브에서 조직을 품어. </li><li> 적극적으로 튜브를 흔들 5 mM의 EDTA와 PBS0의 30 ML을 포함하는 또 다른 50 ML 튜브에 조직을 전송합니다. (이전에 조직 포함)을 1 mM의 EDTA 용액 소낭 및 융모의 혼합물을 포함 할 것이다. 종종 융모의 높은 비율로 포함 분획이 organoids의 시드에 적합하지 않다. </li><li> 튜브 롤러에 4 ° C에서 1 시간 동안 조직을 더 품어. </li><li> 적극적으로 튜브를 흔들 깨끗한 50 ML 튜브에서 솔루션을 수집합니다. 지하실의 존재를 확인하고 광학 현미경에 의해 50 μL의 지하실을 계산하여, 예를 들어 수를 추정한다. 50-100 지하실을 구하여 1.5 ML의 t에 전송하는 데 필요한 양을 계산우베. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 스핀. 상층 액을 버리고 미리 예열 24 웰 플레이트에 지하 행렬의 50 μL에서 펠렛 종자를 재현 탁. 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 500 μL ENR 매체와 오버레이 (표 1 참조). 작은 원형 낭성 모양을 보여줍니다 organoids 파종 후와 구조 신진 다른 2-3일 후 약 24 시간이 표시됩니다. 3 일마다 신선한 ENR 미디어로 변경합니다. </li><li> 항로는 7 일마다 문화를 organoid. </li></ol></li><li> 계대 및 유지 Organoids <ol><li> 매 3 일 통과 한 미디어를 새로 고쳐 organoids 유지 : 루멘은 죽은 세포, 약 7 일마다 가득 채워져 5로 : 3 일. </li><li> 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브에 잘에서 전송합니다. </li><li> 기계적 피펫을 통해 organoids을 떼어 놓다pproximately 50 배 벌금 (예를 들어, 200 μL) 팁을 사용. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 스핀. </li><li> 뜨는을 취소하고 지하 행렬의 150 ~ 250 μL에 펠렛을 재현 탁. 씨앗 24 웰 플레이트 (/ 웰 지하 행렬의 50 μl를) 사전은 따뜻하게. 코팅 한 지하 행렬 상하 팁의 벽을 피펫 파종 전에. 피펫은 천천히 확산 지하 행렬을 방지하기 위해 잘 중간에 거품과 씨앗을 방지 할 수 있습니다. 이 웰의 중심에 지하 행렬의 돔을 얻는 것이 바람직하다. </li><li> 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 배양기에서 배양한다. 물론 당 500 μL의 ENR 미디어와 오버레이. </li></ol></li></ol> 3 전 감염 SI Organoids의 치료 NOTE도 1은 형질 도입 절차를 도시한다. <ol><li> ENRWntNic에 환율 ENR은 중간 (표 1 참조) t에 organoids 성장삼일 또는 그들이 낭성 형태를 채택 할 때까지 최소 자신의 매체. 니코틴 아미드 (닉) 문화 효율을 개선하면서 Wnt3a는 줄기와 Paneth 세포의 수를 증가시킨다. </li></ol> 4 바이러스 생산 <ol><li> 플래티넘-E 세포 중 하나 150mm의 요리는 감염에 필요한이. 종자 약 퓨로 마이신 (1 μg / ml) 및 블라스트 (10 μg / ㎖)의 존재 하에서 15 ~ 18 ㎖의 매체 (DMEM + 10 % FBS) 5 × 106 세포. 그들은 70~80%의 포화 상태에 도달 할 때 2 ~ 3 일 후에 세포를 형질. 퓨로 마이신없이 형질 전환 이전에 블라스트 DMEM + 10 % FBS에 매체를 변경합니다. </li><li> OPTI-MEM 1 ㎖를 포함하는 튜브를 분리하는 폴리에틸렌 이민 (PEI)의 레트로 바이러스 DNA 구조의 30 μg과 240 μl를 추가합니다. 혼합하고 5 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 이 솔루션을 수영장과 20 ~ 30 분 동안 실온에서 배양한다. 