이 프로토콜은 골관절염 연구를 위한 임상적으로 관련있는 모형으로 1 차적인 인간 조직의 사용을 격려합니다. 이 조직에 있는 유전자 발현 및 조직학 분석을 능력을 발휘하는 것은 새로운 기계론통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술은 인간의 무릎 관절 구성 요소의 식별 및 처리를위한 방법을 표준화한다.
그것은 다운스트림 유전자 발현 분석약에 대한 요구 사항을 충족하는 고품질 RNA의 추출을 가능하게 합니다. 병들게 된 관절 조직으로부터 고품질의 RNA를 얻는 것은 어렵기 때문에 모든 것을 깨끗하고 시원하게 유지하는 것과 같은 겉보기에 사소한 단계의 중요성을 과소평가해서는 안됩니다. 절차를 시연하는 것은 토마스 윌슨, 연구 동료와 나딥 카우르, 내 실험실에서 박사 후 동료가 될 것입니다.
연골, 뼈, 반월 상 연골 및 연조직을 포함한 단단한 조직을 식별하는 것으로 시작, 인프라 슬개골 지방 패드를 포함, 전방 십자 인대, synovium 및 광대 한 내측 근막 크기의 차이에 따라 표본에서 경사 근육, 모양, 색상과 질감. 각 조직을 세 부분으로 잘라냅니다. 멸균 PBS로 조직 섹션을 헹구어 잔류물이나 이물질을 제거합니다.
RNA 추출을 위해, 대략 1 2 밀리미터 큐브로 3개의 조직 단면도의 각각을 잘라. 작은 조각을 2 밀리리터 냉동 고리 바이알로 옮기. 캡을 단단히 고정한 후 액체 질소에 30초 동안 잠근 다음 유리병을 영하 80도냉동고로 옮겨 장기 보관을 위해 바이알을 동결하고 모든 조직에 대해 이 절차를 반복합니다.
박격포와 페슬을 사용하여 단단한 조직을 균질화합니다. 균질화하기 전에, 해동에서 견본을 방지하기 위하여 액체 질소를 사용하여 모르타르, 유봉 및 주걱을 식힙니다. 한 번에 하나의 샘플만 처리합니다.
차가운 주걱을 사용하여 티슈 샘플을 박격포로 옮춥니다. 조직의 상단에 액체 질소를 붓습니다. 액체 질소가 증발 한 후 유봉으로 조직을 분쇄하십시오.
미세 조직 분말을 얻기 위해 조직을 연삭하는 동안 반복적으로 액체 질소를 추가합니다. 미세 조직 분말을 액체 질소에 30초 동안 침수하여 미리 냉각된 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다. 각 튜브에 얼음 냉산 구니디늄 페놀 용액 1밀리리터를 넣고 20분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다.
다른 단단한 조직을 균질화하기 전에 박격포, 유봉 및 주걱을 70 %의 에탄올로 철저히 청소한 다음 RNase 데온타민제로 다음 DEPC 처리 된 물을 냅니다. 박격포, 유봉, 주걱을 70%에 탄올에 담근 다음, 깨끗하고 보풀이 없는 조직으로 잔류 액체를 닦아냅니다. 조직 균질화제를 사용하여 연조직을 균질화한다.
균질제소의 경우, 세척당 70%에탄올과 RNase 데온타미넌트의 튜브를 세척당 30초 동안 실행하여 프로브를 세척한 다음 DEPC 처리물로 세척한 다음 각각 70%에탄올을 추가로 30초 간 세척합니다. 깨끗하고 보풀이 없는 티슈로 잔류 액체를 닦아냅니다. 산 과니디늄 페놀 용액 1밀리리터를 사전 표지된 5밀리리터 라운드 하단 튜브에 추가하고 조직 샘플을 튜브로 옮겨 넣습니다.
절차 전반에 걸쳐 얼음에 튜브를 놓고 최대 5 개의 32 펄스 또는 조직이 시각적으로 용해 될 때까지 조직을 균질화하십시오. 모든 조직 샘플이 처리될 때까지 얼음에 균질화된 조직을 배양합니다. 다음 조직 샘플을 처리하기 전에 균질화제를 소독하고 청소하십시오.
멸균 집게를 사용하여 프로브의 치아에 존재하는 모든 조직 덩어리를 제거하십시오. 얼음에 있는 모든 균질화 조직을 추가로 20분 동안 배양한 다음, 사전 표지된 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 조직 샘플을 옮춥니다. 골관절염 환자로부터 얻은 7개의 유일한 인간 무릎 관절 조직은 외과 적 제거의 4 시간 안에 처리되었습니다.
조직은 시각적으로 확인되고 H&E 조직학적 염색에 의해 확인되었습니다. H&E는 단단한 조직 단면도, 관절 연골, 부전건조뼈 및 반월 상연연액을 6배 배율 및 40배 배율로 시각화했습니다. 마찬가지로, H&E 염색 연조직 섹션, 인프라 슬래머 지방 패드, 전방 십자 인대, synovium 및 vastus 내측 경사 근육6 배율에서 다음 40 배율에 시각화 되었다.
추출된 RNA의 품질 평가는 무결성, 수율 및 순도뿐만 아니라 낮은 품질의 샘플에 기반한 고품질 샘플의 존재를 나타내었으며, 이는 최적화된 방법을 사용했음에도 불구하고 질병 심각도와 같은 외부 요인이 동일한 환자로부터 다른 조직에 걸쳐 RNA 품질에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 각 조직 모형의 정확한 식별은 특히 1 차적인 질병 조직의 상당한 이질성을 감안할 때, 환자 견본의 내및 를 통해 조직 간 비교를 가능하게 하기 위하여 필요합니다. 시퀀싱 기술은 빠르게 진화하고 있으며 고품질 RNA의 격리는 골관절염과 같은 복잡하고 만성 질환에서 기본 조직 별 메커니즘을 해명하기 위해 이러한 기술을 사용하는 데 중요한 전제 조건입니다.