플래티넘-E 세포의 매체에 완전한 혼합물을 추가하고 조심스럽게 작은지면을 흔들전자는 DNA-PEI 단지의 동등한 분배를 보장합니다. </li><li> 밤새 형질 전환 혼합물과 백금-E 세포를 품어 매체에게 다음과 같은 일을 새로 고칩니다. 이일을 위해 새로운 매체의 세포를 유지합니다. </li><li> , 50 ML 팔콘 튜브 만 매체를 수집 12-16 시간 동안 4 ° C에서 8,000 XG에서 0.45 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 전달합니다. 상등액을 버리고 전달 매체의 250 μL에 펠렛을 재현 탁 (표 1 참조). </li></ol> 5 Organoid 조각 준비 <ol><li> 한 감염은 24 웰 플레이트에서 잘 하나가 필요합니다. 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 미세한 볼륨 팁 (예를 들어, 200 μL 팁) 피펫 (30-50x)를 통해 organoids를 기계적으로 방해하기 위해 사용합니다. 이 솔루션은 흐린 될 것입니다 더 전체 organoids는 볼 수 없습니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 원심 분리, 900 XG<html> . </li><li> 상층 액을 제거하고 세포 배양 등급 재조합 단백질 분해 효소 (예를 들어, TrypLE)의 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 37 ° C에서 품어. 배양 한 다음 프래그먼트 당 세포의 수를 세고, 광 현미경을 사용하여 organoid 단편의 크기를 확인한다. 5-10 세포를 포함하는 단편은 이상적이다. 단편의 대부분은 세포의 더 높은 번호를 포함하는 경우 배양 시간은 시간에 2 분으로 증가 될 수있다. </li><li> ENR 배지 500 μl를 첨가하여 분해 처리를 종료한다. </li><li> 실온에서 원심 분리기, 5 분 동안 900 XG. 상층 액을 제거하고 얼음 또는 4 ° C에서의 펠렛을 유지합니다. </li></ol> 6 레트로 바이러스 형질 도입 <ol><li> 48 웰 플레이트 잘 하나에서 (4.5부터) 레트로 바이러스 솔루션의 250 μL와 organoid 조각을 결합합니다. 1 ㎖의 pipetman 팁을 사용하여 천천히 피펫으로 가볍게 섞는다. </li><li> 파라 필름과 판을 밀봉합니다. </li></ol>전자 &quot;&gt; 7. Spinoculation 및 도금 <ol><li> 1 시간 동안, 32 ° C, 600 XG에서 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 파라 필름을 제거하고 6 시간 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. </li></ol> 감염 Organoid 조각의 8 시드 <ol><li> 5 분 동안 900 XG에 1.5 ML 튜브, 스핀에 우물에서 감염된 organoid 조각 및 전달 매체를 전송합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 멋진 5 분 동안 얼음에 펠렛을 포함하는 튜브를 넣어. 지하 매트릭스의 100 μl를 추가하고 위아래로 천천히 피펫 팅하여 펠렛을 재현 탁. </li><li> 새로운 24 웰 플레이트에 50 ㎕의 &#39;혼합 -cell 지하 매트릭스&#39;의 종자 삭제합니다. 지하 매트릭스 응고 될 때까지 5 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 우물에 폴리 브렌없이 전달 매체를 추가하고 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. </li></ol> 9 선택 <ol><li> 시작 자체미디어에 퓨로 마이신 (1 μg / ml)에 추가하여 2~3일 후 성귀. </li><li> 조각이 형성 organoids 퓨로 마이신 (1 μg / ml)로 보충 ENR 매체와 전달 매체를 대체하기 시작합니다. </li></ol> (10) 후 감염 SI Organoids의 치료 <ol><li> 문화에 따라 &quot;과 Passaging 및 organoids을 유지&quot;프로토콜 (2.2.1) organoids 형질. 1~2주 후 SI의 organoids는 신진 구조를 되 찾을 것입니다. </li><li> 1 μM의 농도로 작동 hydroxytamoxifen 4-(4-OHT)를 추가하여 miRNA의 또는 cDNA의 발현을 유도 신진 구조물의 모양에 따라. 이 단계가 Addgene (pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-eGFP는 - 순수하지 않아-WPRE (32702), pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-3xHA - 순수하지 않아-WPRE (32,703), 그리고 pMSCV에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우에만 유효합니다 차 돌려 - 순수하지 않아-DsRed의-GFP-miRNA가 (32704)) 먹어 치운다-ERT2을 표현 organoids. </li></ol> 감염 및 EXPR의 11 확인관심의 유전자의 ession / 억제 <ol><li> Addgene (32702, 32703 및 32704)에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우 전달 효율은 DsRed의 발현의 관찰에 의해 확인 될 수있다. 쿠 외 4에 예시 된 바와 같이 또한, 관심의 유전자의 발현 또는 억제는 GFP 또는 (유전자 녹다운을위한) 3xHA의 (유전자 과발현) 에피토프 및 qPCR에를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인 될 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> 높은 전달 효율 특정 부분이 중요한 달성하기 위해. 그들은 원형 낭성 형상을 채택 할 때까지 하나 ENRWntNic 매체와 organoids의 전처리이다. 이것은 줄기 세포의 수와 트랜스의 안정한 통합을 얻을뿐만 아니라 전달 과정의 전반 SI organoids의 생존율을 증가시켜 기회를 증가시킨다. 또 다른 매개 변수는 spinoculation 다음 배양 시간이다. 각각 가난한 전달 효율과 organoids의 가난한 생존, 너무 짧거나 너무 긴 배양 결과. 그것은 현저하게 형질 organoids의 비율을 증가시킨다하더라도 spinoculation 단계는 필수적인 것은 아니다. 마지막으로, 높은 역가의 바이러스가 성공적으로 전달하기위한 열쇠입니다. 이것은 패키징 세포주 및 바이러스의 종류에 의존한다. 백금 E 세포주 및 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV)의 조합은, organoids의 전달에 충분한 높은 역가를 생성하는 것으로 확인되었다. ve_content &quot;&gt; 다음은 성공적인 전달을 달성하는 데 도움이 될 수있는 문제 해결에 대한 도움말입니다. 포장 세포주의 형질이 좋지 않을 경우 첫째, 세포의 배양이 70 ~ 80 % 사이와의 배양 시간 있다는 것을 확인 풀링 PEI-DNA 혼합물을 20 ~ 30 분 사이입니다. 전달하는 동안 organoids의 생존은 매우 단편 크기에 따라 달라집니다. 너무 오래 트립신 미만 3 세포를 구성하는 조각의 대부분을 발생시켜 organoid 생존을 감소시킨다. 또 다른 요인은 Wnt에 조정 배지의 활성은, 활성이 너무 낮은 생존율을 증가시킬 수 5 μM의 작동 농도 CHIR99021의 첨가를 통해 증폭하는 경우. CHIR99021 증가 Wnt 신호의 결과로, GSK3 억제. 또한, Y-27362, 어느 방지 organoids 전에 전달에 단편 (1-10 세포를 포함)로 파쇄되기 때문에 anoikis는 organoid 생존 성을 향상시키기 위해 전달 매체에 첨가된다.로서는(60)는, 위에서 언급 한, spinoculation 후 배양 시간이 6 시간을 초과하지 않아야합니다. 나쁨 전달이 관찰되면 마지막으로 바이러스 역가 및 레트로 바이러스 벡터에 대한 인서트의 크기 제한에 영향을 미치는 전술 한 인자가 고려되어야한다. 최저의 효율성의 miRNA에 크게 의존한다. 효율이 표적 유전자의 miRNA와의 조합에 따라 변화하기 때문에 그것이 가장 잘 작동 자들을 식별하는 효율 화면을 수행 가치가있다. 이 기술은 organoid 시스템의 상피 현상으로 제한됩니다. 향후에는 각각 면역계로부터 유래 성분과 병원균 또는 재구성의 공존 배양을 통해 감염성 또는 면역 - 매개 질환을 연구 할 수있을 것이다. 또한, 레트로 바이러스는 단지 상대적으로 작은 크기의 삽입을 수행 할 수있다. 결과적으로, 자연적으로 발생하는 규제 영역은 제외해야하므로 형질 전환 유전자의 발현의 모방 할 수 없습니다내생 유전자. 전술 한 바와 같이, 최저 효율 및 표적 유전자의 miRNA에 의존한다. 적합한 최저 효율의 miRNA가 전혀 발견되지 않는 경우는 해당 특정 표적 유전자에 대한 기술의 사용을 제한 할 수있다. 이론적으로, organoids 세포주에 사용되는 모든 표준화 된 속임수 기술과 호환됩니다. 레트로 바이러스 전달 4를보고 할 수있는 첫 번째 방법이고, 최근 BAC (박테리아 인조 염색체) -transgenesis 5 사용할 수있게되었다. 2~3주의 총 발생 시간, 패키징 세포주에 바이러스 플라스미드의 형질 감염 후에, 그 트랜스 제닉 (Tg)가 마우스의 세대보다 훨씬 빠르다. 줄기 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포 분화의 모든 계통을 함유하면서 생체 토굴-융모 아키텍처를 유지함으로써, organoid 배양 시스템은 TG 동물과 이전에 사용 된 세포 배양 물 사이의 간극에 다리. <p클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 여기에 설명 된 프로토콜은 이득이를 통해 시험관 내에서 내배엽 상피 세포의 표현형 분석을 수행하는 방법 및 기능 연구의 loss-을 제공합니다. 이 TG 마우스의 최소한의 필요와 성체 줄기 세포 생물학의 생리 학적 관련 문의 사항에 답변을 제공하는 것이 가능합니다. 예를 들어, 조건부 녹아웃 마우스의 생성은 산기 치사 6 신생아 돌연변이로부터 유도 organoids를 사용함으로써 회피 될 수있다. 또한, 기술은 추가적인 최저의 7,8을 수행함으로써 paralogues의 역할을 연구하기 위해 이전에 설정된 녹아웃 마우스로부터 유도 organoids에 적용될 수있다. 소장 organoids의 설립에 따라, 원래 문화 프로토콜의 적응은 췌장, 간, 대장과 위 상피 9-11의 배양을 허용했다. 또한, 인간의 장내 organoids 종양 organoids는 기본 아덴, 정상적인 인간 생체 검사로부터 유도 된OMA 및 대장 암은 10 생검. 바이러스 감염 프로토콜은 쉽게 organoids 이러한 유형의 확장과 인간 유래 조직에서 기능 연구를 수행하는 전례없는 방법을 제공 할 수 있습니다. 종합적으로, 소장 organoids의 레트로 바이러스 전달은 줄기 세포 유지, 분화 및 세포 운명 결정뿐만 아니라, 세포 신호 및 세포 - 세포 상호 작용을 조사하는 유용한 자원이다.

하이 스루풋 기능 유전학 전류 기초 과학 및 의학 향상시키기 위해, 우리 몸의 생물학적 이해를 높일 필요가있다. 마우스 유전학은 시간 소모적이고 비용이 모두 있지만, 생체 내에서 유전자의 기능을 조사하는 금 표준이었다. 저렴하면서 다른 일반적인 선택되는 세포주는, 높은 처리 용량을 가지고있다. 그러나, 이들이 생체 내에서 본 적절한 미세 환경함으로써 생리적 반응을 재현하는 그들의 무능력에 의해 방해된다. 따라서, 비용 / 시간 효율적인 처리량 분석 동안 허용하기 쉬운 손잡이 모델 시스템에 대한 명백한 필요성이 존재 생체 내 유전자 전이 온도 (Tg) 마우스 실험에서 관찰 된 생리적 반응을 모방. 내배엽 상피를 들어 하나의 모델 시스템은 2009 년 1 나타났다. 지식 Lgr5 양성 장 줄기 세포로부터 얻은 발견 하였다 중에서도줄기 세포의 유지 보수에 필요한 세포 외 기질과 성장 요인에 대응하는 틈새 시장에 대한 정보를 제공합니다. 그것은 또한 organoids 2로 알려진 &#39;미니 용기&#39;를 구축 할 가능하게되었다이 정보를 활용. 최근 organoids가 &#39;enteroids&#39;라고합니다 체외 문화에 대한 공감대 명명법은 세를 제안했다. 세포주와 마찬가지로, organoids는 끊임없이 확장 및 리간드 및 억제제로 처리하기 쉽다. 그러나, 대신에 이차원 인의 이들은 입체 자기 조직화 토굴-융모 조직을 유지하는 구조뿐만 아니라 줄기 세포 및 소장 (SI)의 분화 된 세포 계통이다. Organoids는 내강 영역을 둘러싸는 상피 세포의 단일 층으로 구성. 신진 돌출 구조는 줄기 세포 구획을 포함하는 작은 창자 지하실에 대응한다. 그들은 MI로서 신진 구조의 선단부터 출발 전구 세포는 분화말기 분화 세포가 루멘으로 발산하는 상피 향해 쇠 격자. 세포주에 비해,이 시스템은 생체 더 밀접 정상적인 생리학을 되풀이하기 때문에 소장 상피위한 유망한 모델 시스템이다. 레트로 바이러스 형질 도입이 동영상 프로토콜에서는이 신규 organoid 배양 시스템에서 생체 외 유전자 기능 연구를 가능하게하는 방법을 제시한다. 우리는 단계별 방식으로 문화를 organoid 설명함으로써 시작하고, 전달 절차에 의해 다음에 레트로 바이러스의 생성을 보여줌으로써 계속합니다. 마지막으로, 문제 해결을위한 추가 조언 섹션이있다. 이 기술의 장점은 장내 상피 항상성, 세포 운명 결정 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 라이브 영상 또는 약물 스크리닝과 결합 될 수 있다는 것이다. 때문에 자신의 간단한 구조와 빠른 회전율로, organoids 이상적인 모델들 대표성체 줄기 세포 생물학 연구를위한 ystem. 또한 레트로 바이러스 전달은 미리 설정된 트랜스 제닉 마우스뿐만 아니라 인간 환자로부터 유도 된 시료 organoids에 적용될 수있다. 에 노크 노크 아웃 방식은 인간에게 확장 할 수 없기 때문에, 인간의 SI의 organoids는 매력적인 대안을 구성한다. 요약하면, 레트로 바이러스 전달을 통해 유전자 조작은 인간 유래의 조직에서 연구에 새로운 길을 여는 동안하여 마우스 유전학과 세포 라인을 보완, 쥐 또는 인간의 조직 샘플에서 파생 된 소장 organoids의 표현형 분석을 할 수 있습니다. 레트로 바이러스 형질 도입은 이득이 가능하고 기능 상실 연구 organoid 배양 시스템 (4)에서 수행된다. 이것은 세 루피 (감소, 정제 및 교체)에 따른하면서 유전자 기능, 성체 줄기 세포 생물학 및 질병을 조사하는 귀중한 자원한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5 양성 줄기 세포가 중요한 성장을 보충 할 수있는 것은 EGF, 개가 밀, 문화가 체외에서 차 3D 상피 구조를 끊임없이 확장 우리를 할 수 있습니다 R-Spondin을 요인. 두도 organoids라는이 &#39;미니 용기&#39;의 구조 및 생리 학적 특성은 밀접하게 자신의 생체와 비슷합니다. 이것은 그들이 소장 상피 세포에 대한 매력적인 모델 시스템 있습니다. 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전자의 기능은 현재 조건부 유전자 과발현 또는 최저 의해 수행 될 수있다. 이 동영상은 organoid 문화의 절차, 레트로 바이러스의 생성, 시험 관내에서 소장 상피 세포의 표현형 분석을 지원하기 위해 organoids의 레트로 바이러스 전달을 보여줍니다. 레트로 바이러스 매개 유전자 발현과 함께이 신규의 Organotypic 모델 시스템 costl의 필요없이 시험 관내에서 유전자 기능을 신속하게 분석하기위한 유용한 도구를 제공한다형질 전환 동물에 대한 y를 시간이 많이 소요되는 세대.

Organoids 중앙 루멘 인해 죽은 세포 (그림 2)의 존재에 어두운 때 분할 할 준비가 된 것입니다. 전처리 organoids 2 ~ 3 일 후에 라운드 낭성 형태 (그림 3)을 채택해야한다. 이것은 안정한 통합을 얻는 가능성을 향상 줄기 세포의 수를 증가시킨다. 바이러스 펠릿의 크기로 인해 펠렛 크기로 세포 파편의 변화에​​ 기여, 바이러스 상청액 다음 원심 분리 가능성을 변할 수있다. 전달 효율에 명확한 상관 관계가 관찰되지 않았다. 사람 안정적인 통합이 남아하면서 선택 과정 동안 비 형질 organoids는 죽을 것이다. MSCV-eGFP는 레트로 바이러스에서 형광 단백질 (그림 4) 전달 다음 2~3일 내 낭성 형태를 가지고 생존 organoids에서 유래 세포에서 관찰 할 수있다. <img alt<html> = &quot;그림 1&quot;FO : 콘텐츠 너비 = &quot;6 인치&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 51,765 / 51765fig1highres.jpg&quot;너비 = &quot;600&quot;/&gt; 그림 1 레트로 바이러스 전달 절차의 개략도. 이전 감염 organoids에 대한 사전 처리가 낭성 구조 (1 단계)을 채택 할 때까지 ENRWntNic을 사용하고 있습니다. 백금-E 세포 패키징 세포주로 사용하고, 그들은 70-80%의 포화 상태에 도달 할 때까지 배양된다. 그 후 그것들은 PEI를 사용하여 레트로 바이러스 구축물로 형질 감염된다. 바이러스는 이일 이상 (2 단계) 수확. Organoids 1-10 세포 (단계 3)를 포함하는 단편을 수득 트립신 처리하고, (단계 4)를 감염. 안정적인 통합 (7 단계)를 수행 할 수 있습니다와 spinoculation를 수행하면 감염 효율 (5 단계) 증가, 감염된 organoid 조각이 긍정적 인 클론 (6 단계) 2 ~ 3 일 후에 선택을 씨앗을 품고있다. 1765fig2highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 문화 4-6 일 후에 organoids의 2 대표 이미지. 루멘은 죽은 세포로 가득 어두워 표시하고있다. 이 단계에서 Organoids는 계대 할 준비가 된 것입니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> 3~4일에 대한 ENRWntNic 미디어에서 배양 소장 organoids의 그림 3 대표 이미지. organoids는 낭성 형태를 채택한다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> 소장 organoids의 그림 4 대표 이미지 (a)는 바이러스 성 유전자 발현 (B, eGFP는)을 보여 그. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ADVAnced DMEM / F12 + + + </td></tr><tr><td colspan="2"> 사주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 </td><td> 500 ml의 </td></tr><tr><td> Glutamax의 100 배 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 헤 페스 한 M </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 항생제의 100 배 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic 매체 (20 ㎖ 용) </td></tr><tr><td colspan="2"> 이주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 + + + </td><td> 7.2 ml의 </td></tr><tr><td> B27 보충제 (50 배) </td><td> 400 μL </td></tr><tr><td> N2 영양 (100 배) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> N-아세틸 시스테인 (500 밀리미터) </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> 마우스 EGF (500 μg / ㎖) </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> 마우스 개가 밀 (100 μg / mL)에서 세척 하였다 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> R-Spondin의 conditioned 매체 </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> Wnt3a 조정 배지 </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 니코틴 아미드 (1 M) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td colspan="2"> 전달 매체 (20 ㎖ 용) </td></tr><tr><td colspan="2"> 신선한 준비 </td></tr><tr><td> ENRWntNic 매체 </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 μM) </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> 폴리 브렌 (8 μg / ㎖) </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR 매체 (20 ㎖ 용) </td></tr><tr><td colspan="2"> 사주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 + + + </td><td> 17.4 ML </td></tr><tr><td> B27 보충제 (50 배) </td><td> 400 μL </td></tr><tr><td> N2 영양 (100 배) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> N-아세틸 시스테인 (500 밀리미터) </td><td> 50 μL </TD&gt; </tr><tr><td> 마우스 EGF (500 μg / ㎖) </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> 마우스 개가 밀 (100 μg / mL)에서 세척 하였다 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td> R-Spondin 조정 배지 </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 플래티넘-E 세포에 대한 미디어 (500 ml의 경우) </td></tr><tr><td colspan="2"> 12 주 4 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449.45 ML </td></tr><tr><td> 태아 혈청 (FBS) </td><td> 50 ML </td></tr><tr><td> 퓨로 마이신 (1 μg / ㎖) </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> 블라스트 (10 μg / ㎖) </td><td> 500 μL </td></tr></tbody></table> 플래티넘-E 세포에 대한 고급 DMEM / F12 + + +, ENRWntNic 매체, 전달 매체, ENR 매체와 매체에 대한 표 1 미디어 조성.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다 모델 시스템.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

a-video-protocol-retroviral-infection-primary-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Biology

29.5K 조회수.  University of Cambridge.  이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다 모델 시스템. 

비디오: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

연구

생물학

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

대사 프로파일의 실시간 분석<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...